推荐：江舜尧
编译：Tracy An-q
编辑：马莉
CRISPR/Cas系统是从原核生物中发现的一种防御外源性遗传物质入侵的自身免疫机制，主要分为三种类型:Type I、TypeII和Type III。而常用的CRISPR/Cas9系统是由II型改造而来，具有核酸酶活性，并能够通过向导RNA的作用靶向性结合生物基因组任何区域的目的基因，进而实现对目标基因的编辑。该系统最早被开发并最成熟的是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)，它具有较高的切割活性和保真性，是目前研究最深入的Cas酶之一。它识别的序列需要临近3’端有一段序列，即PAM（protospaceradjacent motif）。经典的PAM是NGG，而非经典PAM序列是NAG（N指 A/T/C/G）。如何有效拓展 CRISPR- Cas9 核酸酶 PAM位点范围、实现对应 PAM 识别位点的高效及高特异基因组编辑，是 CRISPR- Cas9核酸酶在植物基因组编辑中广泛应用的关键所在。
近日，国际知名植物学期刊Molecular Plant同一天在线发表了中国学者对基因编辑PAM位点研究的三篇论文，分别由中国农业科学院植物保护研究所周焕斌研究员课题组，电子科技大学（成都）生命科学与技术学院张勇教授课题组以及中科院上海植物逆境生物学研究中心朱健康院士课题组完成。
中国农业科学院植物保护研究所周焕斌研究员课题组发表了题为“Cas9-NG greatly expands the targeting scope of genome-editingtoolkit by recognizing NG and other atypical PAMs in rice”的研究论文，作者将最近报道，在人类细胞基因组编辑中扩大了靶向空间Cas9-NG能够识别最小的NG PAM，对其在植物中进了研究。研究者以转基因水稻内源基因为靶点，对Cas9-NG对各种NGNPAMs的核酸酶活性进行了评估，发现Cas9-NG可以编辑所有活性受损的NGG、NGA、NGT和NGC位点，而基因编辑植株以单等位基因突变为主。进一步开发了cas9 - ng工程基编辑器，并用于生成OsBZR1功能增益植物，这是其他可用的cas9 -工程基编辑器无法做到的。此外，cas9 - ngbased转录激活因子能有效上调水稻内源靶基因的表达。此外，研究者还发现Cas9-NG可以识别除NGPAM外的NAC、NTG、NTT、NCG。这些结果表明，Cas9-NG大大扩展了基因组编辑工具的靶向范围，为植物的靶向基因组编辑、碱基编辑和基因组调控提供了广阔的应用前景。
电子科技大学（成都）生命科学与技术学院张勇教授课题组发表了题为“Improvingplant genome editing with high-fidelity xCas9 and non-canonical PAM-targetingCas9-NG”的研究论文，工程化的SpCas9（Streptococcuspyogenes Cas9）突变体，即xCas9和Cas9-NG，在改善靶向特异性和扩大靶向范围方面有巨大的潜力。在这项研究中，作者在模式植物水稻中评估了这些Cas9突变体。他们首先测试xCas9（xCas9-3.7，哺乳动物细胞中最有效的xCas9突变体），在所有16种可能的NGNPAM组合中进行重复的定向诱变。xCas9在经典NGGPAM位点上表现出与野生型Cas9（Cas9-WT）相当的编辑效率，而在非经典NGH（H= A，C，T）PAM位点具有有限的活性。通过rAPOBEC1和PmCDA1胞苷脱氨酶进行C-T碱基编辑，进一步证明了NGCPAM中xCas9的高编辑效率。对于不匹配的sgRNA，他们发现xCas9相比于Cas9-WT，靶向特异性有所改善。他们接下来测试了两种用于靶向NGNPAMs的Cas9-NG突变体（Cas9-NGv1和Cas9-NG），发现两种Cas9-NG突变体在许多非经典NGPAM位点有着更高的编辑效率，他们还在富含AT的PAM位点（如GAT，GAA和CAA）上实现了高效编辑，远远超过了xCas9。然而，Cas9-NG突变体却在经典NGGPAM位点显示出显著降低的活性。在稳定的转基因水稻品系中，他们还证明了Cas9-NG在编辑NGPAM位点时具有比Cas9-NGv1和xCas9高得多的编辑效率。为了扩大基础编辑范围，他们通过融合Cas9-NG切口酶（D10A）、PmCDA1和UGI，开发了一个高效的C- T基础编辑系统。
中科院上海植物逆境生物学研究中心朱健康院士课题组发表了题为“Genomeengineering in rice using Cas9 variants that recognize NG PAM sequences”的研究论文，研究者通过最近设计的两个可以更轻松的识别NGPAMs的SpCas9变体：xCas9和SpCas9-NG，并使用了稳定的转基因品系来评价xCas9和SpCas9-NG在水稻基因编辑和碱基编辑中的有效性。研究者发现xCas9可以有效地诱导水稻中NG和GATPAM序列的靶位点突变。但是，包含xCas9的基本编辑器无法编辑大多数测试的目标站点。SpCas9-NG在具有多种NGPAMs的位点表现出较强的编辑活性，而对NG之后的第三个核苷酸没有表现出任何偏好。此外，研究者还发现xCas9和SpCas9-ng在CGGPAM位点上比SpCas9具有更高的特异性。研究者证明，不同形式的含有SpCas9-NG基因编辑器，由于扩大了PAM位点的兼容性，因此可以有效地完成水稻基因工程工作。因此，研究者的工作产生了多用途的基因组工程工具，将显著扩大水稻和其他作物的基因编辑目标范围。
总之，研究者们对Cas9-NG通过识别水稻中的NG和其他非典型PAMs的研究，极大地扩展了基因编辑工具包的目标范围，为植物的靶向基因组编辑提供了广阔的应用前景。
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