Nat. Commun. | 上海交大黄丽钰课题组揭示SCFFBW7介导的Brg1降解抑制胃癌转移

一、成果短讯：

2018年9月3日，上海交通大学系统生物医学研究院黄丽钰课题组与哈佛医学院Dr. Wenyi Wei团队以及复旦大学附属中山医院孙益红团队合作在国际期刊NATURE COMMUNICATIONS 发表了题为“ SSCF^FBW7-mediated degradation of Brg1 suppresses gastric cancer metastasis”的研究成果，揭示了SWI/SNF家族核心亚基Brg1受泛素连接酶SCF^FBW7的泛素化降解调控机制并揭示FBW7-Brg1信号在胃癌转移中的作用。

原文题目及作者见上图

二、内容简介：

Brg1 / SMARCA4作为多组分SWI / SNF染色质重塑复合物的ATP酶和解旋酶催化亚基，在控制染色质结构和基因转录中起重要作用。然而，调节Brg1蛋白稳定性的上游信号传导途径及其对癌变产生的生理作用尚不清楚。研究结果表明Brg1是SCF^FBW7的泛素底物。我们发现CK1δ磷酸化Ser31 / Ser35残基处的Brg1，从而促进Brg1与FBW7的结合，导致泛素化介导的降解。与FBW7在人胃癌中的肿瘤抑制作用一致，我们发现人胃癌临床样本中FBW7和Brg1表达之间存在负相关，而且研究结果显示胃癌细胞中Brg1稳定存在抑制了E-钙粘蛋白的表达，从而促进了胃癌的转移。因此，这一先前未知的FBW7 / Brg1信号轴提供了在FBW7缺失的人胃癌中的靶向Brg1的分子基础和基本原理。

三、实验结果：

图1 FBW7负向调节Brg1的稳定性。a来自野生型（WT）和FBW7 - / - DLD1细胞的全细胞裂解物（WCL）的免疫印迹分析（IB）。b，c WT和FBW7 ^{- / -} DLD1细胞用20μg/ ml环己酰亚胺（CHX）处理。在指定的时间点，制备WCLs并用指定的抗体（b）进行IB分析。将相对Brg1强度标准化为Vinculin，然后归一化至t  = 0对照（c）。d来自WT和FBW7 ^−/−的WCL的IB分析用MG132（10μM）或DMSO处理DLD1细胞10小时。d IB分析源自用MG132（10μM）或DMSO处理10小时的WT和FBW7 ^{- / -} DLD1细胞的WCL。e IB分析感染了指示shRNA的慢病毒MKN45细胞衍生WCLs。f 对用指定的shRNA慢病毒感染的MKN45细胞衍生的WCL进行IB分析，并用20μg/ ml CHX处理指定的时间段。 将Brg1的相对强度标准化为Vinculin，然后归一化至t = 0对照（底部图）。g来自用Flag-Brg1转染的293T细胞的WCL和免疫沉淀（IP）的IB分析以及指示的Myc标记的Cullin家族成员的构建体。h 感染慢性病毒shRNA-Cullin1的MKN 45细胞来源WCL的IB分析。I 来自用Flag-Brg1与指定的FBW 7结构一起转染的293T细胞的WCLs和IPs的IB分析 。j 使用抗BRG1抗体（SC-17796，Cruz）进行的MKN45细胞中的共IP实验。小鼠IgG用作对照。k用指定的表达FBW7的慢病毒载体感染的FBW7 ^{- / -} DLD1细胞衍生的WCL的IB分析

图2 Brg1以CKIδ介导的磷酸化依赖性方式与FBW7相互作用。 a Brg1与FBW7识别的phospho-degron序列的序列比对。存在于Brg1中的推定的FBW7phospho-degron序列在不同物种中是保守的。 b IB分析源自用HA-FBW7转染的293T细胞的WCLs和IPs以及指示的Flag-Brg1构建体。 c IB分析显示在与CK1激酶体外孵育后HAFBW7与细菌纯化的GST-Brg1（1-104aa）蛋白的结合增强。 GST用作阴性对照。 d IB分析来自用HA-FBW7和Flag-Brg1转染的293T细胞的WCL和IP。如果需要，在IB分析前加入CK1抑制剂IC261（20μM）8小时。 DMSO用作阴性对照。 e IB分析源自用指定的慢病毒shRNA-CK1δ构建体感染的MKN45细胞的WCLs。f 在存在或不存在Myc-CK1δ的情况下，用指示的Flag-Brg1和HA-FBW7载体转染的293T细胞衍生的WCL的IB分析。 GFP用作阴性对照。g h用指定的Flag-Brg1构建体与HA-FBW7和Myc-CK1δ质粒一起转染 293T细胞。转染后20小时，将细胞接种于60-mm培养皿。再过20小时后，用20μg/ ml CHX处理细胞。I 1B分析了用Flag-Brg1和指定的HA-FBW7载体转染的293T细胞衍生的WCLs。如果有痕迹，MG132（10μM）处理10小时。J His tag pull-down和来自用指示的Flag-Brg1构建体与HA-FBW7，Myc-CK1δ和His-Ub质粒转染的293细胞的WCLs的IB分析。转染后20小时，细胞用MG132处理10小时，然后收集细胞。然后执行His tag pulldown实验。 Ni-NTA：镍 - 次氮基三乙酸，Ub：泛素

图3 Brg1表达与FBW7反向相关以控制胃癌进展。 a在400个肿瘤切片和成对的相邻非肿瘤组织中FBW7免疫组织化学（IHC）染色的结果。 b通过实时PCR检测FBW7和Brg1的mRNA表达。通过 t检验分析数据。 c，d在总（c）或不同TNM（肿瘤淋巴结转移）阶段（d）的肿瘤切片和成对的相邻非肿瘤组织中Brg1免疫组织化学染色的结果。通过t检验分析数据。 e高Brg1表达与胃癌淋巴结转移呈正相关。通过Spearman相关性测试分析它们的相关性。 f通过中山市队列胃癌患者的Kaplan-Meier分析检测Brg1表达与总生存期的关系。 g FBW7，Brg1和Ecadherin染色的代表性图像显示在连续的正常切片和远处转移性肿瘤切片中。比例尺，100μm。 h，i Brg1和FBW7水平（h），Brg1和E-钙粘蛋白水平（i）在400个连续肿瘤切片中的相关性，这些切片被半定量为高或低，并通过Spearman相关性检验进行分析

图4 Brg1在胃癌细胞中促进体外细胞迁移和体内转移。a来自用指定的慢病毒shRNA构建体感染的MKN45细胞的WCLs的IB分析。 b，c在transwell测定中用指定的慢病毒shRNA构建体感染的迁移的MKN45细胞的代表性图像（b）和（c）中迁移的细胞的定量。数据显示为三次独立实验的平均值±SD。 * p <0.05，t检验。比例尺，100μm。 d在划痕实验中用指定的慢病毒shRNA质粒转染的MKN45细胞的迁移。数据显示为三次独立实验的平均值±SD。 * p <0.05，** p <0.01，t检验。 e-g在用指定的慢病毒shRNA质粒尾静脉注射MKN45细胞（3×106）后2个月，在每只裸鼠（n = 5）的肺中形成的转移的代表性图像和统计学分析。比例尺，1毫米。h是用指定的Flag-Brg1构建体转染的AGS细胞衍生的全细胞裂解物的IB分析。 i，j在transwell测定中用指示的Flag-Brg1构建体转染的迁移的AGS细胞的代表性图像和迁移细胞的定量。数据显示为三次独立实验的平均值±SD。 * p <0.05，t检验。比例尺，100μm。 k在划痕实验中用指示的Flag-Brg1构建体转染的AGS细胞的迁移。数据显示为三次独立实验的平均值±SD。 * p <0.05，** p <0.01，t检验。 l-n尾静脉注射用指定Flag-Brg1质粒转染的AGS细胞（2×106）后2个月在每只裸鼠（n = 5）的肺中形成的转移的代表性图像和统计学分析。 * p <0.05，** p <0.01，学生t检验。比例尺，1毫米。

图5 Brg1通过驱动EMT转录程序促进胃癌的转移。a来自胃癌细胞系AGS的WCLs的IB分析。用指定的pTRIPZ-Brg1慢病毒载体感染AGS细胞，并用1μg/ ml嘌呤霉素作用72小时以消除未感染的细胞。然后，将100,300,1000,3000ng / ml多西环素（DOX）加入细胞另外24小时之后再用于IB分析。 b在存在或不存在DOX（1000ng / ml）的情况下，在pTRIPZ-Brg1 AGS细胞中进行实时PCR测定24小时。 * p <0.05，** p <0.01，t检验。 c AGS细胞中细胞形态的代表性图像。比例尺，100μm。 d IB分析源自用指定的慢病毒shRNA质粒感染的MKN45细胞的WCLs。 e在用指定的慢病毒shRNA质粒感染的MKN45细胞中进行实时PCR测定。 * p <0.05，** p <0.01，t检验。 f，g在用指定的慢病毒shRNA质粒感染的MKN45细胞中进行抗-Brg1抗体的ChIP测定。小鼠IgG用作阴性对照。 h，在用指定的Flag-Brg1构建体转染的AGS细胞中进行具有抗Flag抗体的ChIP测定。在该实验中使用小鼠IgG作为抗体对照。 j-l尾静脉注射用指定的慢病毒shRNA质粒转染的MKN45细胞（3×106 / 每个）后2个月在每只裸鼠（n = 5）的肺中形成的转移的代表性图像和统计学分析。溶解于二甲基亚砜和0.25ml磷酸盐缓冲盐水中的1毫克PFI3（SIGMA，SML0939）每周腹膜内注射3次。 * p <0.05，** p <0.01，t检验。比例尺，1毫米。

图6 FBW7抑制胃癌转移的推荐模型。 FBW7 / Brg1信号轴控制胃癌EMT变化并在胃癌转移中起关键作用

四、原文学习：