编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。
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胰腺癌(PC)是恶性肿瘤中高死亡率的肿瘤之一，其发病机制复杂，潜伏期长，导致早期诊断手段严重缺乏。为了改善临床诊断和提高治疗效果，我们采用了最新开发的精确靶向代谢组学方法鉴定和验证PC患者血浆样本中的代谢生物标志物，这能够灵敏而有效地诊断疾病的实时进展。许多不同的代谢物有能力明显区分PC患者(n = 60)和健康者(n = 60)。为了进一步提高代谢生物标志物的特异性和选择性，我们采用PC患者的肿瘤组织和其配对正常组织进行临床验证。我们最终在血浆中验证了5种新的代谢生物标志物(肌酸、肌苷、β-谷甾醇、鞘氨酸和甘胆酸)，它们可用于临床诊断胰腺癌。令人兴奋的是，我们通过将这五种代谢产物整合到一个模式中，提出了一种panel生物标志物，说明与传统的生物标志物(CA125、CA19-9、CA242和CEA)相比，它对胰腺癌的诊断具有更高的准确性和特异性；并且这种用于PC诊断的血浆panel生物标志物在临床应用中相当方便。使用相同的代谢组学方法，我们发现琥珀酸和葡萄糖酸对胰腺癌不同阶段的进展和转移具有很强的监测能力。总之，该代谢组学方法可以用来识别和验证代谢生物标志物，这些生物标志物可以在临床中准确、灵敏地诊断胰腺癌的实时进展和转移。此外，临床医生应该努力把握正确的时间以尽早地有效治疗干预，这可以大大提高PC患者的五年生存率，显著降低临床死亡率。
论文ID
原名：Metabolomicsidentified new biomarkers for the precise diagnosis of pancreatic cancer andassociated tissue metastasis
译名：代谢组学为胰腺癌及相关组织转移的精确诊断提供新的生物标志物
期刊：Pharmacological Research
IF：5.574
发表时间：2020.4.8
通讯作者：吕海涛
通讯作者单位：上海交通大学系统生物医学研究院
实验设计
精确靶向代谢组学方法的工作流程，用于识别和验证生物标志物，以诊断胰腺癌的实时进展和转移。
图1 精确靶向代谢组学方法的工作流程
实验结果
1. 胰腺癌患者和健康志愿者的临床特征
本研究的临床特征见表1。58例接受胰腺癌切除术的患者根据第8版AJCC癌症分期手册进行胰腺癌分期。两名患者拒绝接受进一步的治疗和手术，也没有记录他们的肿瘤分级。本研究还考虑到存在转移，因此以发现潜在的代谢生物标志物来早期诊断疾病和预测高转移的潜力。
2. 血浆代谢组学鉴定了PC患者和健康者之间显著的代谢变化
采用我们新开发的精确靶向代谢组学方法，比较分析了60例PC患者和60例健康对照人群的血浆样本，并采用有监督的PLS-DA模型分析代谢变化，以灵敏地将患者与健康者区分开来。该模型对Q2的识别率为73.8%，对R2的识别率为81.9%，得分图显示了两组间的明显差异，即PC1(39.2%)及PC2(6.5%) (图2A)。热图分析显示PC患者和健康者之间在代谢分化中的差异代谢物(图2B)。
3. 统计差异代谢物以捕捉PC患者和健康者之间的代谢变化
28种代谢物的表达水平在PC患者和健康人群之间存在显著差异，并且与健康者相比，PC患者中有18种代谢物上调。此外，将这些不同的代谢物进行热图可视化分析，以获得在临床中随着PC的发展而发生的代谢变化。排名前10位的差异代谢物依次排列为：糖胆酸、胍丁胺、褪黑素、β-谷甾醇、鞘氨酸、次黄嘌呤、亚精氨酸、马尿酸、肌酸和肌苷(图2B)。这些差异代谢物共同构成了PC独特的代谢特征，包括嘌呤代谢紊乱、甘氨酸和丝氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、类固醇生物合成、鞘脂类代谢和胆汁代谢。
4. 组织代谢组学揭示了高选择性和特异性的血浆生物标志物可以诊断PC
由于血浆代谢物广泛被生物合成并在全身循环，但只有组织代谢物才能进入血液，所以它能发挥生物标志物的作用，能够灵敏、特异地诊断胰腺的生理和病理状态。为了进一步准确地验证血浆生物标志物而使其能诊断PC，我们利用六个配对样本，即胰腺癌组织(PCTs)和相邻的非癌组织(ANTs)，采用靶向代谢组学方法对之前描述的10种差异代谢物进行特异性检测，其中肌酸、肌苷、β-谷甾醇、鞘氨酸和糖胆酸的表达水平与血浆样品一致(图3)。因此，我们可以得出结论，这些差异代谢物可以被视为具有临床诊断PC能力的生物标志物。
5. 代谢生物标志物与临床特征的相关性分析
为了研究PC患者的代谢变化是否也因个体间的生理差异而引起，比如性别、年龄以及疾病的发展，我们进行了spearman相关系数分析，这表明糖胆酸、β-谷甾醇、鞘氨酸和肌苷与性别和年龄无关，说明它们可以作为生物标志物，并能忽略年龄和性别的干扰，准确诊断PC患者。然而，观察到肌苷受年龄的轻微影响，有显著差异(p=0.020)。此外，由于患者处于不同的PC分期，那淋巴结转移或远处转移是否也会引起代谢差异，我们发现血浆中肌苷水平与淋巴结转移分期的患者存在一定的相关性，这说明肌苷可以作为诊断PC转移的生物标志物。
6. 个体差异代谢物作为生物标志物在临床上可以精确诊断PC
识别早期疾病诊断的代谢物生物标志物对患者的生存具有决定性的影响。为了验证这些潜在生物标志物的选择性和特异性，我们使用GraphPad Prism软件来展示各个代谢物的ROC曲线。糖胆酸、谷甾醇、鞘氨酸、肌氨酸和肌酸为主要代谢物，用SPSS 16.0软件绘制它们的多变量ROC曲线。计算五种血浆代谢物的AUCs，评价其作为PC个体生物标志物的诊断效能。结果表明，只有糖胆酸的AUC值较低，为0.7064，其他均大于0.95(图4)，说明肌酸、肌苷、β-谷甾醇和鞘氨酸有能力作为代谢产物的生物标志物，可以有效诊断PC。为了提高生物标志物的特异性和选择性，我们提出了一种panel生物标志物的策略，将四个代谢生物标志物组合成一个生物标志物簇。我们的数据显示，与任何单个的生物标志物相比，panel中的5个生物标志物具有极高的诊断能力(AUC = 1)，并具有极高的选择性和特异性(图4)。
7. 这组生物标志物的准确性和特异性要远高于传统的PC诊断生物标志物
CA19-9、CA125、CA242和CEA是目前临床上诊断PC常用的生物标志物。从表2中可以看出，PC患者的年龄、性别、疾病分期等差异均无统计学意义。为了诊断PC，临床医生会分析血清中CA125、CA19-9、CA242和CEA的水平，以确认它们是否分别高于35 U/mL、37 U/mL、20 U/mL和5 ng/mL的临界值。然而，这些生物标志物在PC诊断中缺乏敏感性和特异性，一些PC患者不能通过测量单个生物标志物而被准确诊断(图5A)。其中，CA19-9的诊断性能优于其他，几乎所有PC患者血清中CA19-9水平均高于37 U/mL临界值，但有9例患者未能正确诊断。为了评估我们的生物标志物的诊断性能，我们设定这9例特殊病例为未知组，调查它们的糖胆酸、β-谷甾醇、鞘氨酸、肌氨酸和肌酸水平的变化。然后进行PLS-DA分析，发现这9个PC样本与健康者聚类完全不同，它们能完全聚类到PC组中(图5B)。简而言之，我们的生物标志物比传统的诊断生物标志物更准确，为PC患者提供了更加灵敏和高选择性的诊断，它有潜力作为一个更精确的诊断工具来诊断PC。
8. 代谢生物标志物可用于诊断PC的进展和转移
缺乏正确的诊断癌症转移常常会导致PC高死亡率。为了寻找代谢物的生物标志物来有效地诊断PC的进展和转移，我们采用相同的代谢组学方法来分析转移过程中PC不同阶段的血浆代谢物。结果表明，鉴别PC I期、II期、III期和IV期病例，很难发现明显改变的代谢物(图6A)，尽管我们发现鉴定出的生物标志物有轻微的变化(琥珀酸和葡萄糖酸)。然而，当这些PC病例分为非转移性PC组和转移性PC组时，观察到这两种生物标志物能有效诊断到PC转移组，且呈线性增加(图6B)。此外，我们选用细胞系hTERT-HPNE (正常胰腺细胞)、BxPC-3(原代PC细胞)和su86.86. (PC转移细胞)测定两种血清生物标志物的变化水平来评估其诊断性能。在细胞系和血浆样本中都可以观察到这两种生物标志物的一致变化模式(图6B和C)。总之，琥珀酸和葡萄糖酸在PC细胞中失调，然后排泄到血液中，所以血浆中琥珀酸和葡萄糖酸有可能作为生物标志物来有效诊断癌转移。此外，由于这两种代谢生物标志物可以清楚地反映细胞内PC的进展，所以我们下一步要探究实验模型的生物合成、利用、代谢和分子调控是否可以阐明PC的肿瘤发生。本文作者对影响PC发病、发展和转移最为显著的代谢途径进行了注释，戊糖磷酸途径、TCA循环、氨基酸代谢和脂质代谢均发生紊乱，推测可能与PC的肿瘤发生有关(图7)。
结论
采用我们新开发的精确靶向代谢组学方法，我们成功地鉴定了血浆生物标志物(肌酸、肌苷、β-谷甾醇、鞘氨酸和糖胆酸)，它们可以有效地将PC患者与健康人群区分开来，从而精确地诊断PC，并已通过与PC相关的组织和细胞系的差异代谢组学分析得到了验证。我们提出了一种panel生物标志物的策略，以获得比单个生物标志物更高灵敏度和选择性的诊断性能，令人兴奋的是，与特异性和选择性较低的传统PC生物标志物(CA19-9、CA125、CA242和CEA)相比，panel生物标志物具有极高的准确性。此外，我们还发现了两种血浆生物标志物(琥珀酸和葡萄糖酸)，它们可以有效地诊断PC的进展和转移。简而言之，发病潜伏期常常导致PC的晚期诊断和高死亡率，我们新的生物标志物能有效诊断PC的进展和转移，这样我们可以从代谢角度在早期准确地诊断PC，并监测PC转移能力，从而使临床医生在PC发展的不同阶段实现PC的预防和治疗。最后，临床医生采取最佳的治疗窗，以极大地改善患者的治疗效果和提高5年生存率。
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.phrs.2020.104805
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