科研| Theranostics：小白菊内酯通过肠道菌群调节Treg/Th17平衡改善结肠炎症（国人佳作）

编译：草重木雪，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

炎症性肠病(IBD)是一个全球性的健康问题，肠道菌群失调在其中起着重要的致病作用。然而，目前用于IBD治疗的药物还远远不够理想。已有研究表明，小白菊内酯(PTL)不仅具有抗癌作用，而且具有较强的抗炎作用。本文探讨PTL对结肠炎症的保护作用，揭示其肠道微生物依赖机制。以小鼠体重变化、死亡率、结肠长度、疾病活动度指数(DAI)评分、H&E染色及结肠镜检查评价来评估小鼠结肠炎症严重程度。通过16S rRNA测序和靶向代谢组学分析肠道微生物改变和短链脂肪酸(SCFAs)的产生。采用细胞因子芯片和酶联免疫吸附试验(ELISA)测定结肠细胞因子水平。采用流式细胞术对固有层和脾脏的免疫细胞频率进行表型分析。发现经小白菊内酯处理的小鼠结肠炎症明显减轻，体重减轻、存活率降低、结肠长度缩短、DAI评分、组织学评分和结肠镜检查评分均降低。值得注意的是，当使用抗生素混合物耗尽肠道微生物群时，PTL对结肠炎症的保护作用消失。PTL治疗下调促炎细胞因子表达的水平,包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17A和上调结肠组织免疫抑制细胞因子IL-10。16S rRNA测序显示，经PTL处理的小鼠肠道微生物多样性和菌群组成明显丰富。靶向代谢组学分析显示，PTL治疗的小鼠SCFAs生成增加。此外，PTL给药可选择性地上调结肠(Treg)细胞以及下调结肠辅助T型17(Th17)细胞的比例，提高了Treg/Th17的稳态。通过肠道微生物消耗和粪便微生物移植(FMT)证实了这一肠道微生物依赖机制。从而证明PTL以肠道微生物依赖的方式改善结肠炎症。其潜在的保护机制与肠道粘膜中Treg/Th17平衡的改善有关，这是通过增加微生物源性SCFAs的产生介导的。总的来说，该研究证明了PTL作为一种潜在的肠道微生物群调节剂在预防和治疗IBD中的作用。

论文ID

原名：Parthenolideameliorates colon inflammation through regulating Treg/Th17 balance in a gut microbiota-dependentmanner

译名：小白菊内酯通过肠道菌群调节Treg/Th17平衡改善结肠炎症

期刊：Theranostics

IF：8.063

发表时间：2020.04

通讯作者：赵晓晏、杨仕明

通讯作者单位：重庆第三军医大学新桥医院消化内科

实验设计

在本研究中，首次研究了PTL给药对结肠炎症的影响。目的:探讨肠道微生物群在PTL的保护中的作用，采用DSS诱导结肠炎、肠道菌群衰竭和粪便菌群移植(FMT)。最后，对肠道微生物依赖的潜在机制进行了探讨。

1.    DSS诱导急性肠炎

为了诱导急性实验性结肠炎，小鼠给予1.5-3.0% (w/v)右旋糖酐硫酸钠DSS在饮用水中添加7天，然后是7天正常水。Parthenolide (PTL) PTL+DSS组小鼠从第0天至第14天腹腔注射(10 mg/kg)盐水悬液，直至实验结束。DSS组小鼠腹腔注射生理盐水作为阴性对照。为避免因注射引起的腹腔感染，严格在无菌条件下操作。在所有的结肠炎模型中，每天检查小鼠的发病率和体重。每天对每只小鼠的病理特征进行评分，包括粪便粘稠度、血便和体重减轻。结合个体得分产生疾病活动度指数(DAI)，每只小鼠每日计算一次。根据参数分配0-4评分系统，最高分为12分。

2.    组织病理学

取结肠粪内容物，沿肠系膜边缘纵向切开，近端至远端形成瑞士卷，置于10%中性福尔马林缓冲液中24h。瑞士卷被转移到70%的乙醇,然后加工石蜡包埋块生成5 µm厚的部分用于苏木精和伊红染色。切片由经验丰富的病理学家以盲法进行评估，组织学评分基于以下参数:炎症、上皮缺陷、隐窝萎缩、发育不良/瘤变、发育不良影响的区域。

3.    结肠镜检查

使用高分辨率小鼠视频内镜系统对实验小鼠进行结肠镜检查。用1.5%到2.0%的异氟醚麻醉小鼠，然后用给结肠充空气使3厘米的近端结肠可视化。根据以下参数，对结肠炎的严重程度进行盲法评分：结肠半透明(0-3)，纤维蛋白附着于肠壁(0-3)，粘膜颗粒状外观(0-3)，血管形态（0-3），大便特征:正常至腹泻(0-3)，腔内存在血液(0-3)，生成的最大得分为18。

4.    粪便基因组DNA提取和16S-rRNA测序

根据制造商的方法，利用E.Z.N.A.^®土壤DNA试剂盒从0.1 g冷冻粪便样本中提取粪便基因组DNA。用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度和纯化。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。扩增文库覆盖细菌16S-rDNA的V3-V4高变区，使用引物341F：5′-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3′，以及806R: 5′-GGACTACVV GGGTATCTAATC-3′扩增。20μl混合物包含5个4μlFastPfu缓冲区,2μl 2.5 mM dNTPs，0.8μl每个引物(5μM) 0.4μlFastPfu聚合酶以及模板DNA 10ng中进行PCR。PCR初始变性95℃ 3 min，95℃30s27个循环，55℃退火30 s在72°C时延伸45秒，在72°C时最终延伸持续10分钟。反应在热循环PCR系统中进行。所有PCR产物均用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化以及使用QuantiFluor™-ST进行定量。根据Majorbio Bio-PharmTechnology Co.的标准方法，纯化和汇集扩增子文库在Illumina MiSeq平台上配对测序(2×300)。

5.    细胞因子微阵列试验

结肠外植体培养按以前方法实施。纵向切开的结肠用含2×青霉素-链霉素的冰PBS清洗。由于结肠内不同区域结肠炎的严重程度存在差异，我们使用3毫米皮肤穿孔工具从相同的远端结肠区域生成3至4个明确的圆形活检样本进行具体分析。将单个活检样本转移到含有0.5mL无菌细胞培养基的48孔板的孔中，并在37℃的细胞培养箱中孵育15小时。离心收集上清液，除去碎片，根据制造商方法，使用Luminex Bio-Plex系统评估细胞因子。

6.    酶联免疫吸附试验(ELISA)

将结肠组织称重，放入900 mL生理盐水中，超声提取后以3000转/分离心10分钟，获得结肠组织匀浆。用ELISA试剂盒按说明书检测结肠组织匀浆中的细胞因子包括IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α。捕获抗体(1:200)附着于4℃板上过夜。阻断后，样品室温孵育2 h，后与检测抗体(1:200)孵育1 h。随后加入与辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素，30 min后加入底物。最后，用微平板阅读器检测吸光度值。细胞因子浓度按标准曲线计算。

7.    靶向SCFAs定量分析

粪便样本(10毫克)加入10 μl内标(0.0125 μl/μl 2-甲基丁酸)和500μl甲醇，然后按照制造商的方法进行提取。提取的样品在6890A-5973C GC-MS系统检测。SCFAs标准品为乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐和异戊酸盐的混合物。

8.    粪便微生物移植(FMT)

简单地说，8-10周龄雄性C57BL/6小鼠接受抗生素鸡尾酒疗法(万古霉素，100 mg/kg；硫酸新霉素，200毫克/公斤；甲硝哒唑200毫克/公斤;和氨苄青霉素) 每日一次，共5天，以消耗肠道微生物群。收集PTL+DSS组和DSS组供鼠粪便，用PBS重悬成0.125 g/mL，每天灌胃0.15 mL，连续灌胃5天。

9.    流式细胞术分析

对于细胞内细胞因子IL-10和IL-17A染色，在37°C下5%的二氧化碳条件下首先用离子霉素和PMA刺激单核细胞分离。将GolgiStop蛋白转运抑制剂加入到细胞悬液后，将细胞在于37°C下5％CO₂中再孵育3小时。然后用活/死染料和表面标记物在黑暗中4°C染色30min，然后用固定/渗透工作液和渗透缓冲液在黑暗中常温固定渗透细胞20min。最后，用抗IL-10或抗IL-17A抗体染色细胞。为了分析转录因子Foxp3⁺的表达百分率，首先用活/死染料和CD45、CD4、CD25表面标记物在黑暗中4°C下对分离的单核细胞进行染色30分钟。固定/渗透工作溶液以及渗透缓冲液在黑暗中常温下固定和渗透细胞20 min。最后，用抗Foxp3⁺抗体染色细胞。

10. 流式细胞术的抗体

抗体包括PerCP标记抗小鼠CD45抗体，亮紫色510标记抗小鼠CD4抗体，PE标记抗小鼠CD25抗体，FITC标记的抗小鼠IL-10抗体，PE标记抗小鼠IL-17A抗体，Alexa Fluor 647标记抗小鼠Foxp3抗体及同型对照，BV421标记小鼠Foxp3抗体及同型对照。

实验结果

1.    PTL治疗改善了DSS诱导的结肠炎

为了研究PTL是否对IBD有治疗作用，我们采用了DSS诱导的小鼠结肠炎模型。连续7天在小鼠的饮用水中加入3.0%的DSS后用正常水7天。PTL悬液于生理盐水中，从第0天至第14天给PTL+DSS组小鼠腹腔注射有PTL的生理盐水（图1A）。与DSS组相比，PTL明显改善了DSS诱导的结肠炎，体重减轻明显(图1B)，死亡率降低(图1C)，结肠缩短明显减轻(图1E)。此外，基于粪便一致性、血便和体重减轻的评估的DAI评分与上述结果一致(图1D)。采用H&E染色和结肠镜检查对结肠黏膜损伤进行系统评价。相较DSS处理组小鼠出现隐窝减少、单核细胞浸润、黏膜损伤严重、组织学评分较高，PTL+DSS组小鼠表现出更少的炎症细胞浸润，结肠结构相对完整，黏膜损伤较少，组织学评分较低(图1E)。另外，DSS组小鼠的结肠镜检查评分较高(见图1G)，具体表现为颗粒状肠腔表面，有血、溃疡形成及大量炎性纤维蛋白渗出，结肠镜下录像可见(补充视频S1)。相反，PTL+DSS组小鼠的管腔表面相对光滑，血管形态清晰，无血，补充视频S2显示具有代表性的结肠镜检查视频。总之，这些结果表明PTL治疗显著改善了DSS诱导的结肠炎。

图1 PTL治疗改善了DSS诱导的实验性结肠炎。(A)为了评估实验性结肠炎和修复，两组年龄在8-10周的WT小鼠给予3.0% DSS口服7天，然后继续正常饮水7天。腹腔注射DSS组和PTL+DSS组100μl盐水或100μl PTL解决方案从0到14天,分别。(B)体重变化。(C)的生存。(D)疾病活动度指数(DAI)评分。(E)结肠外观和结肠长度的代表性图片。(F)具有代表性的显微照片(放大40倍和200倍)和组织学评分。(G)具有代表性的结肠镜检查图像及结肠镜检查评分。(A-G)每组n = 10只小鼠，平均值±SD，p值采用非配对t检验* p< 0.05，** p<0.01，***p< 0.001。数据来自三个独立的实验，每组10只老鼠

 

2.    PTL以肠道微生物依赖的方式减轻结肠炎

虽然IBD的确切病因和发病机制尚不清楚，但大量证据表明，肠道菌群改变的失调反应导致了IBD的发生使肠道微生物群成为IBD治疗的新靶点。为了研究肠道菌群是否参与PTL对于DSS-induced结肠炎的保护作用，在DSS处理前，野生型小鼠灌胃四联抗生素混合剂以减少肠道微生物群。由于有报道称肠道微生物减少的小鼠对DSS的敏感性增强，我们在经过抗生素治疗的小鼠的饮用水中使用1.5%的低剂量DSS，持续7天，然后使用正常饮水，再持续7天(图2A)。令人惊讶的是，ABX（DSS）组小鼠和ABX（PTL+DSS）组小鼠显示出难以区别的体重减轻（图2B），死亡率（图2C），结肠长度（图2E），DAI评分（图2D），组织学评分（图 2F）和肠道菌群耗竭后的结肠镜检查评分（图2G）。镜下典型H&E染色图像及结肠镜检查图像见图2F-G。这些结果表明，PTL对结肠炎症的抗炎保护作用是依赖肠道微生物的。

图2 肠道菌群耗尽后PTL对DSS诱导结肠炎的保护作用消失。(A) WT小鼠在DSS治疗前，进行为期5天灌胃抗生素的肠道菌群耗竭疗程。ABX (DSS)和ABX (PTL+DSS)组分别为100μl腹腔内注射生理盐水或100μl PTL从0到14天。(B)体重变化。(C)生存。(D)DAI得分。(E)结肠外观和结肠长度的代表性图片。(F) H&E染色的代表性显微照片(放大40倍和200倍)和组织学评分。(G)具有代表性的结肠镜检查图像及结肠镜检查评分。(A-G)每组n = 10只小鼠，平均值±SD，p值采用非配对t检验* p< 0.05，** p<0.01，***p< 0.001。数据来自三个独立的实验，每组10只老鼠。

 

3.    粪便微生物移植减轻结肠炎

进一步确认PTL-处理鼠减轻结肠炎是否取决于肠道微生物群,我们在肠道菌群耗尽的野生型老鼠(GD WT)进行粪便微生物群(FM)移植实验，用DSS-处理小鼠(FM (DSS)→GD WT)和PTL-处理鼠(FM (PTL+DSS)→GD WT)的微生物群通过灌胃给药，每日一次，连续5天进行重组(图3A)。为了更好的菌群定殖，实验小鼠灌胃抗生素鸡尾酒，以创造FM前肠道微生物群耗尽条件。相比DSS-处理供体FM移植(FM (DSS)→GD WT)，PTL-处理供体的FM转移到GD WT宿鼠(FM (PTL+DSS)→GD WT)的结肠炎症明显较低,体现在体重减少(图3B),死亡率(图3C),和DAI得分(图3D)都降低,但结肠长度(图3E)更长。与FM(PTL+DSS)→GD WT的结肠相比，FM (PTL+DSS)→GD WT结肠组织的H&E染色表现出结肠更少的炎症细胞浸润，相对更完整的结肠结构，较少黏膜损伤以及较低组织学评分(图3F)。结肠镜检查图像及结肠镜检查评分结果与上述观察结果一致(图3G)，这些FMT结果表明，PTL处理小鼠的肠道微生物群对减轻结肠炎症有作用。

图3 粪便微生物移植减轻DSS诱导的实验性结肠炎。(A) WT小鼠在FMT前进行为期5天的肠道微生物群耗竭口服抗生素疗程。小鼠灌胃FMT后5天，肠道休息3天，正常饮水后7天，给予3.0% DSS处理。(B)体重变化。(C)生存。(D)DAI得分。(E)结肠外观和结肠长度的代表性图片。(F) H&E染色的代表性显微照片(放大40倍和200倍)和组织学评分。(G)具有代表性的结肠镜检查图像及结肠镜检查评分。(A-G)每组n = 10只小鼠，平均值±SD，p值采用非配对t检验* p< 0.05，** p<0.01，***p< 0.001。数据来自三个独立的实验，每组10只老鼠。

4.    PTL处理显著改变了肠道菌群的多样性和组成

确定PTL处理是否改变了微生物组，我们对PTL+DSS组和DSS组小鼠粪便细菌DNA中的16S rRNA进行了高通量基因测序分析。我们最初通过不同的方法使用一个广义线性模型来测量肠道微生物的alpha多样性。一致地，不同的指数包括观察到的分类学单位(OTUs)、Chao、Shannon和Simpson也表现出类似的倾向，并且PTL处理组的体内alpha多样性明显高于dss处理组(p < 0.05)，每个alpha多样性指数分别为p <0.005、p <0.005、p <0.005和p <0.005(图4A)。为了扩展我们对微生物群落多样性作用的理解，我们使用Bray-Curtis度量距离、unweight - unifrac距离和Weighted-UniFrac距离算法来生成主坐标分析(PCoA)计算beta多样性。OTUs之间明显的聚类分离揭示了两个群体之间不同的群落结构，表明这两个群体在组成结构上是不同的（图4B-D）。

随后，我们评估了所有可用样本的肠道微生物区系，以进一步研究PTL+DSS组与DSS组之间的潜在组成差异。在门水平方面，所有样本均具有相似的分类学群落，并表现出较高的拟杆菌门和厚壁菌门丰度(补充图S1A)。拟杆菌门是最主要的门，在PTL+DSS组和DSS组中分别占肠道菌群的64.28%和61.21% (p = 0.80)(补充图S1B)。厚壁菌门是两组中第二主要的门，分别占29.45%和28.40% (p = 0.85)(补充图S1C)。一致地，两组之间的厚壁菌与拟杆菌的比率（F/B）没有统计学差异（p> 0.05）（补充图S1D）。比较了PTL+DSS组与DSS组在类/目/科水平上的分类组成(补充图S2A-S2C)。在属水平上，两组表现出不同的生物组成(补充图S3A)。对相对丰富>1%的菌属进行了分析，特别地，Alloprevotella (30.75% vs 4.08%;p< 0.001, q < 0.001) 在PTL+DSS组相对丰度较高，而拟杆菌属(分别为4.40%和29.58%; p < 0.001、q < 0.001)相对丰度低于DSS组(补充图S3B)。补充图S3C-D展示了这两个组每个样品的Alloprevotella和Bacteroides的相对丰度。

为了确定PTL治疗改变了哪些细菌，进而影响了DSS诱导的结肠炎的疾病进展，我们使用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析进行高维类比较从而发现两组细菌群落优势的显著差异(图4E-F)。根据分析结果，Bacteroidaceae (拟杆菌科和属)和乳酸菌属(从杆菌纲到乳酸菌科)是导致DSS组肠道菌群失调的主要细菌类型。

然而，在PTL+DSS组中，Prevotellaceae (Alloprevotella科和属)、Rikenella和Fournierella表现出相对富集，这可能与PTL介导减轻结肠炎有关。其中，Alloprevotella属的LDA得分最高，为5.33 (p=0.0002)，其次为Fournierella评分为4.93 (p=0.0009)。基于属水平的OTU丰度，我们还组织了两组之间肠道菌群分析的热图比较(图4G)。同样，Alloprevotella属在PTL+DSS组中表现出较高的丰度，而Bacteroides属在DSS组中显著富集，这与LEfSe分析结果一致。总的来说，PTL处理显著改变了肠道菌群的多样性和组成。 

图4 PTL处理显著改变了肠道菌群的多样性和组成。(A) Alpha多样性箱线图(观察物种，Chao, Shannon和Simpson相互作用)。(B)利用Bray-Curtis度量距离进行主坐标分析(PCoA)计算beta多样性。(C) PCoA使用非加权unifrad计算beta多样性。(D) PCoA使用加权unifrad计算beta多样性。(E) LEfSe的分类学图，描述了DSS和PTL+DSS组的微生物群落之间的分类学关联。每个节点代表一个特定的分类类型。黄色节点表示DSS组和PTL+DSS组分类学特征不显著。橙色节点表示PTL+DSS组的分类类型比DSS组丰富，蓝色节点表示DSS组的分类类型比PTL+DSS组丰富。(F)通过DSS组和PTL+DSS组差异丰富的特征计算LDA评分。特征选择的标准是log LDA score > 3.6。(G)在属水平上选择的差异最丰富特征热图。蓝色代表较少的丰度，白色代表中间的丰度，红色代表最丰富的丰度。

5.    PTL处理增加代谢物SCFAs

之前的16S rRNA测序分析显示PTL+DSS组肠道菌群以Alloprevotella属、Rikenella属和Fournierella属为主，都与SCFAs代谢相关。众所周知，肠道微生物群代谢产物SCFA在维持肠道动态平衡中起着关键作用，并且在IBD患者以及DSS诱发的小鼠结肠炎中观察到SCFA浓度降低。为了研究细菌群落的变化是否对微生物代谢量产生影响，采用靶向代谢组学方法对盲肠内容物和粪便样本中的SCFAs浓度进行评估。与微生物群落结构和组成的变化相一致，PTL+DSS组和DSS组的SCFAs谱完全不同(图5A)。PTL+DSS组盲肠和粪便中表现出了更高的乙酸盐(盲肠:p <0.01，粪便:p<0.01)、丙酸盐(盲肠: p<0.01 &粪便p = 0.03)、异丁酸盐(盲肠:p<0.01 &粪便p < 0.01)、丁酸盐(盲肠: p <0.01 &粪便p < 0.01)。虽然异戊酸酯(盲肠:p = 0.04和粪便:p > 0.05)和戊酸酯水平(盲肠:p > 0.05 &粪便:p > 0.05)没有明显差异, 但PTL+DSS组盲肠和粪便总SCFAs(盲肠:p < 0.01和粪便:p< 0.01)明显高于DSS组。

研究PTL给药肠道微生物群改变后代谢产物SCFAs的产生是否增加，FMT组间也进行了靶向代谢产物SCFAs研究。正如预期的那样，FM（PTL+DSS）和FM（DSS）组之间的SCFAs产生显示出与PTL+DSS和DSS组相似的趋势(图5 B)。FM(PTL+DSS)组盲肠和粪便样本的醋酸盐(盲肠:p<0.01 &粪便:p < 0.01)，丙酸盐(盲肠:p < 0.01 &粪便:p < 0.01)，异丁酸盐(盲肠:p < 0.01 &粪便:p)，丁酸盐(cecum: p < 0.01，粪便:p < 0.01)浓度均显著高于FM(DSS)组。FM(PTL+DSS)组盲肠和粪便总SCFAs(盲肠:p<0.01&粪便:p<0.01)明显高于FM(DSS)组。总的来说，PTL处理调节了肠道细菌的群落结构和组成，这与代谢产物SCFAs水平的增加有关。 

图5 PTL处理提高了微生物代谢产物SCFA的产量。(A) PTL+DSS组和DSS组盲肠内容物和粪便中SCFA的浓度。组间差异采用Wilcoxon检验，显著性差异有:醋酸盐:盲肠盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;丙酸钠: 盲肠p <0.01 &粪便p = 0.03，异丁酸:盲肠p <0.01 &粪便p <0.01，丁酸: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;同戊酸盐:盲肠p = 0.04，粪便p= 0.05，戊酸盐:盲肠p>0.05和粪便p>0.05;总SCFA: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01。(B) FM(PTL+DSS)和FM(DSS)组盲肠内容物和粪便中SCFA的浓度。醋酸盐: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;丙酸钠: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01，异丁酸: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01，丁酸: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01;同戊酸盐:盲肠p>0.05和粪便p>0.05，戊酸盐:盲肠p>0.05和粪便p>0.05;总SCFA: 盲肠p <0.01 &粪便p <0.01。(A-B)每组n = 6只小鼠，取平均值±SD, p值采用非配对t检验。

6.    PTL可下调DSS诱导的结肠炎的促炎细胞因子和上调抗炎细胞因子

考虑到代谢物SCFAs的抗炎和免疫抑制作用，采用Luminex细胞因子芯片检测PTL给药后肠粘膜细胞因子谱的变化。火山图(图6A)显示PTL介导的差异表达细胞因子(DECs)，热图显示前20个DECs (图6B)。与DSS组相比，PTL+DSS组促炎细胞因子显著减少,尤其是IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-6、IFN-γ、IL-17A、RANTES、IL-1α。相反，PTL+DSS组抗炎细胞因子IL-4和IL-10显著升高(图6A-B)。采用ELISA法测定结肠组织20 DECs蛋白水平。其中两组之间的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-17A差异显著(图6C)，这与细胞因子芯片结果一致。值得注意的是，与DSS组相比，接受PTL治疗的小鼠的结肠组织中免疫抑制细胞因子IL-10大约增加了5.52倍。

结肠组织的细胞因子谱也在肠道微生物群消耗组中进行。引人注目的是,促炎细胞因子，包括IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-17A，和抗炎细胞因子IL-10表现出类似的水平,ABX (DSS)和ABX (PTL + DSS)组(p> 0.05)没有显著区别(图6D)。代谢组学结果显示FMT增加了代谢物SCFAs，因此我们推测FMT也会影响细胞因子的表达。如预期的那样，与FM（DSS）→GD WT的结肠相比，FM（PTL）→GD WT的结肠组织显示出较低的IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-17A和较高的IL-10蛋白水平（图6E）。综上所述，在DSS诱导的结肠炎中，PTL给药通过下调促炎细胞因子水平和上调免疫抑制细胞因子显著改变了细胞因子谱。 

图6 PTL治疗改变了结肠炎小鼠的细胞因子分布。(A) 以Luminex为基础的免疫测定法测定结肠组织上清细胞因子的火山图。(B) Luminex检测结肠组织上清细胞因子水平(PTL+DSS组，n = 8；DSS组，n = 6)。利用微阵列(SAM)的显著性分析鉴定组间组织上清蛋白水平的显著性差异(q < 0.001, fold-change > 2)。图中显示了SAM阳性蛋白的分级聚类(无监督的，欧几里德距离)热图。所有蛋白的原始平均荧光强度(MFI)在聚类前进行log2转化。(C) ELISA测定PTL + DSS和DSS组结肠组织匀浆细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-17A水平。(D) ELISA测定ABX (PTL + DSS)和ABX (DSS)组结肠组织匀浆细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-17A水平。(E) ELISA测定FM(PTL+DSS)和FM(DSS)组结肠组织匀浆细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-17A水平。(C-E)每组n = 5只小鼠，取平均值±SD。数据来自三个独立的实验，每组有5只老鼠。

7.    PTL通过调节Treg/Th17平衡形成肠道免疫应答

PTL给药后细胞因子谱发生明显改变，免疫抑制细胞因子IL-10和促炎因子IL-17A差异最显著。肠道黏膜中Treg/Th17平衡在稳定肠道微生态系统稳态中起着重要作用。为了研究PTL处理对Treg/Th17平衡的影响，采用流式细胞术对结肠固有层T细胞应答进行表型分析。每种细胞类型的相对丰度以总体CD4⁺T细胞的百分比报告，生成用于生态分析的群落数据矩阵。如补充图S4示，PTL给药后Th1(72.64% vs 76.89%;p >0.05)和Th2(6.65% vs 7.10%; p >0.05)细胞反应无显著差异。然而，对CD4⁺T细胞间室CD25和Foxp3表达的分析显示，PTL+DSS组的Treg细胞比例是DSS组的2.67倍(8.06% vs 3.01%；p < 0.05)(图7A)。与DSS组比较，PTL+DSS组具有较多的Treg细胞(p < 0.05)(补充图S5A)。由于IL-10是Treg介导的炎症抑制中关键的细胞因子，在以前的细胞因子测量结果中观察到IL-10在结肠组织中产生的升高(图6C)，并对IL-10⁺ Foxp3⁺细胞的频率和绝对数量进行评估。PTL+DSS组结肠LP中分离到的IL-10⁺Foxp3⁺细胞比例是DSS组的2.63倍(9.38% vs 3.57%;p < 0.05)(图7B)，IL-10⁺ Foxp3⁺细胞的绝对数量具有相应趋势（p <0.05）（补充图S5B）。然而，对CD4⁺ T细胞间室IL-17A表达的分析显示，PTL+DSS组的Th17细胞频率明显低于DSS组(1.67% vs 11.32%;p < 0.05)(图7C)这与PTL给药后结肠组织中IL-17A浓度的降低是一致的(图6C)。PTL+DSS组的Th17细胞的绝对数量明显低于DSS组(p < 0.05)(补充图S5C)。为了研究PTL治疗是否对全身免疫反应产生影响，对小鼠脾脏Treg细胞(1.09% vs 1.16%;p > 0.05)(图7A)，IL-10⁺Foxp3⁺细胞(1.27% vs 1.25%;p>0.05) (图7B)和Th17细胞0.05)比例(0.31%对0.31%;p >0.05)(图7C)也进行了分析。小鼠脾脏中这些T淋巴细胞亚群的绝对数量在各组间也没有显著差异(p > 0.05)(补充图S5A-5C)。综上所述，PTL给药选择性上调结肠Treg细胞的频率，下调结肠Th17细胞与DSS诱导的结肠炎的比值，改善Treg/Th17平衡，维持肠道稳态。

 

图7 PTL处理改变了LP中Treg细胞和Th17细胞的频率。(A)采用流式细胞术和柱状图分析PTL+DSS组和DSS组结肠LP和脾脏中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ (Treg)细胞百分比。(B) PTL+DSS组和DSS组结肠LP和脾脏中IL-10+Foxp3+细胞代表性图及IL-10⁺Foxp3⁺细胞百分比柱状图。(C) PTL+DSS组和DSS组结肠LP和脾脏中CD4⁺IL-17A⁺(Th17)细胞的代表性图和Th17细胞百分比柱状图。图号表示CD4⁺ T细胞在各自象限的百分比。

8.    PTL以肠道微生物依赖的方式调节Treg/Th17平衡

进一步研究PTL给药后Treg/Th17平衡有所改善是否呈肠道菌群依赖性，从肠道菌群缺乏组分离的结肠LP细胞用流式细胞术进行表型分析。ABX(PTL+DSS)组与ABX(DSS)组比较，Treg细胞(1.32% vs1.32%;p > 0.05)(图8A)，IL-10⁺ Foxp3⁺细胞(2.79% vs 2.75%;p > 0.05)(图8B)和Th17细胞(3.39% vs3.37%;p > 0.05)的百分比差异无统计学意义(p > 0.05)(图8C)。一致地，这些T淋巴细胞亚群的绝对数量在肠道菌群消耗组中显示出了相应的趋势(p > 0.05)(补充图S6A)。

同时，FMT组结肠LP中Treg细胞和Th17细胞的频率和数量也进行了表型分析。FM(PTL+DSS)组Treg细胞的百分比是FM(DSS)组的3.08倍大(8.07% vs2.62%;p < 0.05)(图8D)。FM（PTL + DSS）组的Treg细胞绝对数量高于FM（DSS）组（p <0.05）（补充图S6B）。实验结果显示，FM(PTL+DSS)组中IL-10+ Foxp3+细胞比例较FM (DSS)组高3.04倍(7.82% vs 2.57%;p < 0.05) (图8E)，这与细胞因子IL-10水平的升高呈现出相应的趋势(图6E)。FM(PTL+DSS)组IL-10+ Foxp3⁺细胞的绝对计数明显高于FM(DSS)组(p < 0.05)(补充图S6B)。相比之下，FM(PTL+DSS)组的Th17细胞比例明显低于FM(DSS)组(1.75% vs 10.85%;p< 0.05) (图8F)，各组间Th17细胞绝对计数趋势一致(p < 0.05)(补充图S6B)。这些结果表明PTL给药后肠道菌群的改变是Treg/Th17肠粘膜平衡改善的原因。总之,PTL以肠道微生物依赖的方式调节Treg/Th17平衡。 

图8 肠道菌群耗竭和FMT后小鼠LP中Treg细胞和Th17细胞的频率。(A)采用流式细胞术分析ABX(PTL+DSS)组和ABX(DSS)组结肠LP中的Treg细胞，并显示Treg细胞百分比的条形图。(B) ABX(PTL+DSS)组和ABX(DSS)组结肠LP中IL-10⁺Foxp3⁺细胞的代表性图和图形分析。(C) ABX(PTL+DSS)组和ABX(DSS)组结肠LP中Th17细胞的代表性图和图形分析。(D)采用流式细胞术分析FM(PTL+DSS)组和FM(DSS)组结肠LP中的Treg细胞，并显示Treg细胞百分比的柱状图。(E) FM(PTL+DSS)组和FM(DSS)组结肠LP中IL-10⁺Foxp3⁺细胞的代表性图和图形分析。(F) FM(PTL+DSS)组和FM(DSS)组结肠LP中Th17细胞的代表性图和图形分析。图号表示CD4⁺ T细胞在各自象限的百分比。

讨论

本研究在体内研究了PTL对结肠炎症的影响。我们的研究结果表明，PTL对DSS诱发的结肠炎具有显著的保护作用，表现为体重下降、死亡率、DAI评分、结肠长度缩短、组织学评分和结肠镜检查评分都减少。我们还通过肠道菌群耗竭证明了PTL以肠道菌群依赖的方式减轻结肠炎症。PTL给药后肠道菌群表现出更丰富的微生物多样性和菌群组成，有利于SCFAs产生，从而改善肠粘膜Treg/Th17平衡。FMT也被用来证实这种肠道微生物依赖的机制。我们的研究结果表明，PTL是一种很有前途的天然植物提取物，可以通过调节肠道微生物群来预防和治疗IBD。

在各种化学诱导结肠炎模型中，DSS诱导结肠炎模型因其简单和与人类溃疡性结肠炎有许多相似之处而被广泛应用。与IBD发病机制一致，与免疫应答相关的肠道菌群失调在DSS诱导的结肠炎中有重要作用。因此，DSS诱导的结肠炎是研究针对肠道微生物群紊乱的药物治疗策略的理想模型。通过改变DSS浓度和给药频率，可以获得急性、慢性和复发的肠道炎症模型。因此，我们使用3.0%的DSS用于急性炎症诱导，但当抗生素混合物用于肠道微生物群消耗时，我们将浓度降低到1.5%，以防止抗生素前处理的小鼠对DSS的敏感性增强。PTL被报道在体外具有显著的抗炎作用，其作用机制包括对NF-κB通路的特异性抑制，还很少报道在体内特别是在IBD中的抗炎和抗菌作用。因此，我们首先研究了PTL在体内对IBD治疗效果。不出所料，PTL给药后结肠炎症明显缓解。不同于常见的炎症性疾病，肠道菌群失调在IBD发病中起着不可或缺的致病作用。在此，有必要研究肠道微生物群是否参与了PTL对结肠炎的保护作用。令人惊讶的是，肠微生物群耗竭后，PTL对结肠炎症的保护作用消失了，ABX（PTL+DSS）和ABX（DSS）组之间的结肠炎症严重程度没有显着差异。随后,我们执行FMT来证实上述观察。野生型小鼠微生物群经PTL处理的小鼠(FM(PTL+DSS)→GD WT)与经DSS处理的小鼠(FM(DSS)→GD)重组的相比，结肠炎症状及肠道损伤均有减轻。FMT后PTL对结肠炎症的保护作用出现，FM(PTL+DSS)组与FM(DSS)组结肠炎严重程度有显著性差异。这些结果表明，PTL给药后肠道菌群的改变是减轻结肠炎症的原因。值得探索PTL是否与其他文献表明的通过不依赖肠道菌群的方式体外发挥抗炎作用,但在IBD它可能是调节肠道微生物群掩盖通过其他信号通路发挥其抗炎作用。需要设计更深入、更精确的实验来研究其具体作用机制。

IBD患者肠道微生物组成的生物多样性减少(称为失调)，其特征是有益菌群的缺失和致病菌的扩散。将30多种不同的人梭状芽胞杆菌株移植到无菌小鼠体内，导致Treg细胞扩增三倍，而来自相同收集的梭状芽孢杆菌单一菌株转移则导致适度Treg应答，提示较大的微生物多样性可以维持宿主免疫应答的稳态，生物多样性的减少可能导致IBD的炎症过程。我们使用16S rRNA测序来研究PTL处理后微生物多样性和组成的潜在变化。基于OTUs、Chao、Shannon和Simpson等指数的Alpha多样性测定结果显示，经PTL处理后的小鼠的微生物区系多样性明显高于经DSS处理的。在beta多样性方面，通过PCoA看出PTL+DSS组小鼠与DSS组小鼠存在明显的聚类分离，表明PTL处理显著改变了生物群落结构。为了识别潜在的生物标志物和PTL治疗后介导的优势细菌，PTL+DSS组与DSS组进行LEfSe分析。重要的是，3个标志性的细菌分类群，包括Alloprevotella，Rikenella和Fournierella在PTL+DSS组中表现出相对富集，均被描述为有利于肠道菌群代谢物SCFAs的产生。此外，据报道，在PTL+DSS组中，Alloprevotella属占主导地位，LDA评分最高，与一生中降低心血管疾病风险相关。因此，我们的观察表明，PTL给药通过增加肠道菌群生物多样性和促进有益菌的相对丰富可以调节DSS诱导的结肠炎导致的肠道菌群失调。

近年来的研究表明，肠道微生物群落组成和细菌代谢产物通过调节炎症反应可明显改善IBD预后。特别是，微生物衍生的SCFAs通过其抗炎和免疫抑制功能，在稳定肠道免疫稳态中发挥重要作用。考虑到PTL+DSS组的优势菌群与SCFAs代谢相关，IBD患者以及DSS诱导的小鼠结肠炎观察到SCFAs浓度呈下降趋势，测定了PTL+DSS组和DSS组盲肠内容物和粪便样品中SCFAs的浓度。靶向代谢组学结果显示，PTL给药显著提高了微生物源性SCFAs。此外，FMT还能减轻结肠炎症和增加微生物源性SCFAs。

既往研究表明，SCFAs可调节小鼠结肠Treg池的大小和功能，对DSS诱导的结肠炎具有保护作用。Treg细胞特异性表达转录因子Foxp3，通过抑制Th17细胞等其他免疫细胞，分泌抗炎因子IL-10，被认为是多种免疫反应和炎症的特异性抑制者。此外，PTL给药通过下调促炎细胞因子水平和上调免疫抑制细胞因子水平显著改变了DSS诱导的结肠炎细胞因子谱。特别是免疫抑制细胞因子IL-10和IL-17A的促炎细胞因子表现出最显著的差异。Treg/Th17动态平衡在稳定肠道微生态系统稳态中起着不可缺少的作用，可以通过微生物源性SCFAs信号调控。在我们的研究中，采用流式细胞术研究了结肠固有层T细胞应答。两组间Th1和Th2细胞反应无明显差异。正如所料，PTL+DSS组通过PTL介导的代谢产物SCFAs的增加显著改善了肠道黏膜Treg/Th17平衡，与DSS组相比，表现为Treg细胞和IL-10⁺Foxp3⁺ T细胞的频率增加以及Th17细胞的减少。为了进一步证实肠道黏膜中Treg/Th17平衡的促进作用，我们计算了这些T淋巴细胞亚群的绝对数量。一致地，PTL+DSS和DSS组之间Treg细胞和Th17细胞的绝对数量呈现出相应的趋势。肠道菌群耗尽后，ABX(PTL+DSS)组和ABX(DSS)组Treg细胞和Th17细胞的比值和绝对计数无显著性差异。这些数据表明，PTL以肠道微生物依赖的方式调节Treg/Th17平衡。另外，GD WT小鼠移植PTL处理的小鼠粪便菌群后，代谢产物SCFAs水平持续升高。FM(PTL+DSS)组肠道黏膜Treg/Th17平衡的改善可以通过Treg细胞的频率和数量增加，而Th17细胞的比例和数量减少来体现。我们的研究结果表明，PTL给药后粪便微生物群的改变通过增加代谢产物SCFAs的产生减轻了结肠炎症，从而改善了IBD发展Treg/Th17平衡。一些研究人员认为，DSS诱导的急性结肠炎肠道炎症是由于上皮屏障的损伤和先天免疫反应的激活。因此，我们还分析了慢性结肠炎模型中的T细胞应答(补充图S7)。值得注意的是，慢性结肠炎模型的T细胞应答也表现出类似的趋势，这表明PTL给药在急性和慢性结肠炎模型中的应用是通过肠道黏膜中Treg/Th17平衡的改善介导的。

结论

我们的数据表明，PTL以肠道微生物依赖的方式改善结肠炎症。其潜在的保护机制通过微生物源性SCFAs产生与肠道粘膜中Treg/Th17平衡的改善有关。总的来说，我们的研究结果证实了PTL作为一种潜在的肠道微生物群调节剂在预防和治疗结肠炎症中的作用。然而，尽管PTL是一种很有前途的预防和治疗IBD的药物，但其影响肠道菌群的潜在机制还需要进一步研究。

原文网址：https://www.thno.org/v10p5225.htm