编译：永稷，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读土壤栖居真菌利用植物根系释放的化学信号来引导菌丝向寄主植物方向进行生长。是否其他土壤微生物也能够利用这种能力发挥其有益作用仍未可知。
本研究表明内生根际细菌—水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）通过PH介导的趋化性来定居在侵染根系的病原真菌尖孢镰刀菌菌丝体上，并利用他们作为通道来有效的到达并定殖在植物根系。根际的R.aquatilis所分泌的葡萄糖酸导致的酸化会抑制尖孢镰刀菌诱导的致病机制，从而抑制病原真菌的侵染。对葡萄糖酸介导的酸化进行基因敲除和生化抑制会抵消R.aquatilis的生防活性并恢复病原真菌的侵染。这些研究表明细菌内生菌能够挟持土壤中病原真菌的菌丝来优先到达植物根系，从而保护寄主寄主不被侵染。
原名：A bacterial endophyte exploits chemotropism of a fungal pathogen for plant colonization通讯作者：Antonio Di Pietro & David Turrà通讯作者单位：西班牙科尔多瓦科尔多瓦大学国际农业食品中心
为了对菌株Ra36和尖孢镰刀菌之间的互作进行详细的研究，本研究选用一株已进行全基因组测序的番茄枯萎病病原菌。同时，对菌株Ra36进行RFP标记，有助于对细菌进行显微镜观察。首先要证明菌株Ra36能否保护植物不被镰刀菌所侵染。结果表明，无论在营养基质、无菌及有菌自然土中，与只接病原菌的处理相比，对植物根系先进行Ra36菌株接种再接种尖孢镰刀菌的处理，植株存活率更高，病原真菌的生物量更低（图1a, b, f）。菌株Ra36对尖孢镰刀菌的抑制作用具有浓度效应，并随着细菌接种体浓度的增大而增加(图1a)。荧光显微镜结合qPCR及电镜实验，发现菌株Ra36存在于植物根系皮层及维管束中，说明菌株Ra36能够成功定殖在番茄根系(图1c)。当单独接种菌株Ra36时，Ra36不会对番茄植物造成任何毒性(图1a)。由此可见，菌株Ra36可作为一种番茄内生细菌，保护植物不被尖孢镰刀菌所侵染。图1 菌株Ra36抑制尖孢镰刀菌毒力。（a）菌株Ra36不同浓度对尖孢镰刀菌抑制作用。（b）菌株Ra36分泌葡萄糖酸对尖孢镰刀菌的抑制作用（c）菌株Ra36及尖孢镰刀菌在番茄根系的定殖电镜图。（d）皿内不同PH条件下，菌株Ra36对尖孢镰刀菌入侵生长的抑制作用。（e）番茄果实上，菌株Ra36对尖孢镰刀菌入侵生长的抑制作用。（f）有菌/无菌自然土中菌株Ra36分泌葡萄糖酸对尖孢镰刀菌入侵生长的抑制作用。
2 菌株Ra36通过分泌葡萄糖酸抑制病原真菌的毒力为了进一步明确菌株Ra36是如何抑制尖孢镰刀菌侵染的，本研究对菌株Ra36对尖孢镰刀菌菌丝生长的直接抑制作用进行测定。不同培养基共接种实验均表明Ra36不能对尖孢镰刀菌菌丝生长和菌落发育产生抑制作用。进一步对菌株Ra36对尖孢镰刀菌已知毒力机制（例如：对植物根系的趋化作用、对植物根系表面的附着作用以及穿透细胞质膜入侵植物组织进行的入侵性菌丝生长）的靶向抑制作用进行研究。研究发现提前接种Ra36菌株不会影响菌丝响应番茄根系分泌物的趋化性生长，但是菌丝网络的形成以及对根系的附着显著降低。此外，接种菌株Ra36也会阻碍尖孢镰刀菌通过细胞质膜对番茄果实组织的入侵(Fig. 1d, e)。由此可见， Ra36菌株能够对尖孢镰刀菌菌丝网络形成、根系附着和入侵性生长三个关键毒力机制产生抑制作用。先前研究表明这些毒力机制会在高PH条件下被激活，低PH条件下被抑制。此外，研究表明尖孢镰刀菌所诱导的寄主植物组织的碱化会增加其侵染潜力。本研究发现菌株Ra36对尖孢镰刀菌入侵性生长和致病性的抑制作用会在调控PH到7.0时消失。在不接细菌Ra36的条件下，调节PH到5.0时，会对尖孢镰刀菌产生抑制作用(图1d)。这些结果表明菌株Ra36对真菌毒力功能的抑制活性与外部PH相关。研究发现，无论接种尖孢镰刀菌与否，接种菌株Ra36都使得培养皿、无菌土和有菌土体系酸化(图2a–e)。正如先前的报道，尖孢镰刀菌在植物根系的生长会激发显著的碱化。然而，该现象会在接种菌株Ra36后得到急剧的减弱(图2c, d)。菌株Ra36是如何对胞外基质进行酸化？先前研究报道称，根系定殖细菌会分泌有机酸，主要是葡萄糖酸，来降低根际的PH，从而有助于无机磷和微量元素的溶解，进而促进植物生长。有益菌假单胞菌产生的葡萄糖酸介导的酸化会调控植物根际免疫响应。本研究测定了接种菌株Ra36后培养基及土壤中葡萄糖酸的积累(图2d, e)。培养基中葡萄糖酸的浓度达到了40 mM，超过之前在其他根际细菌中的报道。进一步对菌株Ra36所介导的酸化是否会抑制尖孢镰刀菌的毒力功能和其对植物的侵染进行研究。为此，构建了能够将D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸的葡萄糖脱氢酶突变体。与野生型相比，Ra36 gcd突变体无法对培养基或者有无尖孢镰刀菌及番茄植株的土壤产生酸化。重要的是，菌株Ra36 gcd突变体不能对尖孢镰刀菌菌丝入侵、根系附着、包膜穿透以及对番茄果实的入侵产生抑制作用。此外，这些突变体与野生型相比，在基质、有菌及无菌体系中对番茄枯萎病的防效也显著降低(图2a–e)。重要的是，葡萄糖酸对于菌株Ra36的内生性生长所必须的，因为突变体菌株在植物根系的定殖效率于野生型一致(图1d, e)。此外，葡萄糖酸在基质、无菌及有菌体系中对尖孢镰刀菌菌丝的生长没有显著的抑制作用(图1b, f)。综上所述，这些结果表明菌株Ra36通过分泌葡萄糖酸使得番茄植株根系酸化，进而逆转有尖孢镰刀菌所引起的根系碱化，达到抑制真菌毒力功能和侵染植物的作用。图2 菌株Ra36分泌葡萄糖酸使得胞外环境酸化（a）菌株Ra36使得胞外环境酸化。（b）菌株Ra36分泌葡萄糖酸酸化随尖孢镰刀菌菌丝扩增（c）菌株Ra36对尖孢镰刀菌在番茄根系碱化作用的逆转。（d）水培条件下，番茄根系葡萄糖酸的定量检测。（e）有菌核无菌土体系中，番茄根系葡萄糖酸的定量检测。
3 菌株Ra36对尖孢镰刀菌菌丝呈现出趋化性
在细胞膜穿透实验中，菌株Ra36细胞会在真菌菌落下显著积累。由于R. aquatilis会“搭乘”菌丝进行移动，因此假设菌株Ra36会对尖孢镰刀菌具有趋化作用。为验证该假设，将2 µl RFP标记的菌株Ra36和GFP标记的孢子滴加在软琼脂糖载玻片上，两株菌间隔5 mm。30 min后，大多数Ra36细胞会在朝向尖孢镰刀菌的方向进行积累并移动(图3a)。紧接着，采用标准的毛细管法来对趋化性进行定量测定。发现菌株Ra36会对糖（半乳糖和葡萄糖）和氨基酸（色氨酸和谷氨酰胺）以及番茄植株及尖孢镰刀菌菌丝所产生的分泌物产生趋化作用(图3b, c)。重要的是，菌株Ra36鞭毛蛋白基因fliC突变体对这些物质物趋化响应。更进一步表明接种尖孢镰刀菌后高PH番茄根系获得的分泌物会激发更显著而对趋化响应。有趣地是，当人为的将PH从8.0降低到5.8后，菌株对尖孢镰刀菌分泌物的趋化响应消失，当人为将PH从5.8提升到8.0时，菌株会对收集到的尖孢镰刀菌分泌物产生趋化响应(图 3c, d)。与此一致的是，菌株Ra36会对PH为8.0基质产生正向趋化作用，并维持PH为5.8，而对PH为4.0的基质产生负趋化作用。这种正向和负向趋化响应在gcd突变体中仍然存在，但在fliC突变体中消失(图3e)。综上所述，这些结果表明菌株Ra36会对尖孢镰刀菌生长的土壤及番茄根际所形成的碱性梯度产生趋化响应。
图3 菌株Ra36对尖孢镰刀菌的碱性梯度呈现出趋化性。（a）菌株Ra36对尖孢镰刀菌的趋化作用。（b-e）毛细管中，菌株Ra36及其突变株对番茄根系分泌物、尖孢镰刀菌分泌物及PH所表现出的趋化性。
4 菌株Ra36利用尖孢镰刀菌菌丝的趋化作用进行根系定殖细菌的趋化作用取决于细菌在连续液相中的自由移动，而该条件在复杂的土壤环境中却很难满足。众所周知，真菌菌丝可作为促进鞭毛细菌在土壤中移动和获取营养的“通道”，从而提高细菌对环境的适应性。本研究观察到，菌株Ra36会随着尖孢镰刀菌菌丝表面的液相进行移动，并在菌丝顶端区域聚集(图4a)。为了验证尖孢镰刀菌菌丝对菌株Ra36在空气界面运动性的影响，将细菌和真菌分别或者共同接种在培养基中宽为5 mm的凹槽的一端，另一端防治番茄根系。不出所料，尖孢镰刀菌会用菌丝体跨国凹槽定殖在番茄根系，而菌株Ra36无法定殖(图4b)。但是，与尖孢镰刀菌共接种的菌株Ra36会跨过障碍随着真菌菌丝周围的液体膜到达植物根系。同时，菌株Ra36会随着尖孢镰刀菌到达根系而在菌丝尖端大量聚集(图4c, d)。一旦与植物根系相连接，菌株Ra36就能快速地从菌丝移动到根系，随着菌株在根系表面的定殖，菌丝体上的菌株逐渐减少。毛细管趋化实验发现菌株Ra36对番茄根系和尖孢镰刀菌菌丝分泌物表现出相反的浓度效应，对番茄根系分泌物的趋化性更强。综上所述，这些结果表明菌株Ra36利用尖孢镰刀菌菌丝高效地通过土壤进行移动，并定殖在寄主植物根系。存在一种借用病原菌菌丝来通过空气界面的机制。据报道，尖孢镰刀菌菌丝会直接朝向番茄根系所释放的趋化物质进行生长。本研究发现菌株Ra36对尖孢镰刀菌对番茄根系和根系分泌物的趋化作用没用影响。故推测，菌株Rs36利用菌丝对植物的趋化作用，到达菌丝顶端，从而进行高效的定殖。为验证这一假设，野生型菌株Ra36或者鞭毛蛋白突变体菌株在接种和不接种尖孢镰刀菌条件下，距离番茄植株5 cm处点接种到土壤中。明显地，接种尖孢镰刀菌的土壤中菌株Ra36的生物量是不接种尖孢镰刀菌的10倍多，而鞭毛突变株没有该现象出现(图4e)。同时，与野生型菌株相比，鞭毛突变株接种到土壤中时对尖孢镰刀菌没有抑制作用，而当直接接种到根系时，会与野生菌株具有相似的防效。重要的是，在接种尖孢镰刀菌ste2突变体的土壤中，菌株Ra36的生物量并没有增加。可见，菌株Ra36可通过菌丝的能力来感受并向番茄根系移动，从而增加其在寄主植物中的定殖效率。图4 菌株Ra36利用尖孢镰刀菌菌丝趋化性优先达到植物根系。（a）菌株Ra36随尖孢镰刀菌菌丝移动，并在根际聚集。（b）菌株Ra36“搭乘”尖孢镰刀菌菌丝跨越障碍。（c,d）在番茄根系，菌株Ra36利用尖孢镰刀菌菌丝进行移动，并在番茄根系优先定殖。（e）菌株Ra36响应尖孢镰刀菌碱性毒力机制进行移动，优先定殖番茄根系，并通过分泌葡萄糖酸酸化环境来抑制尖孢镰刀菌的毒力。
综上所述，本研究揭示了土壤栖居细菌在寄主植物中获得优先生态位的一种未知机制。通过利用尖孢镰刀菌菌丝的趋化作用，菌株Ra36能够显著增加其在植物根系的定殖量。菌株Ra36对尖孢镰刀菌趋化作用的起始是由真菌菌丝所产生的碱性PH梯度所激发的。一旦细菌接触到真菌，就会子真菌菌丝上运动，在菌丝顶端聚集，利用真菌到达植物根系。在根际中，菌株Ra36会分泌大量的葡萄糖酸来导致胞外环境酸化，逆转尖孢镰刀菌的碱化毒力机制，有效的阻碍病原真菌的侵染。寄主碱化是病原真菌侵染寄主常见机制，而土壤细菌广泛具有酸化作用，这些发现说明植物根际乃至其他复杂环境中真菌-细菌发生交互作用具有广泛相关性。
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