科研| J CLIN INVEST：富含梭状芽胞杆菌的微生物群促进IBS-D患者的胆汁酸排泄

编译：小枳，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

粪便胆汁酸(BAs)过多被认为是腹泻型肠应激综合征(IBS-D)发病机制之一。然而，造成BA过量排泄的原因尚未被充分研究。考虑到肠道菌群在BA代谢中的重要性，我们假设肠道菌群失调可能造成BA的过量排泄。通过对290名IBS-D患者及89名健康志愿者进行粪便BA相关代谢物及宏基因组学分析，我们发现24.5%的IBS-D患者总BA过量排泄且他们的粪便中BA转化菌组成发生变化。值得注意的是，梭状芽胞杆菌（如C. scindens菌）的数量与粪便BAs和血清7a-羟基胆甾-3-酮(C4) 的水平成正相关，而与血清成纤维生长因子19(FGF19)的浓度成负相关。另外，将富含梭状芽胞杆菌的IBS-D患者粪便微生物群移植或C. scindens菌株单独定植均可增加小鼠血清中C4及肝脏中结合型BAs的含量, 却降低了回肠中FGF19的表达。研究人员用万古霉素抑制梭菌属菌后产生了相反的结果。体内外研究结果表明梭状芽胞杆菌源的BAs能够抑制肠道FGF19的表达。综上所述，本研究结果表明富含梭状芽胞杆菌的微生物群能够造成IBS-D患者过多的BA排泄，这一机制假设具有重要的临床意义。

论文ID

原名：A Clostridia-rich microbiota enhances bile acid excretion in diarrhea-predominant irritable bowel syndrome

译名：富含梭状芽胞杆菌的微生物群促进IBS-D患者的胆汁酸排泄

期刊：The Journal of Clinical Investigation

IF：12.282

发表时间：2019.9

通讯作者及单位：卞兆祥-香港浸会大学；贾伟-夏威夷大学；方晓东-广州中医药大学

实验设计

1. 受试者的招募、样品的采集及相关物质的测定

招募345名IBS-D患者及91名健康受试者作为对照(HCs)，采集受试者们的空腹血浆及早晨新鲜粪便。提取粪便样品中DNA并进行宏基因组测序，对血清样品中C4及FGF19进行含量测定。分别提取受试者总血清和粪便中的BAs 并进行定量测定。

2. 人粪便微生物移植实验

在人粪便微生物移植(FMT)之前，连续10 d给予小鼠抗生素混合物(ABX)从而制备伪无菌小鼠模型。将HC与IBS-D受试者的粪便样品（n= 11–12 /组）分别制备成微生物菌群PBS悬液（50 mg/mL），连续5 d每天给伪无菌小鼠灌胃200 μL该菌群悬浮液。人粪便微生物移植7 d后，对小鼠的胃肠动力及粪便粘稠度进行测定。分别采集造模前、造模10 d后及FMT 后小鼠的粪便用以监测菌群密度。最后收集小鼠盲肠内容物用以检测BA转化菌的丰度及活性，同时收集肝脏、回肠及回肠内容物用于分析BAs及BA相关的基因和蛋白。

3. 梭状芽胞杆菌定植实验

18只小鼠，随机成3组。连续7 d给予一组小鼠具有BA转化活性的C. scindens菌PBS混悬液（1 × 10⁸ CFU/mL）；第二组小鼠被给具有抗梭状芽胞杆菌的万古霉素（0.1 mg/mL）；空白组小鼠被给等量的空白PBS。实验后对不同组小鼠进行BA相关肠及代谢表型的测定。

4. BA干预实验

40只小鼠随机分成5组，将前4个实验组分别以每千克体重给药50 mg的TCA, TCDCA, TUDCA及其混合物(T-BAs)灌胃8周。第五组给予生理盐水作为对照。治疗结束后，采集各组小鼠的肝脏、回肠组织样品，用实时定量PCR法分析其编码FXR、FGF19、SHP及BA合成酶（CYP7A1、CYP8B1）的基因。

5. 体外细胞实验

培养人永生化肝细胞L-02及上皮细胞NCI-H716。分别用万古霉素（10 μM ~ 400 μM）及C. scindens（活菌体和灭活菌体）培养L-02细胞24 h，用以考察其对肝脏CYP7A1表达的影响。根据BAs激活FXR的EC₅₀范围，分别用50 μM TCA、TCDCA、TUDCA及T-BAs处理NCI-H716细胞24 h，用以分析牛磺酸结合型胆汁酸对FXR、FGF19、SHP、CYP7A1及CYP8B1表达的影响。另外，在CDCA存在或不存在的条件下，分别用GUDCA、GCDCA、GCA、CA、UDCA及 7-KDCA处理NCI-H716细胞24 h，来观察它们对上皮细胞中FXR 与 FGF19的表达情况的影响。

实验结果

1. BA过量排泄的IBS-D 患者具有更高的BA合成水平

研究共纳入345名符合ROME IV标准的IBS-D患者，其中有290名患者完成了所有检测，并自愿提供本研究所需的生物样品（血液和粪便）。同时，根据已有研究记载IBS-D患者过量BA排泄的发生率约为30%，本研究招募了91名健康成人作为对照（HC），其中89名受试者自愿提供生物样品。如表一可知，与HC受试者相比，IBS-D患者的排便频率及粪便总BA含量显著增加，而粪便粘稠度降低。如图1 (A)所示，IBS-D 患者和HC受试者的粪便总BA排泄量呈偏正太分布(根据Shapiro-Wilk 检验，P < 0.05)。

根据HC受试者确定第90百分位数临界值，结果发现25%的IBS-D患者粪便总BA排泄量过多（≥10.61 μmol/g），这些患者被分为BA⁺IBS-D组。而粪便总BA排泄量正常（<10.61 μmol/g）的IBS-D患者被分为BA^–IBS-D组。与HC组与BA^–IBS-D组相比，BA⁺IBS-D组患者血清C4水平升高，FGF19水平降低，腹泻症状的严重程度也增加（表1 与 图1 B–F）。相关分析表明，BA⁺IBS-D患者的粪便总BA水平与血清C4水平及腹泻症状评分呈正相关，而与血清FGF19水平呈负相关。上述结果表明，IBS-D患者体内BA合成增加，同时伴有BA排泄过量及腹泻症状程度增加。

在BA⁺IBS-D患者血清及粪便中也观察到单个BA水平的变化。血清BA谱显示，与正常受试者相比（补图 1），BA⁺IBS-D患者的甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)及鹅去氧胆酸(CDCA)的绝对含量和相对比例均显著升高。此外，BA⁺IBS-D患者血清熊去氧胆酸(UDCA)的绝对浓度升高，而甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)的相对比例降低。如前所述，粪便BA主要由游离BAs组成，其中胆酸(CA)、CDCA、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、7-酮脱氧胆酸(7-KDCA)、UDCA及ω-鼠胆酸(ωMCA)在BA⁺IBS-D患者粪便中的绝对水平与HC受试者相比明显升高（图 1 G 与H）。同时BA⁺IBS-D组患者粪便总BAs中CA、CDCA、UDCA及 7-KDCA的比例有所增加，而LCA 和12-KLCA的比例下降（图 1 I）。此外，在丰富的结合型BAs中，BA⁺IBS-D组患者粪便GCDCA略有增加，而GUDCA没有明显的变化。然而，BA^–IBS-D组患者具有与HC组受试者相似的血清和粪便BA组成。上述结果表明BA⁺IBS-D患者血清和粪便中源于微生物群代谢生成的BAs（如GUDCA，UDCA，7-KDCA等）的组成发生了一定的变化，提示参与BA代谢的肠道微生物异常可能是造成IBS-D患者BA排泄过量的原因。

表1 基于粪便总BA排泄的IBS-D患者的人口统计学和临床特征

图1 IBS-D患者的粪便BA谱及血清BA合成相关指标变化图

(A) HC受试者（n = 89）和IBS-D患者（n = 290）粪便总BA水平分布直方图; (B+C) 血清7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(C4)和成纤维细胞生长因子19(FGF19)的浓度; (D-F)通过排便频率(D)、布里斯托大便分类法(E)及IBS严重程度评分系统(IBS-SSS) (F)评估IBS-D各组肠道症状的严重程度; (G+H) 粪便中优势BA的绝对含量；(I) 粪便中优势BAs的百分含量。

2. BA⁺IBS-D患者富含梭状芽胞杆菌的粪便微生物群与其增加的BA合成与排泄的关系

粪便宏基因组学数据已成功从84名HC受试者，70名BA⁺IBS-D患者及207名BA^–IBS-D患者中获得。从每个样品中获得平均6.04 Gb高质量测序数据，平均比对率为63.7% （补表 2）。与HC和BA^–IBS-D组受试者相比，BA⁺IBS-D组受试者粪便微生物群落表现出更高的Bray-Curtis相异指数，但在总基因数目和Shannon 指数上则没有明显的差异（图2 A 和补图 2 A 和 B）。这些结果表明所有受试者的菌群丰度未发生改变，而BA⁺IBS-D组患者肠道生态系统较不稳定。

主成分分析结果显示IBS-D与HC受试者粪便微生物群落有部分重叠（补图2C）；然而，与HC 或 BA^–IBS-D组受试者相比，BA⁺IBS-D组患者的粪便微生物在不同分类水平上明显不同（补表 3–5）。确切地说，BA⁺IBS-D患者粪便中厚壁菌门，放线菌门，梭杆菌门和变形杆菌门的相对丰度增加，而拟杆菌门的相对丰度降低（补图2D）。因此，厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)显著升高（图 2B）。在属水平上，BA⁺IBS-D患者粪便微生物群中梭菌属细菌（包括瘤胃球菌，芽孢梭菌，真杆菌和Dorea菌等）的丰度显着增加（补图2E）。双歧杆菌，大肠杆菌和嗜胆菌的丰度也相对增加。然而，与HC 或 BA^–IBS-D组受试者相比，BA⁺IBS-D患者粪便微生物群中的Alistipes 和 拟杆菌的丰度显著降低。

如图2C与补充材料中表6 所示，BA⁺IBS-D 患者粪便微生物群组成的改变可能与BA代谢相关基因发生变化有关。Alistipes 和 拟杆菌丰度的降低主要与cgh基因丰度下降有关（图 2D），其是编码BA去偶联酶胆酰甘氨酸水解酶的基因。然而，编码7α-羟基类固醇脱氢酶的基因（7α-HSDH）hdhA的丰度却升高，这与大肠杆菌、细梭菌、布劳特氏菌、瘤胃球菌及梭状芽孢杆菌的增加有关。另外，梭状芽孢杆菌和未分类的毛螺菌种较大程度地促使baiCD 和 baiH基因丰度升高（图2E），这些基因是编码7-脱羟基酶的基因。相关分析结果表明，梭状芽胞杆菌属C. scindens菌的丰度与粪便总BA和血清C4的浓度呈正相关，但与血清FGF19水平呈负相关（图 2F 和 G）。这些结果提示BA⁺IBS-D组患者粪便中富含梭状芽胞杆菌，且具有能够编码BA脱偶联酶、C7异构化及脱氢化酶的各种基因组。考虑到肠道微生物在保持宿主BA代谢中的重要性，IBS-D组受试者肠道菌与BA指数的关系提示富含梭状芽胞杆菌的微生物群可能影响患者BA合成及排泄。

图2  IBS-D组患者体内富含梭状芽胞杆菌的粪便微生物群与其BA合成与排泄水平的关系

(A) Bray-Curtis相异指数测量的微生物β多样性；(B) 后壁菌与拟杆菌的比例(F/B)；(C-E) BA代谢相关基因与细菌的相对丰度；(F+G) IBS-D患者的细菌丰度与生化指标的Spearman相关性。

3. 富含梭状芽胞杆菌的粪便微生物移植增强伪无菌小鼠BA合成与排泄

为了研究富含梭状芽胞杆菌的微生物群对BA合成与排泄的影响，我们将BA⁺IBS-D 患者的粪便微生物群移植至伪无菌小鼠体内（伪无菌小鼠模型的构建见图3A与补充材料中的图3A）。微生物群植入1周后，BA⁺IBS-D粪便微生物群受体小鼠的胃肠道转运时间缩短，粪便含水量增加（图 3B），这与它们的供体腹泻症状相似。在BA⁺IBS-D粪便微生物群受体小鼠及其供体之间发现了类似胆汁酸转化菌群特征，表现为拟杆菌的丰度降低，而厚壁菌、梭菌簇XIVa（C.XIVa）及闪烁梭菌的丰度升高（图 3C）。一项检测BA产物与底物比例的体外转化活性研究实验发现从小鼠受体盲肠分离出的微生物群的结合能力降低，7α-羟基类固醇脱氢化和7α-去羟基化能力略有增加（补图3B）。这些结果与BA⁺IBS-D供体粪便微生物群的BA转化活性一致。

代谢分析结果（图3 D-F与补图3D）显示，BA⁺IBS-D粪便微生物群受体粪便总BAs和血清C4增加，伴随着肝脏及回肠内牛磺酸结合型BAs (TβMCA, TCA, TCDCA及TUDCA)升高 （图 3, D–F 和补图3D）。另外，BA⁺IBS-D粪便微生物群受体肝脏组织中Cyp7a1和Cyp8b1的基因表达增加，但Shp和回肠组织中Fgf15的基因表达降低 （图 3G 与补图 3E）。在蛋白质水平上也证实了肝CYP7A1表达的增加和回肠FGF15表达的降低（补图3F）。此外，经mRNA分析结果显示，与HC粪便微生物群受体相比，粪便微生物群受体间肝FGF19/15受体复合物 (FGFR4 和 Klothoβ [KLB]) 与回肠BA活性转运蛋白（顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白，ASBT；多药耐药相关蛋白2和3，MRP2 和 -3；有机溶质转运体α/β，OSTA 和 -B）没有发生变化。上述结果显示BA⁺IBS-D供体的富含梭状芽胞杆菌的粪便微生物群能够诱导受体小鼠腹泻样症状，并促进BA的合成和排泄，但这种作用可能与BA的回肠吸收和肝反馈抑制无关。

图3 BA⁺IBS-D患者粪便微生物群移植的受体小鼠内BA的过量合成与排泄

(A) 人粪便微生物群移植(FMT)至多种抗生素诱导的(ABX-induced)伪无菌小鼠的实验过程（n = 6/组）；(B) 受体小鼠的胃肠道转运时间与粪便含水量；(C) 受体小鼠及其供体粪便中BA相关微生物相对水平的qPCR分析；(D 与 E) 受体小鼠粪便总BAs及血清C4水平；(F) 受体小鼠肝脏BA谱；(G) 受体小鼠肝脏组织中BA合成调节因子的相关基因表达。

4. 梭状芽孢杆菌的定植对小鼠BA合成和排泄的增强作用

为进一步阐明梭菌属物种对BA合成与排泄的作用，我们将10⁸ CFU/mL C. scindens菌株定植于小鼠，另一组小鼠给予0.1 mg/mL 万古霉素来诱导梭菌缺乏小鼠（图4A），空白组小鼠给予PBS作为对照。与空白组相比，C. scindens菌株定植能够明显降低小鼠的粪便浓度，而经万古霉素给药后，小鼠的胃肠道转运速度明显降低（图4B）。另外，经qPCR分析，与空白组相比，C. scindens菌株植入的小鼠盲肠中C. scindens菌株的丰度明显增加（图4C）。体外转化活性研究实验显示C. scindens 菌株受体小鼠粪便微生物群的BA解偶联活性降低，而7α-羟基类固醇脱氢化活性增加（补图4A）。相反地，经万古霉素处理的小鼠盲肠中梭菌的丰度显着降低，同时7α-羟基类固醇脱氢化和7-脱羟基的体外活性降低，BA解偶联能力提高(图 4C 与 补图4A)。

代谢物分析结果表明，C. scindens菌株定植小鼠粪便总BA和血清C4的浓度显著增加，而经万古霉素处理的小鼠粪便总BA及血清C4的含量均降低（图 4, D和E）。同样地，C. scindens菌株定植小鼠的肝脏和回肠腔中牛磺酸结合型BAs （TβMCA, TCA及TUDCA）的浓度升高，而万古霉素处理的小鼠中这些均降低（图 4F 与补图4B）。此外，Cyp7a1mRNA在C. scindens菌株定植小鼠肝脏中表达升高，但在万古霉素处理的小鼠中显著降低（图 4 G）。C. scindens菌株定植使得小鼠回肠中Fgf15 mRNA表达显著降低，这在蛋白质水平上也被证实了（图 4G 与 补图 4C）。然而，各组间Fgfr4和Klb的表达水平无显著性差异 （图4G）。尽管各细菌定植组间Fxr的表达没有显著性差异，但是万古霉素处理组小鼠的肝脏Shp 和 回肠 Fgf15基因显著升高。另外，我们还发现无论是用万古霉素（10-400 μM）还是C. scindens（活菌体或灭活体）处理后，对L-02肝细胞中CYP7A1的表达均没有直接的影响。这些发现表明，梭状芽孢杆菌能够增加IBS患者BAs的排泄并使其出现腹泻样症状，这与FXR介导的控制BA合成的反馈调节通路有关。

图4 梭状芽胞杆菌定植的小鼠BA的合成与排泄失调

(A) 经植入C. scindens 菌株(C. s) 或 给药0.1 mg/mL万古霉素的微生物调控小鼠模型建立的操作过程；(B) 梭状芽孢杆菌处理小鼠的胃肠道转运时间与粪便含水量；(C) 小鼠粪便中梭状芽胞杆菌(C. XIVa)与C. scindens菌株相对水平的qPCR分析；(D+E) 粪便总BAs及血清C4水平；(F) 小鼠肝脏BA谱；(G) 肝脏与回肠组织中BA合成调节因子的相关基因表达。

5. 梭状芽胞杆菌衍生的BAs对肠道负反馈信号的抑制作用

在富含梭状芽胞杆菌的微生物群移植及C. scindens菌株定植的小鼠体内始终可检测到牛磺酸结合型BAs (TCA, TCDCA及TUDCA)，结合已有研究证实TβMCA对FXR具有拮抗作用，因此我们认为这些牛磺酸结合型BAs对FXR介导的反馈信号传导具有抑制作用。为证实这一观点，我们通过体内外实验研究TCA, TCDCA, TUDCA及其混合物(T-BAs)对肝脏和肠FXR介导的反馈信号通路的作用。

我们首先利用小鼠模型分别考察TCA, TCDCA, TUDCA及T-BAs (50 mg/kg/d) 对FXR介导的反馈系统的影响。与空白对照组（给予生理盐水）相比，TUDCA降低了小鼠回肠Fxr基因的表达。TCDCA, TUDCA及 T-BAs降低了小鼠回肠Fgf15的表达，而升高了肝脏Cyp7a1的表达（图 5, A 和 B）。这四种BA对肝脏Fxr的表达均无影响，而TUDCA提高了肝脏Shp的表达（图 5 A）。另外，我们也通过体外实验证实了TCA, TCDCA, TUDCA及 T-BAs对FXR信号通路的作用。根据已有研究中FXR配体的EC₅₀范围，我们发现50 μM TUDCA 和 T-BAs均能明显降低NCI-H716肠上皮细胞FGF19表达，这与体内观察结果相似（图 5 C）。此外，50 μM TUDCA 降低了L-02肝细胞中 FXR及小异源二聚体伴侣(SHP)的表达，但明显升高了CYP7A1的表达（补图 5）。体内外结果表明TUDCA能够阻断肠FXR/FGF15/19信号通路，但对肝FXR/SHP通路的作用研究结果不一致，需进一步进行研究。

随后，我们研究BA⁺IBS-D 患者血浆和粪便BA池中的优势BAs（GCDCA, GUDCA, GCA, CDCA, CA, UDCA及7-KDCA）对肠上皮细胞中FXR 和 FGF19基因表达的影响。作为FXR天然的激动剂，CDCA 和CA 能够激活FXR并显著提高FGF19的表达（图 5 D）。尽管其他BAs（GCDCA, GUDCA, GCA, UDCA及7-KDCA）单独应用对FXR的表达没有影响，但这些胆汁酸能够有效拮抗CDCA诱导的肠上皮细胞FXR活化过程 （图 5 D 与 E）。综上所述，体内外实验结果显示梭状芽胞杆菌衍生的BAs，尤其是结合型和游离UDCA减少了肠道FGF19/15的产生，这表明富含梭状芽胞杆菌的微生物群与C. scindens菌株能够抑制肠道负反馈调节信号通路。

图5 梭状芽胞杆菌衍生的BAs对肠道FXR反馈信号的抑制作用

(A+B) 牛磺酸结合型BAs干预下小鼠肝脏和回肠中FXR基因及其靶基因的表达（n = 8/组）；(C) 小鼠富含梭状芽孢杆菌的微生物群衍生的牛磺酸结合型BAs作用下肠上皮细胞中FXR和FGF19表达的Western blot分析；(D) 人富含梭状芽孢杆菌的微生物群中衍生的BAs作用下肠上皮细胞中FXR和FGF19的基因表达；(E) FXR激动剂CDCA与梭菌衍生的BAs共同作用下肠上皮细胞FGF19基因的表达；(F) 富含梭状芽孢杆菌的微生物群导致BA⁺IBS-D患者体内过量BA合成与排泄的一种潜在机制的示意图。

讨论

本研究发现BA⁺IBS-D患者粪便中富含梭状芽胞杆菌，这种微生物群可使得宿主BA转化系统失去平衡。这种肠道菌群失调与IBS-D患者体内过量的BA合成与排泄密切相关。将BA⁺IBS-D患者富含梭菌的肠道微生物群或某种梭菌移植于小鼠，能够使得该受体小鼠体内BA的合成与排泄增多。本文通过对这一现象的机理研究发现，经梭菌群作用产生的BAs减弱了肠道BA反馈调节抑制作用。

胃肠道内BA的过量传导是造成IBS-D的一个重要原因。根据已有研究游离的初级和次级BAs对胃肠动力及分泌功能具有刺激作用，游离BAs（特别是CDCA, DCA, LCA 及UDCA）排泄的增加可能使BA⁺IBS-D患者出现腹泻症状。为探索造成BAs过量排泄的原因，前期研究发现，IBS-D或功能性腹泻的患者血清C4浓度升高或FGF19浓度降低，同时伴随回肠活检组织中基础和刺激后FGF19的表达异常。这些结果提示FGF19缺乏可能导致IBS-D患者体内过量的BAs。然而，FGF19缺乏的原因尚未得以阐明。前期研究发现回肠活检组织中BA转运体ASBT的基因型及mRNA表达未发生改变，且具有相似的BA转运活性，除回肠吸收对IBS-D或功能性腹泻的患者过量BAs的贡献外。我们的研究发现，BA⁺IBS-D患者血清而非粪便GCDCA 和 GUDCA明显升高，同时血清和粪便中UDCA的浓度增加。考虑到游离BAs及与氨基酸结合的BAs跨肠道膜转运存在多种机制，我们的数据表明回肠的吸收不良应该与BA⁺IBS-D患者过量的BAs无关。

BA谱显示，BA⁺IBS-D 患者血清及粪便中经微生物群衍生的BAs明显增多，这提示BA转化相关的肠道菌群可能失调。粪便宏基因组数据也支持这一变化，特别地在BA⁺IBS-D患者粪便微生物群中发现大量的梭菌。同时转化BA相关基因结果也支持这一假设。值得注意的是，将BA⁺IBS-D患者富含梭菌的粪便微生物群或C. scindens菌株移植于小鼠后，该小鼠出现与IBS-D患者的临床表型相似的腹泻症状。这种移植也导致小鼠粪便总BAs的增加和肝脏BA的过量合成，同时伴随回肠FGF15表达不足及血清C4的增加。受体小鼠的这些变化也与BA⁺IBS-D患者过量BA排泄，C4的增加及FGF19表达下降相似。这些结果提示一种肠道微生物群介导的机制，即富含梭菌的微生物群介导的BA过量合成与排泄机制。

IBS-D患者肠道微生物群对BA的生物转化的研究较少。首先，通过体外代谢活性实验发现从IBS-D患者粪便分离获得的肠道微生物群的解离能力降低，这与之前的报导相似。然而，与之前的研究相比，我们的研究还发现BA⁺IBS-D患者粪便肠道微生物群的解离能力较BA–IBS-D患者更低。同样地，人类组学数据显示BA⁺IBS-D患者血清GUDCA比例增加，伴随着粪便cgh 及cgh表达属丰度的降低，这表明富含梭菌的微生物群具有较低的解离能力。另外，从受体小鼠分离的盲肠微生物群的体外解离能力降低及小鼠回肠腔牛磺酸结合型BAs的增加也间接地证明了该微生物群解离能力的降低。这些数据支持BA⁺IBS-D患者体内结合型BAs增加这一结论。其次，BA⁺IBS-D 患者肠道微生物群的特征还包括富含hdhA/bai表达的梭菌（如C. scindens菌），伴随着体外7α-羟基类固醇脱氢化和7-脱羟基化体外活性的升高。Marion等揭示除了7α-脱羟基化，C. scindens菌株还可以体外氧化初级和次级BAs的其他羟基并脱酮基，即产生keto-BAs 和 iso-BAs。结果显示BA⁺IBS-D组受试者粪便中次级BAs（如UDCA, 7-KDCA, DCA及 LCA）绝对水平的增加，这支持了我们对BA⁺IBS-D患者BA转化相关基因及活性的发现。我们还注意到在变化的次级BAs中，UDCA 和 7-KDCA占有了很高的比例，而LCA的比例较低，提示富含梭菌的微生物群的C7异构化和氧化活性更强。总体而言，次级BAs的增加及相关基因表达的升高表明BA⁺IBS-D患者富含梭菌微生物群的BA生物转化模式发生了变化。

BAs是FXR的天然配体，FXR通过负反馈调节肠道和肝脏中BA的合成与分泌，被认为是BA的主要调节剂。我们的体外研究结果发现UDCA对FXR具有拮抗作用，从而导致FGF15/19产生减少，这与最近一项有关肥胖患者中UDCA的研究一致。该研究表明UDCA能够拮抗肠反馈控制系统从而导致血清FGF19水平的降低。我们还发现经微生物群C7氧化得到的次级BAs，7-KDCA对肠细胞中Fxr 与 Fgf19的表达没有影响，却明显抑制CDCA激活的Fgf19的表达。另外，由于在BA⁺IBS-D供体和小鼠受体中均检测到大量的GUDCA 与 TUDCA，这是富含梭菌的微生物群的解离能力下降所致，所以我们还分析了他们对FXR的作用。结果发现GUDCA对FXR具有拮抗作用，从而导致肠FGF19/15产生受到抑制，这与前期的研究结果一致。一项前期研究揭示TUDCA对FGF19/15表达具有抑制作用，这可能归因于其对FXR的拮抗作用，这与我们体内研究结果不同。因此，TUDCA对FXR表达及活性的影响需进一步的验证。由于BA⁺IBS-D患者血清中检测到过量的GCDCA，这是肠道微生物群解离能力下降的结果，因此我们研究GCDCA对FXR活性潜在的影响。我们的结果显示，GCDCA对肠细胞Fxr和Fgf19的表达没有影响，却明显降低了CDCA激活的 Fgf19的表达。这些发现表明，对于Fgf19的表达的作用，最有效的BA配体- CDCA与GCDCA间存在相互作用。前期研究也表明GCDCA能够在体外激活FXR。另外两项应用体外培养的人回肠的研究也显示GCDCA 对FGF19 mRNA表达具有刺激作用。然而，应用相同的剂量，Zhang等却发现GCDCA对Caco-2细胞的FXR活性及FGF19的表达没有影响。关于GCDCA对FXR活性影响的体外研究数据相互矛盾，这意味着有必要对这些结果进行验证。然而肠道中是否存在CDCA或其他BAs与GCDCA对肠道FGF19的共同作用的在体实验研究可能为验证实验提供思路。

众所周知，BAs能够通过BA-FXR-SHP途径反馈抑制BA的合成。我们发现将富含梭菌的微生物群与C. scindens菌株植入小鼠后，其肝脏中Shp的表达受到抑制。同样地，在体外实验中发现梭菌衍生的TUDCA减少了肝细胞Shp的表达。我们的这些结果暗示富含梭菌的微生物群衍生的BAs可能对肝脏FXR反馈信号具有抑制作用。然而，关于BA对FXR/SHP信号传导影响的体外实验结果无法在在小鼠体内得到验证。BAs是否及如何影响人肝脏FXR/SHP信号传导需要被进一步系统地研究。总体而言，如图5 F所示，我们的结果建议富含梭菌的微生物群能够使得某些次级BAs（如UDCA, UDCA复合物及 7-KDCA）的比例升高，从而抑制肠道FXR/FGF19 信号的传导，最终增加了IBS-D患者体内BAs肝脏的合成和粪便的排泄。

我们的研究证实了梭菌与肠道FGF19缺乏的因果关系。一项抗微生物的研究表明阿莫西林能够降低仔猪梭菌群的丰度增加其回肠及血清的FGF19水平，这也支持了这种因果关系。考虑到肠道微生物与BAs间的互相干扰，我们无法排除梭菌群富集可能继发于FGF19缺乏引起的BA异常这一可能。抗生素对BA⁺IBS-D患者治疗的进一步临床实验研究将有助于这一问题的阐明。最近，有研究表明牛磺胆酸给药后，小鼠胃肠道中胆汁耐受菌-嗜胆菌增多。BA⁺IBS-D患者微生物群落中胆汁耐受菌如大肠杆菌和嗜胆菌的增多可能是由于其腔道中存在过量的BAs。这可能解释了IBS-D患者体内几种非梭菌属与血清C4和粪便总BAs的密切关系。这种肠道微生物群与腔道内过量BAs间相互作用关系应该被进一步研究。

本研究的发现可用于指导IBS的临床诊断、治疗及研究。之前的临床实践中常将粪便BA或结合血清BA合成标志物(C4与FGF19)的分析作为诊断IBS-D伴有胆汁酸腹泻（BAD）的辅助指标，伴随着硒高胆酸牛磺酸保留(SeHCAT)及BA隔离实验。我们的研究建议除了总BAs及初级BAs (CA 和 CDCA)，次级BAs (GUDCA, UDCA 及7-KDCA)及其转化相关的梭菌属细菌也可作为分类IBS-D患者的潜在指标。需要进一步的临床实践来证实特定的BAs及其相关菌对是否是BAD型IBS-D的预测能力。我们的研究也提出一种靶向BA转化相关菌的用于治疗BAD型IBS-D的新策略。另外，肠道菌群与其代谢物分析相结合对IBS的研究具有重要的临床意义。Jeffery等也提出了基于微生物群的IBS亚型的概念。然而，不同课题组得到的微生物的数据不一致使得很难依照经典生态学方法对IBS患者进行分类。由于它们在IBS生理病理上的重要性，当区分不同IBS亚型时，肠道微生物结构也应该被考虑。我们将结构及代谢数据相结合的研究表明一组IBS-D患者亚群中存在特定的BA转化菌，这表明肠道菌与其代谢物分析相结合无论是在临床研究还是在实践中均是十分必要的。我们相信肠道菌及其代谢物的准确表征，并结合肠道菌结构和功能的特征分析将提高现有基于症状分类IBS的准确性。

本研究的局限性在于IBS-D患者富含梭菌的微生物群与BA相关表型间的因果关系尚不能被充分的证实。这一因果关系需要在具有肠道微生物调节作用的IBS-D患者中被进一步验证。另外的局限性是此项研究没有包含其他BAD类型的患者。需要在IBS及非腹泻型IBS患者中进行富含梭菌微生物群及其对宿主BA合成与排泄刺激作用的进一步研究。

讨论

总之，本研究将人类组学分析与机制研究实验相结合，结果表明富含梭菌的微生物群能够促进BA⁺IBS-D患者体内BA的合成和排泄，这是通过增加能够抑制肠道FGF19产生的某些次级BAs的比例导致的。另外，能够促进BA过量合成的富含梭菌的微生物群是更精确地阐明IBS-D病理过程及症型分类的基础。因此，从生理、病理及治疗策略上，将肠道微生物谱及其代谢物特征分析相结合无论是对IBS还是所有肠道微生物相关的疾病均能有更深入的了解与认知。

原文网址：https://doi.org/10.1172/JCI130976