编译：小太阳，编辑：谢衣、江舜尧。
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本研究基于3种特征肽段EAFGVNMQIVR（大豆球蛋白G2）、YLGYLEQLLR（牛乳α-S1酪蛋白）、GGLEPINFQTAADQAR（卵清蛋白）和1种稳定同位素标记的肽段（EAFGVNMQI* (I*, 13C6, 15N) VR），建立了一种同时定量鱼糜制品中大豆、牛奶和鸡蛋过敏原的新型液相色谱质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。蛋白提取后经胰蛋白酶进行消化，然后通过 HPLC-MS/MS测定选定的4 个特征肽段。在3个肽段中，在0.5~200 ng/mL 范围内，相关系数R2均大于0.9914，且日内和日间精密度RSD均小于6.7%。大豆的定量限为 0.054 μg/g，牛奶的定量限为 0.024 μg/g，鸡蛋的定量限为 0.032 μg/g。目前该方法已成功应用于鱼糜制品中致敏原蛋白的分析，不仅可以为易过敏的消费者提供准确的过敏原含量信息，还可以用于鱼糜制品市场的的标签管理。
论文ID
原名：Simultaneous determination of multi-allergens in surimi products by LC- MS/MS with a stable isotope-labeled peptide
译名：基于稳定同位素标记肽段—液相色谱质谱联用技术同时检测鱼糜制品中多重过敏原
期刊：Food Chemistry
IF：5.399
发表时间：2020.3
通讯作者：张虹
通讯作者单位：浙江工商大学，食品与生物工程学院
实验设计
鱼糜空白样品基质的制备
鳙鱼（Aristichthys nobilis）购于当地超市。去除内脏、皮肤和骨骼后，将鱼肉切碎，然后包装好置于-20℃下贮存备用。
蛋白质标准溶液的制备
特征肽段EAFGVNMQIVR的储备液（1 mg/mL）用 17%的乙腈水溶液进行稀释；同位素标记的内标肽段EAFGVNMQI* (I*, 13C6, 15N) VR用 33%的乙腈水溶液进行稀释；特征肽段YLGYLEQLLR (1 mg/mL) 用 25%的乙腈水溶液稀释；特征肽段GGLEPINFQTAADQAR (1 mg/mL)用33%的乙腈水溶液进行稀释。稀释过程均根据说明书进行操作以保证肽段能够完全溶解，储备液置于-20℃条件下贮存。
线性设置如下：0.5、1、5、10、20、50、100 和 200 ng/mL，3个特征肽段的线性设置相同。所有的标准曲线均由空白鱼糜制品水解产物进行稀释，同时加入25 ng/mL同位素标记的内标肽段。采用内标法绘制标准曲线。
样品制备
首先，准确称量2 g鱼糜制品，加入5 mL 0.2 M Tris-HCI （pH 7.5）提取液，在60 °C 200 rpm条件下震荡提取2 h。然后在8000 rpm/min 4 °C条件下离心15 min，用 BCA 蛋白定量试剂盒评估上清液中的蛋白含量。取500 μL蛋白质上清液在56°C下用10 μL 50 mM DTT溶液还原30 min，然后加入30 μL 50 mM IAA溶液30反应 30 min，烷基化反应需在室温避光条件下进行。加入胰蛋白酶（酶：底物 /1：50） 后，在37°C条件下孵育16 h，酶解结束后，加入5 μL甲酸。用初始流动相对消化后的混合物进行稀释，使IS的浓度达到25 ng / mL，并在10,000 g 4°C条件下离心15 min。取上清液过0.22 μm滤膜后进行LC-MS / MS分析。
液相色谱质谱联用分析
本研究所用液相型号为LC-30AD（岛津公司，日本），质谱型号为QTRAP 4500 MS/MS（AB 公司，美国）。色谱柱型号为安捷伦Eclipse XDB-C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm），柱温为40℃，进样量为20 μL，流速为0.3 mL/min。流动相为0.15%的甲酸水溶液（A）和乙腈（B），洗脱梯度如下：0~13 min，97~78% A; 13~16 min，78~10% A; 16~16.1 min，10~97% A; 16.1~21 min，97%，进下一针样品前系统平衡5 min。
采用多重反应监测正离子ESI模式进行数据采集。Q1 和 Q3 的离子喷雾电压为 5.5 kV，离子源温度为550℃，辅助气、雾化气和气帘气分别为 55、30和55。详细参数见表 1。
方法验证
为验证该方法对于鱼糜制品中大豆、牛奶和鸡蛋致敏原检测的准确性，对一系列相关参数进行了考察。检出限和定量限分别为胰蛋白酶水解产物的3倍和 10 倍信噪比。对线性范围内内标浓度为25 ng/mL的 8 个点进行了考察。通过计算 3 个添加水平（1、5 和 50 ng/mL）的回收率得到相对标准偏差（RSD）以评估日内和日间精密度。分别在同一天（n = 3）和连续几天（n = 4）的不同时间点分析加标样品，计算出日内和日间精度。添加回收实验是通过向空白鱼糜胰蛋白酶水解物中添加不同浓度的目标肽段和固定浓度的内标肽段进行的。回收率为检出量和添加量的比值。
鱼糜制品中过敏原的计算公式
X(μg/g)表示鱼糜制品中过敏原蛋白的含量；m (g)表示鱼糜样品的重量；δ表示稀释系数；c (ng/mL)表示鱼糜样品中特征肽段的计算浓度；V (mL)表示胰蛋白酶的体积；M1/M2表示致敏蛋白与相应特征肽段的摩尔质量比。所有的数据均以平均值±标准偏差表示。
实验结果
目标肽段的选择
合适特征肽段的选择是LC-MS/MS法检测蛋白的关键。目标特征肽段的选择有一些通用的原则。首先，8~20个氨基酸长度较为适宜，不包含半胱氨酸和蛋氨酸。其次，为确保切割效率和可重复性，所选肽段含有的氨基酸赖氨酸（K）或精氨酸（R）不多于1个。再其次，应具有良好的稳定性和高信号强度。此外，还应该考虑基质效应，包括复杂食品中的外源性和内源性干扰。
在参考以上原则和先前研究的基础上，最初对于每种致敏蛋白选择了2种胰蛋白酶（见图 1）。通过 LC-MS /MS 对该 6个备用胰蛋白酶进行分析。对于大豆来说，肽段EAFGVNMQIVR 和FYLAGNQEQEFLK的产物离子分别为y6、y7、 y8和 a2、b3、y11。在用质谱分析肽段碎片时，y离子优于 b离子。考虑到经济成本，确定了肽段EAFGVNMQIVR并合成了甘氨酸G2的特征肽（摩尔质量为54391）。对于牛奶来说，选择了YLGYLEQLLR肽段，因为它的信号响应强于HQGLPQEVLNENLLR肽段。同样的，YLGYLEQLLR肽段也有一系列的 y 离子（y8、y6和 y5），这些离子可用作定性和定量离子。因此，将YLGYLEQLLR肽段作为α-S1-酪蛋白（摩尔质量为 24529）的特征肽段。对于鸡蛋来说，GGLEPINFQTAADQAR肽段选作卵清蛋白（摩尔质量为 42881）的特征肽段，因为其响应要高于LTEWTSSNVMEER肽段。此外，在质谱分析中，双电荷离子比单离子更可取。双电荷离子y122 +是肽GGLEPINFQTAADQAR中强度最高的离子，故用作定量离子。通过在UniProt（www.uniprot.org）中进行BLAST搜索，证明了这三种候选肽的特异性。最后，通过LC-MS / MS分析证明空白鱼糜样品中不存在这三种肽。
基质效应
在质谱分析过程中，准确率很大程度上会受到离子效率的影响，尤其是在复杂基质中。与纯溶剂相比，基质的存在可能会增强或抑制化合物的电离。因此本研究考查了基质效应对该检测方法的影响。基质效应（ME）：空白鱼糜酶水解物中的基质校正曲线的斜率与初始流动相中的标准曲线的斜率之比。结果显示，EAFGVNMQIVR、YLGYLEQLLR和YLGYLEQLLR肽段的基质效应分别为94%、45.97%和91.74%。基质效应对检测大豆和鸡蛋的中肽段的影响很小。然而，空白基质明显抑制了牛奶中肽段的信号强度。因此，本研究中使用了基质校准曲线以补偿基质效应。
同位素标记内标肽段的选择
将稳定同位素标记的EAFGVNMQI* (I*, 13C6, 15N) VR肽段作为内标以尽可能减小变化和电离效率。内标与特征肽段EAFGVNMQIVR的区别有是13C和15N标记的氨基酸 I。内标肽段能够监测质谱环境以确保其它三种肽段保持相同的理化条件。已有很多研究采用内标法对蜂王浆主蛋白 1 和植物致敏原蛋白进行定量。根据推荐的MRM离子对选择规则，y离子优于b离子，因为其所有的离子都含有同位素标记位点。在同位素标记的肽段中只有1个氨基酸 I。并且这个氨基酸 I 包含y6、y8和y7碎片离子，而这些碎片可用于过敏原蛋白大豆球蛋白G2的定性和定量。因此，选择并合成了同位素标记氨基酸 I。
多反应监测模式离子对的选择
按照之前研究者提出的规则来确定MRM离子对。简言之，当使用ESI时，优先考虑双电荷的前体和y离子。同时，选择较大的m/z，因为它可以提高选择性并排除低质量的离子重叠。
如图2所示，在大豆球蛋白G2胰蛋白酶水解产物中，EAFGVNMQIVR肽段显示，y离子强度要高于b离子。单电荷离子y61+（760.4）、y81+（916.4）和y71+（859.4）的强度高于其他离子，因此可用于进一步分析。由于y61+（760.4）的强度明显是特征肽中响应最高的离子，因此将它作为定量离子。其他两个离子用作定性离子。同样，同位素标记的EAFGVNMQI *（I *，13C6、15N）VR肽段的y61+（767.4）和y81+（923.3）用作定量离子。对于牛奶来说，尽管单电荷离子a21+（249.1）在YLGYLEQLLR肽段中的强度最高，但其氨基酸数目少于4个，很容易被高能破坏。单电荷离子y81+（991.4）是最高的y系列离子，故选为定量离子。同时，将y61+（771.5）和y51+（658.2）离子选作定性离子。对于GGLEPINFQTAADQAR肽段，根据上述规则，将双电荷离子y122+（666.4）确定为定量离子，而不是较高强度的单电荷离子y121+（1331.2）。然后，将单电荷离子y121+（1331.2）和y101+（1121.2）选作定性离子（见图3）。
在酶水解产物中成功检测到这3种肽段及其相应的同位素标记的肽段。随后，对每种肽的碰撞能量（CE）和解簇电势（DP）进行优化。最佳MRM参数如表1所示。
方法学验证
本研究对该方法的相关参数进行了验证，主要包括线性、灵敏度、准确度和精密度。结果显示，在0.5~200 ng/mL范围内线性良好。相关系数R2为0.9914。灵敏度通过LOD（S / N = 3）和LOQ（S / N = 10）进行评估。结果表明，在鱼糜制品中大豆球蛋白G2、α-S1-酪蛋白和卵清蛋白的定量限分别为0.054 μg/ g、0.024 μg/g和0.032 μg/g。
用1 ng/mL、5 ng/mL和50 ng/mL的三种添加水平的特征肽段和25 ng/mL的稳定同位素标记的内标肽进行了精密度的评估（结果见表2）。EAFGVNMQIVR肽段的回收率为97~108.0％，YLGYLEQLLR肽段的回收率为73.2~83.0％，GGLEPINFQTAADQAR肽段的回收率为80.8~98.7％。日内和日间的RSD值分别小于6.6％和6.7％。综合所有数据可见，本研究建立的方法是可靠、有效，可用于鱼糜产品中大豆、牛奶和鸡蛋的致敏蛋白的定量。
样品分析
为了验证该方法，从当地市场、家庭作坊和超市采集了30份鱼糜制品并测定了大豆、牛奶和鸡蛋过敏原含量。根据上述方法对样品进行了前处理和分析。成功地检测到所选的3个特征肽和一个稳定的同位素标记的肽。这些样品的总过敏蛋白见表3。在本研究中，值得注意的是，在样品7中，大豆球蛋白G2的含量为0.22 μg/g。在样品15、16和21中，检出的α-S1-酪蛋白分别为0.27 μg/g、0.27 μg/g和0.28 μg/g。在样品11、12、19和23中，卵清蛋白的含量分别为0.05 μg/g、0.15 μg/g、0.49 μg/g和0.19 μg/g。但是，上述样品并没有相应的标签。样品的制备和离心过程对特征肽的检测几乎没有影响。胰蛋白酶的量是充足的，因此消化产量是相同的，并且肽段是完整的。所以，异常结果可以说明制造商可能像鱼肉加工一样在鱼糜产品的加工中添加了1种以上的其他蛋白质，以形成凝胶并降低成本。不同品牌的鱼糜制品具有不同比例的蛋白质添加剂。另一方面，隐藏的过敏原可能通过同一条生产线进入产品，这很难发现，所以对易过敏的消费者构成了潜在危险。
迄今为止，制造商仅提供“可能包含”的成分或较为模糊的成分列表。这些过敏原标签可能会迷惑消费者。更甚，有一大部分的易过敏消费者往往会忽视这些标签，即使他们有过敏史。因此，准确的食品过敏原定量检测方法必不可少而且非常重要。本研究建立的具有稳定同位素标记肽的LC-MS / MS方法已成功应用于大豆、牛奶和鸡蛋中的痕量过敏蛋白的检测。
结论
本研究建立了一种新颖、灵敏的用于测定鱼糜制品中的大豆球蛋白G2、牛奶α-S1-酪蛋白和卵清蛋白的LC-MS/MS方法。在3个肽段中，相关系数R2在0.5~200 ng/mL范围内高于0.9914，日内和日间精密度RSD均小于6.7％。大豆的定量限为0.054 μg/g、牛奶为0.024 μg/ g和鸡蛋为0.032 μg/g。
据我们所知，本研究是第一个在同位素标记肽的鱼糜制品中检测 3 种潜在过敏原蛋白的方法。由于其定量限低，所以该方法可用于多种过敏原检测或鱼糜制品生产线监控的工具，以减少交叉污染。准确的LC-MS / MS定量数据可以帮助敏感人群采取针对性的预防和治疗措施。它也可以用于鱼糜产品的标签管理。LC-MS/MS方法提供的精确和定量数据可以帮助敏感人群采取针对性的预防和治疗措施，也可以用于鱼糜制品的标签管理。将来，该方法可用于更多复杂食物基质中过敏原的监测工作。
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.126580
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