编译：阿昊，编辑：谢衣、江舜尧。
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肠道菌群α-多样性的下降与多种人类疾病有关。我们以参与健康计划的志愿者（N = 399）为样本，通过约1000个血液分析物（实验室测试、蛋白质组学和代谢组学）来预测肠道微生物组α-多样性。虽然77项标准的临床实验室测试和263种血浆蛋白不能准确预测肠道α-多样性，但我们发现45%的α-多样性差异可以由40种血浆代谢物（40种微生物来源中的13种）的一个子集（subset）来解释。随后，这40种代谢物的预测能力在单独的验证实验（N = 540）中得到证实，以此表明我们的发现是可靠的。本文报道的代谢物生物标记物与心血管疾病、糖尿病和肾功能有关。极端肥胖者（体重指数≥ 35）肠道菌群α-多样性与宿主代谢物之间的关系发生改变意味着代谢紊乱。血液代谢组预测肠道微生物α-多样性的能力可以为临床检测肠道微生物健康奠定基础。
论文ID
原名：Blood metabolome predicts gut microbiome α-diversity in humans
译名：通过血液代谢组预测人类肠道微生物α-多样性
期刊：Nature Biotechnology
IF：31.864
发表时间：2019.9.02
通讯作者：Leroy Hood等
通讯作者单位：美国华盛顿州西雅图系统生物学研究所
实验设计
通过多种数据分析方法（LASSO，Ridge regression，PERMANOVA，random forests等），血浆代谢物子集可以有效预测肠道微生物α-多样性，然而使用同种分析过程却不能将构建起“临床实验室检测的数据”和“肠道微生物α多样性”的联系，血液蛋白的预测效果同样较弱。随后，这40种代谢物的预测能力进一步在单独的验证实验（N = 540）中得到证实。
实验结果
1.血浆代谢物预测肠道微生物α-多样性
为了研究宿主代谢组和肠道微生物组多样性之间的关系，我们应用最小绝对收缩和选择算子方法（LASSO）对基线血浆代谢组数据（表1）进行Shannon指数预测。在为每个志愿者测量的659种代谢物中，只有40种代谢物保留在最终模型中（表2）。LASSO保留的血浆代谢物的小子集对Shannon指数有很强的预测力，解释了平均45%的方差（样本外平均值R2=0.45，代谢组预测Shannon指数与观察Shannon指数的Pearson’s r=0.68；图1a）。所鉴定的代谢物主要属于生物异源物质、脂质和氨基酸（xenobiotics, lipid and amino acid superfamilies），苯丙氨酸和酪氨酸代谢物的频率特别高（图1b）。虽然在十倍交叉验证（CV）生成的十个模型中至少有一个模型中保留了40种代谢物，但在所有十个模型中仅保留了11种代谢物，并且在预测Shannon指数方面影响最大（图1c和补充表2）。在我们的分析中，岭回归（Ridge regression）在预测变量之间具有高共线性和在预测变量之间分布有大量微小影响时往往表现得更好，在我们的分析中，它的表现优于LASSO模型。10倍变异系数的岭回归只解释了Shannon指数中35%的平均方差，这表明它确实是最能反映肠道微生物多样性的主要独立血浆代谢物的一小部分。
我们研究了通过LASSO鉴定的40种代谢物之间的潜在共线性（collinearity）。在1560种代谢物比较中，只有6种被鉴定为高度共线（| r |>0.80）。在模型中，1-羧乙基苯丙氨酸在所有十种模型中都被保留，而另外两种羧乙基化合物在两种（缬氨酸）和三种（亮氨酸）模型中被保留。预测变量之间的低共线性与LASSO生成回归模型的方式一致。当分析物高度共线时，LASSO将保留模型中的一个分析物，同时将其他分析物的β系数推向零。
我们进一步探讨了40种已鉴定的代谢物并利用PERMANOVA解释肠道微生物β-多样性个体间差异的能力。在校正Shannon指数和多发性试验后，16种代谢物与受试者的肠道微生物变异显著相关。然而，每种代谢物解释的个体差异不超过1%。最强的α-多样性预测因子通常与个体间β-多样性变化无显著相关性，突出了我们所鉴定的代谢物在解释样本内而非样本间多样性方面的特异性。我们进一步评估了40种已鉴定的代谢物预测肠道微生物α-多样性的其他指标的能力（图1d）。用10倍变异系数（CV）拟合的套索模型只解释了40种已鉴定的代谢物对PD whole tree多样性的平均样本外方差为50%，对Chao1的平均样本外方差为36%。重要的是，使用整个血浆代谢组并没有提高这两个指标的预测能力，这证实了所鉴定的代谢物的一小部分足以捕获肠道微生物α-多样性中大多数可解释的变异性。
如前文所述，所有10个LASSO模型中仅保留了40种代谢产物中的11种（图1c）。接下来，利用随机森林（random forests）的10倍变异系数（CV）对低α-多样性（下四分位数）的参与者进行分类。11种代谢物不仅能够根据Shannon指数（平均灵敏度=0.72，平均特异性=0.90，平均精密度=0.72；补充图4）和其他α多样性指标（PD整树（PD whole tree）：平均灵敏度=0.68，平均特异性=0.89，平均精密度=0.67）对参与者进行分类；Chao1：平均灵敏度=0.64，平均特异度=0.88，平均精密度=0.65）。这些结果表明11种已鉴定的代谢物有可能作为肠道微生物多样性的生物标记物。
表1. 总基线（Total baseline）发现队列特征并按BMI分类。
表2. 40种已鉴定代谢产物与人类健康和肠道微生物的关系。
图1.血浆代谢组可以预测Shannon指数。a. N = 399队列中样本mShannon多样性与使用CV模型观察到的Shannon多样性的曲线图。b. 用于mShannon的CV模型中至少有一个保留了代谢物的超家族和亚家族分类。c. 对应于CV模型中保留的11种代谢物的平均β系数图。d. 使用40种已鉴定代谢物（红色）预测PD whole tree多样性和Chao1多样性。
图2. 11种最强代谢物预测因子与10个最丰富微生物属的相关性。显示了所有CV模型（行）保留的11种代谢物与10个最丰富的微生物群属（列）之间的Pearson相关性。
2.临床实验室检测无法预测α-多样性
迄今为止，血液临床实验室检查仍然是常规评估个人健康状况最常用的分子测量方法。然而，目前尚不清楚实验室测试如何通过血检指标来有效预测肠道微生物结构。为了评估这一点，我们使用了与代谢组学相同的方法，从广泛的临床分析物中预测Shannon指数。一组包括77个临床实验室测试不能准确预测个体Shannon指数（平均LASSO R2=0.01，平均岭回归R2=0.05）。用线性回归方法独立评估各临床实验室与Shannon指数的关系，进一步证实了临床实验室结果与Shannon指数的弱相关性。77项临床实验室检查中，28项与Shannon指数显著相关（FDR<0.05；图3b和补充表2）。然而，没有临床分析物单独解释Shannon指数中超过6%的变异，代谢健康标志物（脂蛋白胰岛素抵抗（LPIR）评分、甘油三酯和胰岛素）在所有分析物中排名最高（图3b）。相比之下，BMI单独解释了Shannon指数的7.5%的变异，解释了Shannon指数的变异比任何单一临床分析物都要大。当个体临床分析物模型根据性别、年龄和BMI进行调整时，只有LPIR评分和血甘油三酯与Shannon指数显著相关（FDR<0.05；补充表3）。一致的是，一个基于临床实验室测试结果的随机森林分类模型，该模型经过优化以识别Shannon指数低的参与者（下四分位数），表现出低性能。
图3.临床实验室测试指标和宿主代谢组Shannon指数。a. 香农多样性的变异系数百分比。b. Shannon多样性的变异系数百分比。c. 以Shannon或mShannon多样性为因变量的β系数和95%置信区间。d. Shannon和mShannon多样性的箱形块图。
3.血液蛋白质与Shannon指数有关。
除了临床实验室结果和代谢组学之外，我们还对399名参与者中的262名进行了263种独特的血浆蛋白测定。通过线性回归和多重假设检验，263个蛋白质中有41个与Shannon指数显著相关（FDR<0.05；补充表3）。与临床实验室结果相似（图3b），最相关的分析物是参与代谢的蛋白质，包括对氧磷酶3（Paraoxonase 3）（β（95%CI）=0.13（0.084，0.18），P=4.7×10-8），瘦蛋白（leptin）（β（95%CI）=-0.14（-0.20，-0.088），P=5.1×10-7）和低密度脂蛋白（LDL）受体（β（95%CI）=-0.12（-0.17，-0.064），P=2.9×05）。氧磷酶3是一种与高密度脂蛋白相关的酶，可以防止低密度脂蛋白的氧化，而瘦蛋白是脂肪细胞衍生的激素，在肥胖中升高。校正协变量后，只有3种蛋白质与肠道微生物多样性显著相关，包括LDL受体、羟酸氧化酶和丝氨酸蛋白酶。最后，使用与代谢组学相同的缺陷回归方法来评估所测血浆蛋白反映Shannon指数的程度。血浆蛋白质组比临床实验室结果更能预测Shannon指数，解释了13%的平均方差（平均LASSO R2得分=0.11，平均岭回归R2得分=0.13）。然而，这一预测仍远弱于血浆代谢组的预测。
4.Shannon指数与胃肠健康。
考虑到血浆代谢组是肠道微生物群结构的最强预测因子，我们继续进行使用mShannon（metabolome-predicted Shannon即预测得到的Shannon指数）以评估宿主生理是否反映了肠道微生物群中的扰动。利用来自Arivale参与者完成的生活方式和健康问卷的信息，Shannon指数与自我报告的胃肠道健康和抗生素使用的测量值进行回归，调整协变量。与Shannon指数主要扰动显著相关的几个因素也反映在宿主的代谢组中，如预测Shannon指数和mShannon的模型中的显著β系数（图3c）。特别是，据报道腹泻和腹痛的频率与Shannon指数呈强负相关，这也反映在mShannon中（图3c，d）。抗生素的使用与Shannon指数的降低显著相关，与mShannon的趋势相同（P=0.06）。排便频率较低（便秘）与Shannon指数和mShannon呈正相关（图3c）。
5.肥胖患者的代谢组-微生物组关系。
肥胖一直与代谢紊乱以及血液代谢组的实质性变化有关。此外，一些研究（但不是全部）报告肥胖者与正常体重者相比Shannon指数降低。为了进一步探讨Shannon指数、肥胖与血浆代谢组的关系，在BMI的基础上将队列分为四组（表1）。由于与肥胖相关的风险因BMI的增加程度而不同，肥胖通常分为三类（I类=30–34.9 kg m-2，II类=35–39.9 kg m-2，III类≥40 kg m-2）。在这项分析中，我们将二级和三级肥胖（重度肥胖）合并起来，但分别研究了一级（低风险）肥胖。随着体重指数的增加，肠道α-多样性的三个指标都显著降低，肥胖II/III级的参与者显示出所有组的多样性得分最低（表1）。特别是，对于Chao1和PD whole tree多样性，肥胖II/III组的参与者得分显著低于所有其他BMI等级，包括肥胖I组。肥胖II/III组的参与者也表现出更大的β-分散性，这表明肥胖II/III组参与者的肠道微生物群比BMI较低组的参与者（补充图1）。健康的分子标志物在BMI等级中逐渐恶化，然而炎症标志物，如白细胞介素-6（IL-6）和C-反应蛋白，在肥胖II/III组中特别升高（表1和图4a）。
图4.严重肥胖症患者的肠道微生物组-宿主代谢组。a. C-反应蛋白水平的箱形图，方框图表示四分位范围（IQR），中间线表示中间值；超出此范围的点单独显示。b. 通过CV确定的香农指数（mShannon）最强的五种代谢物预测因子的β系数。c. BMI<35的5α-雄甾烷-3β-17α-二醇二硫酸盐（5α-androstan-3β-17α-diol disulfate）与Shannon关系的散点图。d. 肥胖II/III组中5α-雄甾烷-3β-17α-二醇二硫酸盐（5α-androstan-3β-17α-diol disulfate）与香农多样性关系的散点图。
6.代谢组-验证队列中的微生物组关系。
为了证实我们的发现，论文作者更换了另一批志愿者提供的血液数据，他们在更早的时候加入了这个项目，他们的血液和微生物组样本由第三方机构进行分析（临床实验室测试：LabCorp（38%），Quest Diagnostics（62%）；微生物组：第二基因组（100%）；N=540；补充表4）。在校正发现队列中的协变量和多重假设检验后，与Shannon指数显著相关的35种代谢物中，有29种在验证队列中得到确认（补充表1）。类似地，在我们的发现队列中确定的66%的重要微生物群属-血浆代谢物相关性在验证集中得到确认（FDR<0.05；补充图7）。一个仅使用发现队列中确定的40种代谢物的套索模型被进一步拟合，以使用十倍变异系数预测验证队列中的Shannon指数。代谢物LASSO模型的样本外预测精度较低，但与发现队列的预测精度相似（平均R2=0.34，Pearson's r=0.60；图5a）。此外，将发现队列中所有LASSO模型中保留的11种代谢物的β系数与验证队列中使用十倍变异系数拟合的平均β系数进行比较，显示模型之间存在很强的相关性（Pearson r=0.94，P=2.05×10-5；图5b）。仅40种代谢物就解释了验证集中血液代谢物所捕获的Shannon指数的大部分差异。利用整个代谢组（659种代谢物）生成一个单独的套索模型提高了模型仅为轻度（平均R2=0.38；图5c），40种代谢物模型和全代谢组模型在十倍变异系数下的平均表现差异不显著（P=0.30）。验证队列中的整个代谢组套索模型在10倍的CVs中保留了58种代谢物。在58种中，15种与40种代谢物的发现队列集重叠（补充表1）。考虑到两个队列的不同人口统计学差异（表1和补充表4），以及套索在模型中保留分析物的方式，结果是可以接受的。尽管LASSO在发现集和验证集中独立保留的代谢物之间存在中度重叠，但11个最强代谢物预测因子的十倍变异系数的平均β系数在模型之间仍然显示出很强的相关性（Spearman的ρ=0.91，P=9.2×10-5；Pearson的r=0.90，P=1.9×10-4）。
图5.验证肠道微生物组-宿主代谢组关系。a. 验证队列中观察到的香农多样性和预测到的mShannon多样性的散点图。b. mShannon多样性最强代谢物预测因子的LASSOβ-系数与验证队列中优化的相同代谢物的平均LASSOβ-系数密切相关。c. CVs的平均值表示R2。d. ROC特征曲线（Receiver operator characteristic curves）对发现和验证队列中具有低Shannon分集（下四分位数）。e. 精确性回归曲线，用低Shannon（下四分位数）对发现和验证队列的参与者进行分类。
评论
该研究探索了宿主血液与肠道微生物之间的关系，为其之间的密切关系提供了新的预测方法，后续有望为宿主代谢组、肠道生态系统、宿主健康建立了桥梁关系。
原文网址：https://doi.org/10.1038/s41587-019-0233-9
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