科研| ADV SCI：重症肌无力患者微生物生态紊乱：来自肠道菌群和粪便代谢组学的证据

编译：晨曦，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

重症肌无力(MG)是一种破坏性的获得性自身免疫性疾病。新证据表明，肠道菌群在维持免疫系统稳态中起着关键作用。本研究发现MG患者与健康人群相比，肠道菌群紊乱，粪便代谢物亦发生变化，且MG严重程度不同患者中肠道菌群也有显著差异。38.75%的差异细菌与差异代谢物显著相关，且微生物标志物及其相关代谢物的组合能够100%准确地从健康人群中鉴别MG。为了研究肠道菌群紊乱是否可能导致MG的发生，用MG菌群(MMb)或健康菌群(HMb)定植无菌(GF)小鼠，构建模型，发现与HMb小鼠相比，MMb小鼠的运动能力明显受损，且表现出与MG相似的菌群特别与代谢紊乱，两种菌群共同定植可逆转MG菌群小鼠受损表型。这些数据共同证明肠道菌群组成和活性的紊乱可能与MG的发病机制有关。

论文ID

原名：Perturbed Microbial Ecology in Myasthenia Gravis: Evidence from the Gut Microbiome and Fecal Metabolome

译名：重症肌无力微生物生态学紊乱：来自肠道菌群和粪便代谢组学的证据

期刊：Advanced Science

IF：13.6

发表时间：2019.09

通讯作者：谢鹏，余刚，魏泓

作者单位：重庆医科大学第一附属医院神经内科，中山大学附属第一医院精密医学研究所 

实验设计

实验结果

1 MG患者肠道菌群多样性降低 

招募70个MG患者和74个健康人群，参与者具体信息如表1所示。两者之间无年龄和性别差异。采用16S rRNA测序，在144个粪便样本中检测到6778477高质量reads，读长平均431.7。这些reads通过97%序列相似性注释到895个OTU，771个OTU在两组中共有，50个为MG患者独有，74个OTU为健康人群独有。

表1 入组样本临床特征

接下来，比较两组样本的组内α-多样性指标包括物种丰富度（Chao，Ace）和均匀度（Shannon，Invsimpson）。发现不管是物种丰富度还是均匀度在两组样本之间均有差别。与健康人群相比，MG患者中Chao指数，Ace指数，Shannon指数及Invsimpson指数均降低（图1a），表明MG患者中α-多样性降低。

图1 MG患者肠道菌群特征

2微生物多样性作为诊断MG严重程度的新工具

为了研究α-多样性和MG严重程度的关系，根据定量重症肌无力（QMG）评分将MG患者分为三组，并比较它们之间的α-多样性。发现α-多样性的四个指数在三组中随QMG评分增高而降低（图1b），另外，有呼吸危象史（HRC）的MG患者中的Ace和Chao指数比无HRC患者低（图1c）。这些发现表明α-多样性和MG严重程度的关系，并指示肠道菌群多样性指数可能能够提供一种判断MG严重程度的新的临床工具。

3 MG患者比健康人群含有不同肠道菌群OTU

为探索MG是否与变化的菌群组成有关，分析了β-多样性。3D PCA分析表明MG患者中肠道菌群组成与健康人群存在显著差异（图1d）。聚类分析发现，两组中肠道菌群组成与年龄和性别无关，MG患者中肠道菌群组成与疾病亚型、药物治疗历史、乙酰胆碱受体(AchR)抗体状态均无关。这些表明整体菌群表型并不受其他潜在的混杂变量影响。

LEfSe分析发现80个不同的OTU可将MG患者于健康人群分开（图2a）。于健康人群相比，MG患者中有31个OUTs升高，主要为拟杆菌科（9 OTUs），毛螺菌科（9 OTUs），韦荣氏菌科（3 OTUs）和普雷沃氏菌科（3 OTUs）；46个OTUs降低，主要为毛螺菌科（23 OTUs），疣微菌科（8 OTUs），韦荣球菌科（3 OTUs），消化链球菌科，和梭菌科_1（3 OTUs）（图2c）。这80个不同的OTUs主要属于厚壁菌门（59/80, 73.75%), 拟杆菌门(14/80, 17.5%)和放线菌门 (3/80, 3.75%)。类似的，与健康人群相比，梭杆菌门和拟杆菌门升高，放线菌门降低。

图2 MG患者肠道微生物特征

4 MG患者粪便代谢组变化

粪便代谢组被认为肠道菌群功能的展示。我们发现MG患者粪便代谢组表型与HC显著不同，有30个代谢物是造成两者间差异的主要原因。与HC相比，MG中16个代谢物下降，14个代谢物上升。功能聚类分析显示，大多数差异表达的代谢物均参与氨基酸代谢(缬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸甘氨酸、甲基丙二酸、5‐氨基缬氨酸、d‐甘油酸、O‐琥珀酰高丝氨酸);核苷酸代谢(黄嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、甲基丙二酸、草酸)；以及微生物在不同环境中的代谢(d‐甘油酸、萘、儿茶酚、4‐硝基酚、草酸和黄嘌呤)（图2e）。

5 肠道微生物OTUs与MG代谢物的相关性及临床特点

相关性分析进一步探索了肠道菌群失调、粪便代谢组和MG临床证候关系。我们发现不同的OTUs与不同的代谢物质相关（图3），改变的细菌OTUs中有37.85%（31/80）与一系列代谢生物标志物显著相关。这些结果表明，MG同时具有肠道微生物组和粪便代谢组紊乱的特征。此外，我们发现一些肠道微生物OTUs与一些临床参数如性别、汉密尔顿焦虑量表(HAMA)、长期免疫治疗、持续时间、胸腺增生、以及已建立良好的乙酰胆碱受体(AchR)抗体等相关（图3）。令人惊讶的是，我们发现19个OTU与MG严重程度指标(QMG评分和呼吸危重史)高度相关(图3和图4a)。这些OTUs在科水平上主要属于毛螺菌科(6 OTUs)、韦荣球菌科(4 OTUs)和拟杆菌科(2 OTUs)（图4a）。

 

图3肠道微生物种类与粪便代谢物和临床指标的关系

6 一组微生物和代谢标记以100%的准确率识别MG

为了识别和量化我们新发现的MG中微生物和代谢生物标志物的潜在诊断能力，我们对31个OTU和8个显著相关的代谢物进行了二元逻辑回归分析。我们发现最重要的MG和HC之间的为4个OUTs， 它们分别为梭菌科_1 (OTU562)、毛螺菌科(OTU672)、韦荣球菌科(OTU723)和拟杆菌科 (OTU749)，以及6显著相关代谢物(亮氨酸,胞嘧啶,草酸,N-乙酰色氨酸，D-甘油酸和黄嘌呤)。这一标记物panel使鉴别MG与HC的准确率达到100%，显著高于单独的微生物或代谢标记鉴别结果（图4b）。

图4诊断MG的微生物和代谢标志物

7 MG菌群移植无菌小鼠诱导运动能力受损

为分析MG患者肠道菌群如何影响MG发展，开展菌群移植（FMT）试验（图5a）。在这个实验中，给无菌（GF）小鼠分别移植MG患者菌群（MMb），健康人群菌群（HMb），MMb与HMb共移植（CMb），然后用经典建模方法进行免疫实验。FMT后4周使用开放场测试(OFT) MMb是否影响MG相关的运动。一个MMb小鼠、一个HMb小鼠和一个CMb小鼠的典型运动轨迹如图5b所示。与HMb小鼠相比，MMb小鼠的总行走距离明显缩短，CMb小鼠却无差异 (图5c)。在雄性和雌性的无菌 FMT小鼠身上都得到同样的结论，这表明这一发现对两性都适用。以前的临床和动物实验表明，MG改变细胞因子的水平，在FMT小鼠中，发现了同样的现象。这表明肠道微生物群可能有助于MG的形成。

图5 菌群移植（FMT）实验流程 

8研究“MG菌群”受体小鼠肠道微生物群的变化

为了研究MG患者的微生物特征是否在MMb小鼠中复制， FMT后3周和4周分别对三个实验组的粪便微生物群落进行了16S rRNA测序。重要的是，在MG患者中发现的与HCs不同的微生物群落分别在FMT、MMb和HMb小鼠中得到了复制（图5d），来自CMb组的样本与MMb组和HMb组具有相同的特征，这可能解释了在MMb小鼠中观察到的其逆转受损运动和增加炎性细胞因子的能力。使用FMT后4周获得的粪便样本，确定了98个OUTs，它们可区分MMb组和HMb组（图5e）。这些差异的OTUs主要分为厚壁菌门(49/ 98,50.0%)、拟杆菌门(34/ 98,34.7%)、放线菌门(3/ 98,3.1%)，与MG患者与健康对照组肠道菌群的差异非常相似。这一发现提示MG患者的关键微生物特征在MMb小鼠中得以维持。MMb组和HMb组差异的98个差异OTUs中，有54个在CMb组发生不同程度逆转（图5e）。

值得注意的是，在54个以毛螺菌科 (7 OTUs)、拟杆菌科 (4 OTUs)、疣微菌科(2 OTUs)为主的逆向OTUs中，有16个不仅与OFT的总运动距离有关（图6a,b）。但也与粪便代谢组学的干扰有关，主要涉及不同环境下的氨基酸代谢、核苷酸代谢和微生物代谢的干扰（图6c）。MMb小鼠代谢途径紊乱与MG患者代谢途径紊乱一致。综上所述，MMb对GF小鼠的定植会导致运动能力受损。这些MMb小鼠复制了MG患者的关键粪便微生物和代谢特征，提示肠道微生物组可能通过调节宿主代谢促进MG的发展。

图6 MMb小鼠中肠道菌群特征分析

讨论

在临床上，自身抗体如AChR抗体是MG的经典诊断性生物标志物，但不能反映疾病的严重程度。本研究确定了一组与MG严重程度相关的粪便微生物与代谢物组合，且可100%取粪MG受试者与健康对照人群。这突出了该方法作为MG诊断的新型生物标记物的潜力。

原文网址：https://doi.org/10.1002/advs.201901441