科研| Nature 子刊：反应性代谢产物的产生是肺癌糖酵解代谢的一个靶点

编译：杨丽军，编辑：Emma、江舜尧。

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导读

 癌细胞参与代谢改变以支持恶性增殖的生物合成需求。代谢重编程将肿瘤与它们产生的组织区分开来，从而提高了肿瘤代谢成为癌症治疗靶点的可能性。糖酵解过程中葡萄糖摄取和转运的增加是许多癌症患者的一个显著代谢特征。然而，直接靶向葡萄糖代谢，包括葡萄糖摄取、糖酵解和乳酸排泄的抑制剂，在临床上仅有少数的成功案例，这可能是因为许多非恶性细胞也需要葡萄糖代谢导致的。

靶向葡萄糖代谢增加的次级效应是一种在癌症中开发这种代谢表型的替代方法，而涉及糖酵解的合成致死性方法被认为是潜在的癌症治疗方法。例如，缺失糖酵解酶烯醇化酶的一个亚型可导致对其余亚型的依赖性增加。葡萄糖代谢增加的其他间接后果可能会导致与正常细胞相比在癌症中具有不同重要性的负担，并且可能适用于更广泛的患者亚群。

本文描述了葡萄糖代谢重编程在肺肿瘤中的次要作用，以确定潜在的抗癌靶点。作者对葡萄糖依赖型非小细胞肺癌（NSCLC）小鼠模型进行了非靶向代谢组学研究，发现与正常肺相比，肿瘤组织中还原型谷胱甘肽的积累显著。确定肺肿瘤也会积聚谷胱甘肽结合物乳糖酰谷胱甘肽（LGSH），这种结合物是由乙二醛酶I（Glo1）产生的，对甲基乙二醛进行解毒。甲基乙二醛是一种反应性代谢物，据报道也会在肿瘤中积聚。作者证实甲基乙二醛是非小细胞肺癌糖代谢的副产物，而且Glo1的表达支持小鼠肿瘤的生长。综上所述，这项研究表明，抑制包括甲基乙二醛在内的活性代谢物解毒途径可能是一种针对肿瘤葡萄糖代谢增加的途径。

论文ID

原名：Reactive metabolite production is atargetable liability of glycolytic metabolism in lung cancer

译名：反应性代谢产物的产生是肺癌糖酵解代谢的一个靶点

期刊：Nature Communication

IF：12.121

发表时间：2020.06

通讯作者：Matthew G. Vander Heiden

通讯作者单位：麻省理工学院koch癌症综合研究所

实验设计

葡萄糖摄取和代谢增加是大多数癌症的一个重要表型，但临床上针对这种代谢改变的研究一直是一个挑战。研究表明，乳糖谷胱甘肽（LGSH）是甲基乙二醛解毒的副产品，在人类和小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）中都升高。甲基乙二醛是糖酵解的一种反应性代谢产物，它与细胞内的亲核试剂（包括碱性氨基酸）发生非酶反应，并降低细胞适应度。甲基乙二醛的解毒作用需要还原型谷胱甘肽（GSH），GSH在NSCLC中相对于正常肺组织有更高的聚集。切除甲基乙二醛脱毒酶gluoxalase I（Glo1）可增强小鼠对甲基乙二醛的敏感性并降低肿瘤生长，认为参与活性代谢物的脱毒反应的靶向途径是一种利用肿瘤葡萄糖代谢增加的后果的方法。

实验结果

1. 非小细胞肺癌中还原性谷胱甘肽的积聚

肿瘤中葡萄糖代谢的增加导致肿瘤中代谢产物相对于正常组织的稳态浓度不同，这可能对细胞信号转导，生物能量学以及支持生物合成和细胞增殖的底物的可用性产生影响。为了确定肺癌与正常组织中代谢物的聚集，作者基于非靶向LC-MS的代谢组学的研究方法，对两种Kras^G12D诱导的NSCLC小鼠模型的正常肺组织和肿瘤组织进行检测，结果表明这两个模型都大量的消耗葡萄糖。Kras^G12D(LA2)模型，由潜在等位基因的自发重组启动，导致突变的Kras表达。KP模型是Cre介导的KrasG12D表达的激活和Trp53（KP）的缺失，形成不同级别和侵袭性的肺肿瘤。虽然与正常肺相比，大多数代谢产物在肿瘤组织中的积累没有差异，但可以确定的是，非小细胞肺癌肿瘤中含有一部分代谢产物，包括还原型谷胱甘肽GSH。

GSH是一种重要的辅助因子，用于解毒活性分子，包括许多含氧化学物质，称为活性氧物质（ROS），它们是线粒体代谢和其他细胞过程的副产物。活性氧生成增加与恶性肿瘤有关，肿瘤中较高的GSH水平有助于癌细胞通过增强活性氧解毒作用。细胞通过各种酶复合物的作用中和ROS，其中一些最终导致还原GSH氧化为谷胱甘肽GSSG的氧化形式。因此，作者推断，如果肺癌中谷胱甘肽水平升高，作为对氧化应激增加的反应，GSH的增加可能伴随GSSG的增加。然而，尽管我们证实两种模型的肺肿瘤中GSH显著升高，GSSG的水平仅在LA2模型产生的肿瘤中升高，而在更具侵袭性的KP模型中GSH的水平也升高（图1a）。此外，两种模型中GSH的相对增加倍数均大于GSSG，提示肺癌的GSH/GSSG比值可能比正常肺组织降低更多。这表明氧化应激是这些癌症中GSH升高的唯一解释，而GSH升高可能在肺癌中发挥解毒的额外功能。

2. 增加非小细胞肺癌的甲基乙二醛解毒作用

GSH具有亲核的半胱氨酸巯基，它允许谷胱甘肽与亲电体反应并形成GSH结合物。GSH结合物的形成参与了电泳脱毒，因此较高水平的谷胱甘肽可防止这些反应性代谢物与细胞大分子发生反应并对其造成损害。为了探索这一可能性，实验从正常肺和肺肿瘤中获得的非靶向代谢组学数据，以确定是否检测到已知的谷胱甘肽亲电偶联物。与GSH在肿瘤中的亲电子排毒中的作用一致，确定了相对于正常肺，肿瘤中具有与谷胱甘肽-亲电子结合物相对应的质量增加的代谢物，其中LGSH是甲基乙二醛和GSH的结合物（图1b）。

为了证实LGSH在NSCLC肿瘤中的升高，本文分析了KP肺癌细胞产生的同种异体肺移植的代谢产物。利用靶向代谢组学，确定相对于正常肺，LA2和KP小鼠肿瘤（图1c）和KP移植肺肿瘤（图1d）中的LGSH升高。此外，与癌旁组织相比，许多人NSCLC肿瘤中LGSH水平升高（图1e），这表明LGSH升高也是NSCLC的一个特征。

由于甲基乙二醛是与高血糖和糖尿病相关的葡萄糖代谢增加的副产品，可导致血管损伤和其他由循环葡萄糖水平升高引起的并发症，因此，LGSH的积累很有意义。有报道甲基乙二醛在癌症中积累。较高的甲基乙二醛诱导细胞毒性，因为它与蛋白质和核酸发生潜在和不可逆的反应，形成稳定的加和物，成为晚期糖基化终产物（AGEs）。为了防止AGE的形成，Glo1酶在组织上表达并催化甲基乙二醛与GSH共价结合形成LGSH（图1b）。甲基乙二醛与GSH非酶反应生成半硫代乙缩醛中间体（该过程是可逆的），Glo1催化半硫代乙缩醛中间体异构化生成LGSH，LGSH更稳定。通过这种方式，Glo1作用于不可逆地螯合反应性甲基乙二醛，并防止亲电试剂与大分子发生非特异性反应损害细胞。作者评估了Glo1的表达，发现相对于正常肺组织，KP肺肿瘤中Glo1的表达增加（图1f）。总之，这些数据表明肺肿瘤组织中Glo1的表达增加，LGSH的产生增加，对甲基乙二醛有解毒作用。

图1 与正常肺组织相比，非小细胞肺癌中还原型谷胱甘肽和乳酰谷胱甘肽的积聚

3. 甲基乙二醛是由非小细胞肺癌中的葡萄糖产生的

甲基乙二醛的产生机制之一是糖酵解过程中磷酸丙糖中间产物的非酶降解。在这种情况下，形成甲基乙二醛的主要碳源是葡萄糖，正如在高血糖症中观察到的那样。然而，甲基乙二醛也可作为苏氨酸和甘氨酸相转化的副产物，且有文献报道过甘氨酸在一些癌症中可以产生甲基乙二醛。实验选取稳定同位素实验用于鉴别甲基乙二醛的来源，[U-¹³C₂]甘氨酸转化为甲基乙二醛导致甲基乙二醛带有一个标记碳（m+1）（图2a），而由[U-¹³C₆]葡萄糖生成的甲基乙二醛生成完全标记的（m+3）甲基乙二醛（图2b）。作者在含有[U-¹³C₂]甘氨酸或[U-¹³C₆]葡萄糖的培养基中培养KP肺癌细胞，并使用LCMS测量了标记掺入甲基乙二醛的能力。尽管甲基乙二醛的反应性质LCMS难以直接检测，但根据谷胱甘肽和LGSH的同位素分布可以计算出甲基乙二醛¹³C的标记。用[U-¹³C₂]甘氨酸培养的肺癌细胞只有约5%的甲基乙二醛m+1标记，尽管在这些条件下60%的细胞内甘氨酸池被标记（图2c）。相反，当肺癌细胞与[U-¹³C₆]葡萄糖培养时，LGSH标记与m+3标记的几乎所有甲基乙二醛一致，与磷酸丙糖酵解中间产物磷酸二羟丙酮的标记模式相匹配（图2d）。这些结果表明，在培养的肺癌细胞中，葡萄糖是内源性甲基乙二醛的主要来源。

为了确定甲基乙二醛是否也来源于肺肿瘤中的葡萄糖，评估了[U-¹³C₆]葡萄糖对LA2小鼠的非小细胞肺癌中甲基乙二醛的贡献。将[U-¹³C₆]葡萄糖注入清醒、无束缚的小鼠颈静脉6小时，采集肿瘤，用LCMS分析组织中的代谢物标记。大多数甲基乙二醛在肿瘤中标记为m+3（图2e）。这些数据表明，肺肿瘤中的甲基乙二醛是由葡萄糖生成的，这与在培养的肺癌细胞中观察到的结果一致。

为了证实肺癌细胞中甲基乙二醛的增加是糖酵解增加的直接结果，实验评估了LGSH水平是否与葡萄糖代谢的程度有关。将肺癌细胞暴露于高浓度的2-脱氧葡萄糖（2DG）中（一种己糖激酶的竞争性抑制剂，可损害葡萄糖的摄取），并且发现2DG降低了肺癌细胞中的LGSH水平（图2f）。这进一步表明甲基乙二醛的产生是细胞葡萄糖代谢的结果。

在这些小鼠模型中出现的NSCLC已知为2-脱氧-2- [¹⁸F]氟-D-葡萄糖-正电子发射断层扫描（FDG-PET）阳性；然而，人类肺癌可表现出不同程度的葡萄糖摄取。为了评估甲基乙二醛解毒是否与肿瘤中葡萄糖代谢增加相关，作者用一系列已知的FDG-PET标准摄取值评估了人类肿瘤中LGSH的水平。结果发现甲基乙二醛解毒与葡萄糖代谢增加正相关（图2g），进一步支持肺癌肿瘤中葡萄糖代谢增加有助于甲基乙二醛的产生和LGSH的积累。

图2 甲基乙二醛是NSCLC糖酵解的副产物

4. 谷胱甘肽缺乏使非小细胞肺癌对甲基乙二醛敏感

甲基乙二醛的产生是葡萄糖代谢的副产物，这增加了肿瘤中谷胱甘肽积累增加的可能性，至少在一定程度上支持了甲基乙二醛的解毒作用。为了验证这一假设，首先研究了细胞内谷胱甘肽的缺失是否会改变在外源性甲基乙二醛存在下培养的NSCLC细胞的增殖。事实上，用丁硫磷硫氧胺（BSO）治疗肺癌细胞，可以使细胞对外源性甲基乙二醛非常敏感（图3a）。Erastin（xc-37系统的选择性抑制剂，限制半胱氨酸摄取和半胱氨酸依赖性谷胱甘肽的合成）也增加了肺癌细胞对甲基乙二醛的敏感性（图3b），尽管menadione（通过无效的氧化还原循环，产生活性氧）增加LGSP对甲基乙二醛的敏感性，但对3553T3细胞无影响（图3c）。通过以上3种物质都降低了细胞内的GSH,说明谷胱甘肽的消耗，而不是增加了ROS的产生，对促进甲基乙二醛的敏感性有很大的促进作用。

由于Glo1需要GSH来解毒甲基乙二醛，GSH的消耗可能导致甲基乙二醛水平的升高和糖基化大分子的积累。非酶法甲基乙二醛糖基化反应形成的加合物是通过精氨酸胍基修饰形成的氢咪唑酮MG-H1（图3d）。结果发现，在外源甲基乙二醛，BSO和Elastin存在的情况下，MG-H1加合物蛋白质的水平显著增加（图3e，f），这表明谷胱甘肽耗竭会阻止有效的甲基乙二醛解毒，并导致甲基乙二醛相关的加合物增加。有趣的是，甲萘醌诱导LGSP中外源性MGO修饰的蛋白积累，而在3553T3细胞中无此现象（图3g），与外源性MGO的敏感性匹配（图3c）。总之，这些数据表明，有效的甲基乙二醛解毒需要谷胱甘肽，并证实AGE积累与肺癌增殖和生存能力降低有关。

由于甲基乙二醛脱毒需要GSH，接下来评估肺癌细胞是否可以通过上调谷胱甘肽合成来适应甲基乙二醛暴露和糖化生物分子升高。尽管外源性甲基乙二醛的添加导致MG-H1加合物的蛋白质积累，但参与GSH合成的谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCLC）催化亚单位的表达水平保持不变。这表明，至少在急性情况下，肺癌细胞可能没有一种机制来增加谷胱甘肽的产生来适应甲基乙二醛水平增加。

图3 谷胱甘肽缺失使NSCLC细胞对甲基乙二醛敏感

5. MGO脱毒需要Glo1

为了从基因上抑制MGO的解毒作用，实验利用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑从肺癌细胞中删除Glo1（图4a）。尽管外源性MGO可以诱导亲代肺癌细胞中LGSH的积累，但Glo1缺陷细胞中的细胞内LGSH水平显著降低（图4b）。此外，Glo1耗竭大大增加了这些细胞对外源性甲基乙二醛的敏感性（图4c）。综上所述，证实Glo1是LGSH形成所必需的，并且这种酶代表了甲基乙二醛在肺癌细胞系中解毒的主要机制。

我们接下来测量了Glo1表达和不表达Glo1的细胞中MG-H1的水平，游离MG-H1浓度在Glo1缺失细胞中基本增加（图4d），当Glo1缺失细胞与外源性MGO孵育时，此加合物的水平进一步增加（图4e）。此外，在这种情况下，western blot也检测到含有MG-H1加合物的蛋白质数量增加（图4f）。说明抑制肺癌细胞中的乙二醛酶系统可以促进甲基乙二醛衍生加合物的积累，如果甲基乙二醛含量较高，则Glo1丢失会损害细胞活力。

我们接下来评估了没有Glo1表达的NSCLC细胞是否比亲代细胞对消耗谷胱甘肽的干预更敏感。结果发现Glo1缺失的肺癌细胞对erastin或menadione相对于亲代细胞系没有差异敏感性，提示Glo1需要将MGO的解毒作用与谷胱甘肽联系起来。

图4 甲基乙二醛脱毒需要乙二醛酶I

6. GloI在缺氧条件下支持NSCLC增殖

培养中的癌细胞和肿瘤中的癌细胞之间的一个主要区别是，体内的癌细胞暴露在氧气水平降低的环境中。缺氧条件会提高糖酵解速率，因此，当氧气不足时，MGO的生成量预计会增加。事实上，我们发现，当在0.5%氧气中培养时，肺癌细胞系积累了更高水平的含有MG-H1加合物的蛋白质，尤其是在不表达Glo1的NSCLC细胞系中（图5a）。此外，我们发现缺氧降低了缺乏Glo1的细胞的增殖（图5b），这表明缺氧条件促进了AGE的积累，降低了细胞的适应度。

6.非小细胞肺癌生长需要GloI

缺氧培养的肺癌细胞对MGO的积累更为敏感，作者推测在基础条件下肺肿瘤对MGO可能更为敏感，因为在培养基中引起毒性所需的外源MGO水平要高于体内血浆中存在的水平。为了确定Glo1的表达是否有助于肺癌的生长，将亲代肺癌细胞和Glo1缺失细胞移植小鼠皮下。与亲代NSCLC癌细胞系相比，Glo1缺失细胞在同种异体移植时的增殖能力受损（图5c）。Glo1缺失细胞的肿瘤也增加了MG-H1蛋白水平，这表明甲基乙二醛衍生加合物的积累可能有助于减少肿瘤生长（图5d）。我们重复了肿瘤移植实验，发现即使在早期，缺乏血管活性的肿瘤也表现出MG-H1加合物蛋白水平增加的迹象。总之，实验数据证明Glo1促进MGO的解毒作用和NSCLC肿瘤生长。

图5 乙二醛酶I在缺氧条件下和体内支持NSCLC增殖

讨论

癌组织代谢组物水平的变化对细胞生理学有重要意义。肺癌非靶向代谢组学分析，谷胱甘肽在肿瘤中升高，并且是恶性转化所必需的，在小鼠非小细胞肺癌病变中相对于正常肺组织积聚。有趣的是，在非小细胞肺癌中，谷胱甘肽的氧化型水平并没有还原性那样升高，这表明GSH相对于GSSG有可能升高。这一发现与新出现的数据相一致，表明一些肿瘤比正常组织处于更为降低的状态，并且这种降低的状态可能限制肿瘤的生长。

NSCLC肿瘤中存在GSH结合物，包括与反应性甲基乙二醛结合的GSH结合物。谷胱甘肽是Glo1的必需底物，因此是甲基乙二醛解毒所必需的。事实上，消耗细胞内谷胱甘肽的药物增加了对外源性甲基乙二醛的敏感性，并促进了甲基乙二醛糖基化加合物的积累。尽管较高的谷胱甘肽促进了甲基乙二醛的解毒作用，但预计甲基乙二醛产量的增加不会在很大程度上消耗谷胱甘肽。首先，谷胱甘肽在细胞中以毫摩的浓度存在，而甲基乙二醛的浓度在低微摩尔范围。第二，Glo2酶能催化LGSH转化为d-乳酸并再生还原型谷胱甘肽，使甲基乙二醛脱毒不消耗还原型谷胱甘肽。Glo2活性降低可能导致细胞内LGSH水平升高；然而，在实验中证明，甲基乙二醛是NSCLC葡萄糖代谢的副产物。高葡萄糖条件下培养的细胞中有甲基乙二醛加合物的积累，而非小细胞肺癌中LGSH的积累与葡萄糖摄取增加有关。这一点，加上高丰度的还原型谷胱甘肽，与谷胱甘肽在某些癌症中作为反应性代谢物（如甲基乙二醛）清除剂的作用是一致的，利用葡萄糖代谢增加的这一结果可能是一种针对FDG-PET癌症的策略。

甲基乙二醛的反应性质使直接测定这种代谢物变得困难，本研究依赖于LGSH积累作为GloI表达时甲基乙二醛生成的代谢物。当向肺癌细胞中添加甲基乙二醛时，LGSH积聚，当糖酵解减少时，LGSH水平降低，并且LGSH水平与人肺癌中¹⁸F-FDG摄取相关。MG-H1加合物也与LGSH水平相关，这支持了研究中所检测的肺癌细胞和组织中甲基乙二醛生成量升高的假设。然而，Glo2在LGSH代谢中的变化也会影响水平，因此直接测量甲基乙二醛有助于进一步评估这种活性代谢物的产生率。

Glo1是甲基乙二醛解毒的一个重要机制，并已被证明在多种癌症背景下升高。Glo1消融抑制NSCLC体内肿瘤生长，这与已发表的结肠癌、肝细胞癌和白血病的研究一致。本研究没有观察到未表达Glo1的NSCLC移植物随着时间的推移逐渐增加的AGEs积累，这可能反映了这些肿瘤不再增殖，或者含有甲基乙二醛加合物的蛋白质可能被降解。然而，发现来源于非小细胞肺癌细胞株的肿瘤在晚期表现出较高水平的Glo1表达，并且Glo1表达的增加与低水平的甲基乙二醛加合物相对应。这可能意味着Glo1在肿瘤发展过程中上调，或是肿瘤中甲基乙二醛解毒能力的增强是阳性选择。

从更广泛的角度来看，本研究的发现表明，癌细胞代谢的其他反应性副产物的产生，包括活性氧（ROS）、甲醛、富马酸盐和脂质过氧化的副产物，可能是肿瘤细胞的一个靶向脆弱性。也就是说，靶向途径解毒反应性代谢物可能是一种治疗肿瘤的方法，通过加强，而不是抑制，癌症代谢表型。尽管诱导活性代谢物过度积累的疗法可能会损害肿瘤的进展，但这种方法的一个潜在缺陷是，低水平的活性代谢物积累也会损害正常细胞，并可能导致恶性肿瘤。ROS已经被证明可以激活致癌信号通路，并促进基因组不稳定性。内源性甲醛可促进全身DNA损伤和恶性转化。低剂量的甲基乙二醛可以促进肿瘤的发生，高浓度的甲基乙二醛可以抑制同一组织中的肿瘤进展，并且的表达减少已被报道促进乳腺癌的生长和侵袭。了解反应性代谢物促进恶性肿瘤或诱发毒性的机制，将有助于深入了解反应性代谢物的增加是治疗癌症的一种策略。

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6898239/