编译：胜寒，编辑：谢衣、江舜尧。
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论文ID
原名：The gluconeogenic enzyme PCK1 phosphorylates INSIG1/2 for lipogenesis
译名：糖异生代谢酶PCK1磷酸化INSIG1/2促进脂质合成
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2020.04
通讯作者：吕志民;洪明奇
通讯作者单位：浙江大学；青岛大学；中国台湾地区中国医药大学
实验设计
1.作者结合免疫共沉淀、免疫荧光分析以及液相色谱串联质谱分析等方法发现IGF1诱导的和AKT磷酸化的PCK1能够易位至ER并与INSIG1/2结合；
2.放射性标记[γ-32P] GTP 发现AKT磷酸化的PCK1使用GTP作为磷酸盐供体来磷酸化INSIG1/2；
3.结合基因敲入、重组表达以及细胞分级分析和免疫荧光等发现PCK1介导的INSIG1/2磷酸化从ER释放SCAP并促进SREBP1激活以促进脂肪形成；
4. 作者通过向裸鼠肝内和皮下注射Huh7细胞以及对原发性肝癌和邻近正常组织的样本进行免疫组织化学分析发现PCK1-INSIG1/2促进HCC生长，并与肝癌预后不良相关。
实验结果
AKT磷酸化的PCK1与INSIG1/2结合
为了研究致癌信号转导对细胞内蛋白的调节，作者使用胰岛素样生长因子1 (IGF1)处理Huh7人HCC细胞1小时，诱导其产生对HCC发展至关重要的信号转导。免疫沉淀物的质谱分析表明IGF1可诱导INSIG1或INSIG2(以下简称INSIG1/2)与胞质PCK1(也称为PEPCK1)发生关联。PCK1是糖异生在肝脏和肾脏的限速酶，将草酰乙酸和GTP转化为磷酸烯醇丙酮酸和CO2。在人类中，胞质PCK1与线粒体PCK29具有63.4%的序列一致性。免疫共沉淀和免疫荧光分析显示，在IGF1刺激的Huh7和Hep3B HCC细胞中，PCK1而不是PCK2与INSIG1结合(图1a)，IGF1通过INSIG1诱导PCK1共定位，而不是PCK2。此外，细胞分馏分析显示，少量的PCK1，但不是PCK2，转移到ER，因此，PCK1转移到ER，并在IGF1刺激时与INSIG1/2结合。
为了确定调控PCK1和INSIG1/2相互作用的机制，作者抑制了Huh7细胞中IGF1的下游信号通路。作者发现AKT抑制剂MK-2206或显性阴性AKT突变体(AKT- DN)的表达可阻断IGF1诱导的PCK1与INSIG1/2的结合（图1b），以及PCK1向ER的移位及其与INSIG1的共定位。相反，活性AKT (myr-AKT)的表达可诱导PCK1(而非PCK2)与INSIG1/2结合。这些结果表明，AKT诱导PCK1转位至ER，并与INSIG1/2结合。免疫共沉淀分析显示，IGF1刺激HCC细胞可诱导AKT与PCK1相互作用。作者还进行了一项下拉实验，发现纯化的活性谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的AKT1通过其催化域直接与His标记的PCK1结合。体外磷酸化分析和液相色谱串联质谱分析表明，AKT1在进化保守的Ser90残基上磷酸化PCK1，AKT磷酸化基序为RXXS/T。PCK1中Ser90突变为丙氨酸(S90A)(图1c)或MK-2206处理消除了这种磷酸化，这也可以通过特异性于PCK1 Ser90位点磷酸化的抗体检测到(PCK1(pS90))。IGF1处理可迅速诱导Huh7细胞中PCK1的磷酸化，而AKT抑制剂MK-2206预处理可抑制这一过程(图1d)。在内源性PCK1缺失的Huh7细胞中表达的一个耐RNA干扰(r) PCK突变体(rPCK1(S90A))对IGF1诱导的PCK1 Ser90磷酸化具有抗性，并且不表现出myr-AKT1或IGF1诱导的向内质网的转位。相比之下，模拟磷酸化的PCK1(S90E)突变体在没有IGF1刺激的情况下在内质网中积累。利用CRISPR cas9介导的基因组编辑，敲入PCK1(S90A)在HCC细胞中表达，阻断了IGF1诱导的PCK1向ER的移位及其与INSIG1的共定位。这些结果表明，AKT1介导的PCK1 Ser90磷酸化对于PCK1向ER的转位是必要且充分的。
值得注意的是，AKT介导的PCK1磷酸化或S90E突变的引入降低了PCK1与草酰乙酸的结合亲和力及其酶促活性（即磷酸烯醇丙酮酸的产生），因此AKT介导的PCK1磷酸化及其易位ER抑制糖异生中PCK1的典型功能。
为了确定PCK1 Ser90磷酸化在其与INSIG1/2结合中的作用，作者将纯化的INSIG1/2与野生型GST–PCK1或GST–PCK1（S90A）混合。 只有AKT磷酸化的野生型PCK1与INSIG1/2相互作用。通过用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理可消除这种相互作用，该酶可将PCK1（pS90）残基去磷酸化。与此相一致的是，IGF1处理可诱导INSIG1/2与S蛋白标记的链霉亲和素结合肽（SFB）标记的野生型PCK1结合，而不与SFB–PCK1（S90A）结合。通过使用CIP处理或通过在HCC细胞中敲入PCK1（S90A）的表达来消除这种结合（图1e）。 因此，PCK1 Ser90的磷酸化是PCK1与INSIG1/2结合所必需的。
为了确定INSIG1/2在PCK1向ER转运中的作用，耗尽Huh7细胞中的INSIG1/2阻止了PCK1向IGF1或myr-AKT1诱导的ER转运。INSIG1/2突变体的表达表明INSIG1/2的环1与PCK1结合。 PCK1（pS90）肽未阻止这种相互作用），这表明PCK1的构象变化（由Ser90的磷酸化介导）导致PCK1与INSIG1/2结合，而不是直接将Ser90磷酸化。
图1 IGF1诱导的和AKT磷酸化的PCK1易位至ER并与INSIG1/2结合
PCK1磷酸化INSIG1/2
由于PCK1能够将磷酸基团从GTP转移至代谢产物，因此作者接下来研究PCK1是否使INSIG1/2磷酸化。在存在放射性标记的[γ-32P] GTP和活性AKT1的情况下，仅纯化的野生型PCK1而不是PCK1（S90A）或PCK1（C288S）磷酸化纯化的INSIG1（图2a）和INSIG2。相比之下，在[γ-32P] ATP存在下不会发生这种磷酸化。 LC-MS / MS分析显示INSIG1在Ser207处被磷酸化，与INSIG2中的Ser151相对应。 这两个残基都是进化保守的，位于INSIG1/2的胞质环2中。 体外PCK1不会将INSIG1（S207A）（图2b）和INSIG2（S151A）磷酸化。与野生型PCK1相比，PCK1（S90E）在无限浓度的底物（Vmax）和较低的米氏常数（Km）处，在INSE1肽的Ser207磷酸化中显示出更高的酶催化反应速度（ 值得注意的是，在没有AKT的情况下，PCK1（S90E）或PCK1（S90D）突变体使INSIG1的Ser207和INSIG2的Ser151磷酸化）。此外，在Huh7细胞中表达的INSIG1（S207A）和INSIG2（S151A）对由IGF1刺激或myr-AKT1表达诱导的磷酸化具有抗性。 与此相一致，PCK1（S90A）或INSIG1（S207A/INSIG2（S151A）的敲入表达也消除了IGF1诱导的INSIG1/2磷酸化（图 2c）。 因此，AKT磷酸化的PCK1充当蛋白激酶，并使用GTP作为磷酸盐供体来磷酸化INSIG1/2。
图2 PCK1磷酸化INSIG1 Ser207和INSIG2 Ser151，从而减少固醇与INSIG1/2的结合
INSIG1/2磷酸化后减少了与固醇的结合
接下来，作者检验了INSIG1/2的磷酸化是否会影响INSIG蛋白与固醇的结合。 AKT磷酸化的野生型PCK1对野生型INSIG1和INSIG2的磷酸化作用（图2d）降低了INSIG1/2与[3H] 25-羟基胆固醇的结合亲和力。相比之下，对于INSIG1（S207A）（图2e）和INSIG2（S151A）的结合亲和力没有变化。同样，从IGF1处理过的亲代Huh7细胞中免疫沉淀的野生型INSIG1/2（而不是INSIG1（S207A）或INSIG2（S151A））显示出与[3H] 25-羟基胆固醇的结合减少，而免疫沉淀的Huh7细胞中敲入PCK1(S90A)的野生型INSIG1/2的结合亲和力不受影响。磷酸化模拟突变体INSIG1（S207E）和INSIG2（S151E）的结合力也降低了。这些结果表明，PCK1磷酸化INSIG1/2减少了INSIG1/2与固醇的结合。
PCK1-INSIG1/2激活SREBP
INSIG1/2中固醇的释放导致INSIG1/2与SCAP相互作用的中断，SCAP-SREBP1复合物从ER向高尔基体的移位，SREBP15的核积累。正如所料，IGF1的刺激破坏了INSIG1/2和SCAP之间的联系(图3a）。通过INSIG1(S207A)/INSIG2(S151A)的敲入表达(图3a)或PCK1(S90A)，或rPCK1(S90A)的重组表达或rPCK1(C288S)，这种干扰在Huh7和Hep3B细胞中被抑制。细胞分级分析显示，IGF1处理诱导SCAP从ER转运到高尔基体，并且被INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）或PCK1（S90A）的敲入表达抑制。 这些突变体的表达也阻断了IGF诱导的SCAP与ER蛋白钙结合蛋白的共定位丧失（图3b）以及高尔基体蛋白golgin-97和SCAP的共定位。当作者表达Myc标签的SCAP时获得了类似的结果。
用IGF1刺激增加了SREBP1的裂解及其核积累（图3c）；SRE启动子驱动的萤光素酶活性； 以及与脂肪形成相关的SREBP1靶基因的mRNA和蛋白质的表达，包括脂肪酸合酶（FASN），乙酰辅酶A羧化酶ɑ（ACACA，也称为ACC1），硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD，也称为SCD1 ）和3-磷酸甘油酰基转移酶1（GPAM，也称为GPAT），以及SREBF1（编码SREBP1）（图3d）。因此，用IGF1处理导致14C-葡萄糖向甘油三酸酯和脂肪酸中的掺入增加（图3e）。 值得注意的是，所有这些IGF1诱导的作用都被INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）的敲入表达抑制（图3c-e）或PCK1（S90A）。 此外，CHL-1黑色素瘤细胞，U87胶质母细胞瘤细胞和H1993非小细胞肺癌细胞中PCK1（S90A）的表达强烈抑制了IGF1诱导的14C-葡萄糖向脂肪酸的掺入，表明PCK1 Ser90磷酸化促进的脂肪生成发生在几种类型的癌症中。 一致地，HCC细胞中PCK1（S90D）或INSIG1（S207D）/ INSIG2（S151D）的敲入表达足以诱导 SREBP1裂解。
与作者对SREBP1的观察相似，PCK1（S90A）或INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）的表达也抑制了IGF1诱导的SREBP2裂解和SREBP2介导的与胆固醇生物合成相关基因转录，例如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMGC）还原酶（HMGCR），HMGC合酶1（HMGCS1，也称为HMGCS），低密度脂蛋白受体（LDLR）和角鲨烯合酶（FDFT1） 称为SS）。 因此，PCK1介导的INSIG1/2磷酸化促进SREBP1和SREBP2的激活，以及参与脂肪形成的下游基因的表达。
因为PCK1介导的INSIG1/2磷酸化促进了固醇从其与INSIG1/2的结合中释放出来，所以作者推测这种磷酸化作用不会影响由脂质消耗引起的SREBP1的活化。不出所料，INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）或PCK1（S90A）的敲入表达并不影响脂质耗尽诱导的SCAP从ER向高尔基体的转运， SCAP与钙结合蛋白的共定位缺失和SCAP与golgin-97的共定位，SREBP1的裂解和核积累和SRE驱动的萤光素酶活性。相比之下，将HCC细胞与25-羟基胆固醇以比生理浓度（40 nM）高得多的剂量（120 nM）进行培养阻止了INSIG1/2从SCAP的解离，SREBP的裂解和增加，IGF1或模拟磷酸化PCK1和INSIG1/2突变体诱导的SRE荧光素酶活性。这些结果表明，PCK1介导的INSIG1/2磷酸化通过从INSIG1/2释放25-羟基胆固醇来促进SREBP1活化。
SREBP1可以以依赖AKT和mTORC1的方式激活，也可以独立于AKT和mTORC1激活。先前已经证明，胰岛素信号传导和AKT激活通过促进其mRNA的衰减来抑制INSIG2的表达。 此外，在固醇耗尽时，INSIG1（而不是INSIG2）被泛素化并降解。实验表明，长时间使用IGF1治疗（24-48小时），INSIG2才明显下调，这种下调在PCK1(S90A)或INSIG1(S207A)/INSIG2(S151A)突变体中没有发生。相比之下，用IGF1和环己酰亚胺（CHX）处理HCC细胞（消除了蛋白质表达的翻译调节）可诱导野生型INSIG1（而不是INSIG1（S207A）和野生型INSIG2或INSIG2（S151A））快速降解。另外，INSIG1（S207D）的半衰期缩短了，而不是INSIG2（S151D），表明INSIG1Ser207的磷酸化促进了INSIG1蛋白的降解。但是，在存在IGF1和不存在CHX的情况下，INSIG1的总体表达没有明显改变。 这可能是由于SREBP激活导致INSIG1转录增加的结果，以反馈方式补偿了INSIG1的降解。与INSIG2表达对IGF1刺激的延迟反应相反，在IGF1处理后，检测到PCK1和INSIG1/2的磷酸化和SREBP1的快速裂解（。 因此，PCK1介导的INSIG1/2的快速磷酸化和SREBP1的激活是对AKT激活的直接响应。
从头合成脂肪酸发生在肝脏，脂肪组织和泌乳的乳房中。 用IGF1处理HL7702和THLE-2正常肝细胞，诱导PCK1 Ser90磷酸化，随后INSIG1 Ser207和INSIG2 Ser151磷酸化以及SREBP1裂解。在这些细胞中PCK1（S90D）的表达也诱导了后者的作用，这表明PCK1诱导的SREBP1的激活也在正常肝细胞中发生。
在正常的生理条件下，饭后高血糖会增加胰岛素的胰腺分泌，从而立即激活磷酸肌醇3激酶（PI3K)-AKT信号通路，并导致葡萄糖利用增加和肝脏糖异生减少。值得注意的是，禁食24小时后用葡萄糖补充的小鼠在正常肝脏中AKT，PCK1 Ser90，INSIG1 Ser207和INSIG2 Ser151的磷酸化以及SREBP1的裂解显着增强，这表明 体内血糖水平调节肝脏中PCK1介导的INSIG1/2磷酸化和SREBP1的激活。这些结果证明了作者的发现与肝的生理功能有关。
然后，作者检验了正常肝细胞和HCC细胞之间PCK1介导的SREBP1激活的潜在差异。 作者发现与正常人肝细胞相比，HCC细胞中AKT，PCK1 Ser90，INSIG1 Ser207和INSIG2 Ser151的磷酸化以及SREBP1的裂解显着增加。 这些增加通过HCC细胞中PCK1（S90A）的表达而减少，这表明PCK1介导的SREBP1激活在具有高水平AKT激活的HCC细胞中增加。
值得注意的是，在表达活性KRAS(G12V)突变体的Huh7，CHL-1，U87和H1993癌细胞中，AKT，PCK1和INSIG1/2磷酸化以及SREBP1裂解被进一步增强或诱导。PCK1（S90A）或INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）的表达抑制了这些细胞中INSIG1/2磷酸化和SREBP1的裂解。这些结果表明，PCK1介导的SREBP1激活是由AKT激活诱导的，AKT激活是由不同的癌基因或生长因子引起的，并发生在几种类型的癌症中。
图3 PCK1介导的INSIG1/2磷酸化从ER释放SCAP并促进SREBP1激活以促进脂肪形成
PCK1-INSIG1/2促进HCC生长
值得注意的是，PCK1（S90A）在不同的HCC细胞系中的重组表达降低了INSIG1 Ser207和INSIG2 Ser151的磷酸化的基础水平以及SREBP1的裂解，在正常培养条件下抑制了细胞的增殖，但没有改变SREBP1的裂解和由脂质消耗诱导的细胞存活率的降低。同样，INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）或PCK1（S90A）的敲入表达抑制了Huh7细胞（图4a）和Hep3B细胞的增殖。 相比之下，PCK1（S90D）或INSIG1（S207D）/ INSIG2（S151D）突变体的表达增强细胞增殖。
接下来，作者通过肝内注射（图4b）和皮下注射向裸鼠中注射具有或不具有PCK1（S90A）或INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）敲入表达的Huh7细胞。这些突变蛋白的表达基本上抑制了小鼠的肿瘤生长（图4b），相应地，Ki67表达降低，细胞凋亡增加。 此外，PCK1（S90A）的表达减少了INSIG1 Ser207和INSIG2 Ser151的磷酸化，并减少了SREBP1的表达和核分布（图4c）。INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）的表达也降低了SREBP1的核水平（图4d）。 相比之下，PCK1（S90D）或INSIG1（S207D）/ INSIG2（S151D）的表达促进肿瘤生长。
与AKT–PCK1信号激活SREBP1的发现一致，Huh7细胞中活性IGF1R（V922E）或myr-AKT的表达显着增加了肝肿瘤的生长，以及PCK1 Ser90和INSIG1 Ser207 / INSIG2 Ser151的磷酸化增强，SREBP1的核表达增强。PCK1（S90A）或INSIG1（S207A）/ INSIG2（S151A）的敲入表达既抑制了基础肿瘤的生长，又抑制了由IGF1R（V922E）或myr-AKT诱导的基础肿瘤的生长。相比之下，显性阴性IGF1R（L1003R）突变体的表达降低了肝内和皮下肿瘤的生长，同时降低了PCK1和INSIG1/2的磷酸化和减少SREBP1核积累。PCK1（S90D）或INSIG1（S207D）/ INSIG2（S151D）的表达部分逆转了肿瘤生长的减少和核SREBP1表达。
此外，作者在小鼠中使用基于流体动力学的转染方法，与野生型PCK1或PCK1（S90A）一起使用质粒表达活性myr–AKT，c-Met和睡眠美容转座酶（诱导肝脏肿瘤快速生长）的表达。 PCK1（S90A）的表达减少了肿瘤的生长，Ki67的表达，INSIG1/2磷酸化和核SREBP1的表达。因此，PCK1介导的INSIG1/2磷酸化和随后的SREBP1激活促进了HCC的发展。
为了确定PCK1调节SREBP1激活的临床相关性，作者对30对的原发性肝癌和邻近正常组织的样本进行了免疫组织化学（IHC）分析。与正常组织相比，HCC标本中PCK1 Ser90和INSIG1 Ser207 / INSIG2 Ser151的磷酸化以及核SREBP1表达显着增加，并且在90例切除的HCC肿瘤中彼此相关（图4e）。值得注意的是，在HCC样本中，PCK1 Ser90和INSIG1 Ser207 / INSIG2 Ser151的高水平磷酸化以及SREBP1核表达高水平与HCC患者的总生存期缩短有关（图4f）。这些结果表明，PCK1介导的INSIG1/2磷酸化在人类HCC的临床侵袭性中具有关键作用。
代谢和基因表达是两个基本的细胞过程，对肿瘤细胞的增殖至关重要，并且可以相互调节。 PCK1最初被表征为糖异生酶。 在本文中，作者已经显示PCK1具有蛋白激酶活性，并易位至ER以调节SREBP1激活和SREBP1介导的基因表达。 作者还证明了代谢酶使用GTP而不是ATP作为磷酸盐供体来磷酸化蛋白质底物。 此外，作者已经表明，致癌信号传导可以快速调节INSIG1/2与固醇之间的结合，而不会降低细胞总固醇水平。 作者的发现突出了抑制PCK1蛋白激酶活性作为人类HCC治疗策略的潜力。
图4 PCK1介导的INSIG1 / 2磷酸化促进肝肿瘤生长，并与肝癌预后不良相关
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