编译：Mendelsohn，编辑：谢衣、江舜尧。
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衰老是一个复杂的生理过程，伴随着代谢和免疫功能的退行性失调，导致老年性疾病的发生。肠道菌群可能会通过新陈代谢影响衰老过程中的系统性炎症，但它们之间的关系尚不清楚。本研究采用16S-rRNA测序、气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOFMS)代谢谱、结合先进差异性和关联性分析的免疫学因素分析方法，研究了雄性Wistar大鼠肠道菌群、代谢组和免疫细胞因子之间的相关性。研究结果显示回肠微生物群和血清代谢组成分在衰老过程中发生了显著的变化。我们应用两级策略发现了与衰老相关的关键代谢物，如4-羟脯氨酸、脯氨酸和赖氨酸富集，并与有益微生物包括双歧杆菌、乳杆菌和艾克曼菌呈正相关。功能分析探讨了血清代谢物与特定肠道细菌代谢途径之间的关系。进一步的相关性分析提供了IL-10、IgA、IgM、IgG等主要免疫因子与肠道主要细菌和血清代谢物的相互作用网络。这项研究为免疫因子、血清代谢物和肠道菌群之间的关系提供了新的见解。
论文ID
原名：Age-related Compositional Changes and Correlations of Gut Microbiome, Serum Metabolome, and Immune Factor in Rats
译名：大鼠衰老相关的肠道菌群、血清代谢组变化情况及其与免疫因子之间的关联
期刊：GEROSCIENCE
IF：6.44
发表时间：2020.05.17
通讯作者：王晓艳；贾伟和陈天璐
通讯作者单位：上海交通大学；上海交通大学附属第六人民医院
实验设计
实验结果
GC/TOF-MS共鉴定出82种代谢物，其中氨基酸24种，碳水化合物15种，脂肪酸11种，有机酸19种，其他小分子13种。氨基酸和碳水化合物是主要的代谢物，占所有代谢物的62%(图2A)。采用主成分分析法(PCA)分析各组间的整体代谢组学差异。PCA评分图显示，1周时的代谢谱与其他年龄组有显著差异(图2B)。通过第一和第二主成分可以清楚地区分所有年龄段的概况。血清组的无监督分析表明，年龄是影响健康大鼠代谢特征的主要因素。所有年龄组的PLS-DA模型也证实了这一观察结果(图4)。
图2：年龄对血清代谢组学的影响。A在婴幼期、成年、老年不同年龄阶段代谢物的相对丰度。B基于所有年龄组的血清代谢物进行PCA分析。C不同年龄段氨基酸代谢的变化盒型图。D不同年龄段碳水化合物代谢变化盒型图。E不同年龄段脂肪酸代谢变化盒型图。
2 利用16S rRNA序列测定大鼠肠道菌群组成
图3：年龄对肠道菌群的影响。A婴幼期、成年、老年不同年龄段在门水平上细菌的相对丰度。B基于肠道菌群未加权距离进行PCoA分析。C不同年龄段大鼠在属和种水平上细菌相对丰度变化的盒型图。
3. 代谢组与微生物组的相关性分析
图4：基于知识驱动的降维分析不同年龄段代谢物和肠道微生物功能之间的相关性: A.Spearman相关性分析;B.散点图。
基于数据驱动的降维，使用最新报道的计算平台，我们将代谢物和肠道菌群数据分别分解为12个和10个集群。与年龄关系最密切的代谢群和细菌群分别为M01和B05。M01包括三个氨基酸：脯氨酸、4-羟脯氨酸和赖氨酸，它们都随着年龄的增长而减少。B05含有几种益生菌，如Rothia spp.、Bifidobacterium spp.、Lactobacillus acidipiscis和Enteroces spp.，这些益生菌与年龄呈显著负相关。然后，将聚类向前推进以进行跨域关联分析(图5)。M01与B05呈正相关。
在低水平的关联研究中，代谢物和微生物之间的几个关联以FDR=0.05为准。在这个热图中，各种与年龄相关的代谢物，包括4-羟脯氨酸、十四酸、十二酸、癸酸和苯甲酸，与肠道属显著相关。十四酸、十二酸、癸酸与B04中的糖霉属（Glycomyces spp.）、橄榄杆菌属（Olivibacter spp.）、弧菌属（Phascolarctobacterium spp.）、芽孢杆菌属（Pedobacter spp.）、苯基杆菌（Phenylobacterium spp.）等以及B06中的鞘氨醇属(Sphingobium spp.)、厌氧体属（Anaeroplasma spp.）、几丁质噬菌属(Chitinophaga spp.)和细胞弧菌属(Cellvibrio spp.)呈正相关。
图5：基于数据驱动的降维进行不同年龄段大鼠肠道菌群和代谢物的相关性分析：A.Spearman相关性分析；B.散点图。
4.代谢产物、细菌和免疫因子的相关性分析
补充材料图3：不同年龄阶段免疫因子和细胞因子的变化。
补充材料图S2：不同年龄阶段免疫因子与代谢物、肠道菌群之间的Spearsman相关性分析。
图6：双组学数据的关联性分析结果。A重要关联配对 (细菌-代谢物、免疫因子-细菌和免疫因子-代谢物)的关联性百分比折线图。B代谢物-肠道菌群关联配对的相互作用。
结论
肠道菌群与免疫系统因素有关，这些是衰老相关退行性疾病的重要促成因素。实验大鼠肠道宏基因组与人类在基因水平上显示出比小鼠与人之间更高的成对重叠。在我们之前的研究中，我们证明了由于衰老导致的大脑不同区域的代谢差异，并研究了大鼠肠道菌群与脑代谢物之间的相关性。大鼠脑代谢在不同生命阶段有明显变化。目前的研究也报道了类似的结果。与老年(W12、W56和W111)相比，早期(W1-W9)的血清代谢物水平变化不同(图2)。9周时的这些变化与大鼠的成熟有关。在婴幼期，检测到最低的碳水化合物(糖和乙二醇)水平，然后，它们在成年时达到正常水平，在老年保持不变或略有增加(图2D)。然而，在生命的早期阶段，脂肪酸被证明处于较高的水平(图2E)。与老年阶段相比，生命早期阶段的甘油和脂肪酸明显更高，这与母乳饮食有关。在回肠中最丰富的三个细菌门中，厚壁菌随着年龄的增长而逐渐增加，而其他的表现出不同的趋势(图3A)。可以推断，饮食差异是婴幼期肠道菌群差异的原因之一。此外，与菌群紊乱相关的紊乱会导致能量代谢的调节和老年过量脂肪的积累。
血清氨基酸水平与核酸和脂代谢呈正相关，与氨基酸和维生素代谢呈负相关(图4)，表明肠道细菌对氨基酸的产生可能具有补充作用。尿素与肠道细菌之间存在类似的关系，有事实证明补充益生菌和益生菌显著增加了尿酸，降低了血液中的尿素和尿素氮水平。图4中的这种相关性结果说明了循环代谢物和肠道菌群代谢功能的整体相互作用。
我们的结果表明，4-羟脯氨酸在代谢产物中变化最显著，这是由于老化后的显著下降(图2C)，也是相关网络中的一个重要节点(图6B)。衰老的一个重要特征是胶原蛋白的丢失，而4-羟脯氨酸是胶原蛋白的分解产物。此外，结果显示，血清4-羟脯氨酸水平随年龄增长而逐渐降低。B05细菌组中与年龄相关的益生菌(图5)包括罗斯氏菌属（Rothia spp.）、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、酸乳杆菌属(Lactobacillus Acidipisis)和肠球菌属(Enterorics spp.)与4-羟脯氨酸呈正相关。据报道，4-羟脯氨酸代谢酶广泛存在于肠道菌群中，参与菌群与宿主的代谢。因此可以推断，胶原代谢部分受肠道菌群变化的影响。在群集M01中(图5)，脯氨酸和赖氨酸与4-羟脯氨酸表现出类似的趋势(图2C)。这两种氨基酸也与衰老和炎症密切相关。而在M11簇，葡萄糖酸和葡萄糖醛酸随年龄增长而下降。此外，婴幼期的血清肌醇和柠檬酸水平明显低于成年期(图2D)，这表明能量新陈代谢因衰老而减慢。
半胱氨酸，一种具有多种生理功能的抗氧化谷胱甘肽的前体，在婴幼期和老年都被发现明显下降(图2C)。氧化应激在衰老和神经退行性疾病中诱导异常的半胱氨酸氧化，也影响蛋白质功能。这证实了婴儿、老年人，甚至患有某些代谢性疾病的人都需要补充半胱氨酸。在本研究中，半胱氨酸与双歧杆菌、脱硫弧菌和溶乳链球菌呈正相关(图6)。研究表明，半胱氨酸生物合成基因的表达对双歧杆菌的生长非常重要。最近的一项研究表明，硫还原菌和双歧杆菌之间存在竞争半胱氨酸的拮抗关系。在本研究中，在第一周实验，双歧杆菌和半胱氨酸含量都很低。随着年龄的增长，半胱氨酸和半胱氨酸均呈下降趋势。因此，可以推断双歧杆菌的添加是可行的，或者说半胱氨酸与双歧杆菌是可以相互促进，帮助改善老年代谢紊乱。
芳香氨基酸(包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和支链氨基酸(包括异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)水平从W9到W111是增加的(图2C)，而循环中较高的支链氨基酸水平与胰岛素抵抗和糖尿病的发展相关，并被认为是心血管疾病的预测因子。相关分析结果表明，支链氨基酸及其代谢产物鸟氨酸和苯丙氨酸与IL-10呈正相关(图6B)。据报道，支链氨基酸影响免疫功能，甚至影响IL-10的浓度。IL-10被认为通过影响胰岛素抵抗来调节与衰老相关的炎症，而保持高水平的IL-10可能有助于增强身体活力和抵抗衰老。在这个相关网络图中，IL-10位于该网络的一个关键节点，与多种代谢物和肠道细菌有关。最近的研究报道中炎症因子受多种代谢物的调节，如蛋氨酸和丝氨酸，本研究中蛋氨酸、阿魏酸与IgG呈正相关，丝氨酸与IgG、NK呈负相关(图6和图2)。
值得注意的是，W1组的血清中检测到的所有脂肪酸的丰度都高于其他年龄组(图2e)，这表明脂肪酸参与了幼年阶段大鼠的发育。从W1到W7脂肪酸的下降揭示了从婴幼期到成年的快速消耗。在我们的结果中，从W9到W111，二十二碳六烯酸(DHA)、榄香酸（elaidiate）和亚油酸（linoleate）的丰度逐渐增加。循环中的多不饱和脂肪酸影响宿主炎症状态。已经证明DHA对IL-2信号通路有影响。我们的结果表明， DHA和炎性IL-2呈正相关，两者都是从整个网络中分离出来的(图6B)，而其他长链脂肪酸，如十四酸、十二酸和癸酸与B04中的短杆菌、B06中的厌氧菌属和细胞弧菌以及B03中的粘性艾克曼氏菌属呈正相关。据报道，粘性艾克曼氏菌具有调节代谢平衡和免疫耐受的作用。最近的研究表明，短杆菌属产生丙酸，并与虚弱老年人的饮食干预有关。厌氧菌也与多不饱和脂肪酸喂养有关，并与大鼠大脑中的乙酸水平呈正相关。此外，十四酸、十二酸和癸酸都与IgM和“十四酸-十二酸-癸酸-IL-10-IgM”形成了局部密切的联系（图6B），反映了免疫因子和代谢物之间可能的相互作用。
图6A中相关对的折线图显示，在生命的早期阶段，显著相关的因子-代谢物对的百分比较高，随着年龄的增长而下降。特别是，氨基酸、脂肪酸和三羧酸循环参与者，如柠檬酸和苹果酸显示出较高的相关性(图3)。这可能是因为婴幼期需要外部饮食摄入来支持建立成熟的免疫系统。应该注意的是，所有的配对(因子-细菌，因子-代谢物，细菌-代谢物)的相关性在老年时都会降低(图3，s4)，这可能是由于个体衰老过程不一致，导致群体内部差异过大的结果。
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原文网址：
https://doi.org/10.1007/s11357-020-00188-y
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