编译：寒江雪，编辑：Emma、江舜尧。
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植物生长促进细菌(PGPB)能促进超积累植物吸收镉，但其内在机制尚未得到全面研究。本研究利用荧光成像，转录组和代谢组的方法阐明了植物激素信号响应了东南景天与PGPB根系互作。结果表明荧光假单胞菌定殖在新出现的侧根，接种荧光假单胞菌促进了寄主植物侧根的形成，从而提高了镉的修复效率。植物转录组结果发现146个植物激素相关基因在细菌接种后显著上调，其中119个基因表现出复杂的相互作用，这表明激素串扰参与了根的发育。靶向代谢组学分析表明，接种荧光菌显著增加了根中吲哚乙酸的浓度，显著降低了脱落酸、油菜素内酯、反式玉米素、乙烯和茉莉酸的浓度，并显著降低了根中脱落酸、油菜素内酯、反式玉米素、乙烯和茉莉酸的浓度，从而诱导侧根萌发。本研究结果强调了PGPB诱导的侧根形成对于增加超积累植物对镉的吸收的重要性。
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实验设计
本研究在一个铅锌矿场采集实验材料，植物材料在未受污染的土壤中生长3代，以使体内金属含量降至最低。将4周龄的预培养植物转移到1 L塑料桶中，分为细菌接种处理(BA)和未接种对照处理(CK)两个组别。观察细菌定殖位置及镉离子分布，比较接种后侧根数目变化。通过转录组和代谢组分析接种前后的差异表达基因及对植物激素含量的影响。
实验结果
1. 荧光假单胞菌在东南景天根中的定殖
荧光假单胞菌大量定殖在新出现的侧根（图1 A-F），而在植物根细胞中发现了细菌细胞（图1 G）。QRT-PCR结果显示：荧光假单胞菌接种处理组中gfp基因在侧根中的表达水平明显高于主根（图1I），达到4.06倍。这些结果表明，PGPB主要定殖在新萌发的侧根。
图1 用绿色荧光蛋白标记的方法观察荧光假单胞菌的定殖
A-G：荧光假单胞菌在东南景天根中的GFP荧光定位。H：GFP标记荧光假单胞菌。
2. 荧光假单胞菌促进侧根形成
总体上看接种细菌促进了侧根的形成，包括根尖（图2 A-B）和成熟区（图2 C-D）。扫描分析表明，接种荧光假单胞菌显著增加了总根长(图2E)、总表面积(图2F)、总根体积(图2G)、根尖数(图2H)和侧根数(图2J)。BA处理的侧根数是对照的1.78倍。但是两种处理的初生根并没有显著差距。
图2 荧光假单胞菌对根系形态的影响
A-B: 主根的顶端部分，C-D:主根的成熟区域。E:总根长，F:总表面积，G:总根体积，H:根尖数，I:主根数，J:侧根数。
3. 镉离子在东南景天根中的分布
用特定的镉离子探针，检测到镉在根外(图3A-E)和根内(图3F-G)的分布。镉的吸收部位主要是侧根（图3 B-C），根毛（图3）和主根的根尖（图3 D-E）。其中，接种PGPB后新出现的侧根表现出最强的镉信号（图3B-C）。两种处理的主根根尖均未出现强烈的镉信号（图2F-G）。镉荧光的定量分析表明BA处理的根中侧根镉荧光的强度显著高于主根（图2H）。前者与后者的荧光强度相差达1.85倍。
图3 用特异性镉离子探针观察镉的进入
A-C:新出现的侧根的镉荧光；D-E: 主根根尖的镉荧光；F-G: 主根横截面的荧光。H: BA处理中主根和侧根的荧光强度。
4. 荧光假单胞菌提高东南景天的生物量、镉吸收和积累
接种荧光假单胞菌处理4周后，显著增加了根系干生物量(图4A)、镉浓度(图4B)和积累量(图4C)。BA的根系镉浓度和积累量分别是CK的1.70倍和2.63倍。接种后地上部的干重(图4D)、镉浓度(图4E)和积累量(图4F)也显著增加。BA地上部镉含量和积累量分别是CK的1.33倍和1.87倍。
图4 荧光假单胞菌对生物量、镉吸收和积累的影响
A:根干重，B:根镉浓度，C:根镉积累，D:地上部干重，E:地上部镉浓度，F:地上部镉积累。镉积累（μg plant -1 ）=镉含量（μg g -1 DW）×干重（g plant -1）。
5. 植物激素相关基因被荧光假单胞菌高度激活
在RNA-seq数据中，接种和未接种处理之间有39,903个差异表达基因（DEG）。其中，18134个基因上调，21769个基因下调（图5A）。随机抽取10个DEG进行qRT-PCR验证，两者结果高度一致（图5B）。植物激素信号转导通路被激活，其中共有146个上调基因对荧光假单胞菌的接种有反应。响应最明显的是IAA信号，其次是TZ、BR、ET、ABA、 SA、GA 和 JA信号传导（表1）。大多数DEG编码植物激素受体蛋白、转运蛋白或转录因子。为了揭示146个上调基因之间的相互作用，成对计算了它们表达模式的相关系数。使用相关系数来可视化共表达网络。结果表明，8个植物激素信号通路的119个基因参与了一个复杂的网络，有1104个交互关系（图5C）。
图5 植物激素相关基因在东南景天根中被激活
A:根中DEG的数量（FDR < 0.05），红色表示上调基因，绿色表示下调基因。B: RNA-seq与qRT-PCR的相关性。C:基因共表达网络。
表1 植物激素信号转导途径中146个上调基因的注释
6. 荧光假单胞菌影响东南景天的植物激素浓度
测定了东南景天根中八种植物激素的浓度。结果表明，接种荧光假单胞菌后，根中吲哚乙酸浓度显著增加（图6 A）。BA处理的IAA浓度是CK处理的1.50倍。ABA、BR、TZ和JA的浓度显著降低（图6 B-E）。BA处理的ABA、BR、TZ、JA浓度分别比CK处理低0.92、0.83、0.75、0.58倍。在BA处理中，ET的释放被显著抑制，比CK处理低0.68倍（图6 G）。两种处理之间的SA浓度没有明显变化（图6 H）。由于GA3含量低，在任何处理中都检测不到GA3的浓度。
图6 植物激素的浓度
A:吲哚乙酸浓度，B:脱落酸浓度，C:油菜素内酯浓度，D:反式玉米素浓度，E:茉莉酸浓度，F:乙烯生成，G:水杨酸浓度。
讨论
1. 荧光假单胞菌促进东南景天侧根形成和镉吸收
已有研究表明，小麦、油菜、碱蓬和油杨的镉吸收量随根尖距离的增加而显著降低。这种镉进入的纵向变化导致强分枝根系对镉的较高吸收，表明侧根出现在镉吸收中的重要性。在本研究中，接种荧光假单胞菌提高了东南景天侧根的数量。初生根的侧根、根毛和根尖是吸收镉的主要部位，其中新生的侧根吸收镉的信号最强。表明新生的侧根对镉的吸收是东南景天超积累的重要途径。研究表明初生根的根尖的镉吸收也是至关重要的，单是本研究结果并不支持这一结论，因为荧光假单胞菌对初生根的发育和镉吸收没有明显的影响。由于荧光假单胞菌促进了侧根的形成，从而提高了植物根系中镉的浓度和积累量，从而促进了超积累植物对镉的植物修复效率。因此，可以通过诱导超积累植物侧根的形成来促进它们对重金属的吸收，从而改善植物修复。PGPB不仅增强了金属转运蛋白的表达，而且还修改了质外体途径，以促进植物的超积累。
2. 荧光假单胞菌在东南景天新生侧根上定殖
早期的研究表明，PGPB倾向于在植物新生的侧根上定殖。荧光假单胞菌的GFP标记表明，荧光假单胞菌特别定殖在新生的侧根上。接种荧光假单胞菌还促进了根的发育，增加了侧根的数量，扩大了PGPB的定殖面积。据报道植物根的其他组织，包括根毛、表皮细胞或木质部导管也被PGPB定殖。本研究中对细菌定殖和镉吸附的荧光观察和定量评价表明，侧根在东南景天与荧光假单胞菌的相互作用中起着至关重要的作用。新生侧根可以作为生物和非生物因子进入超积累植物根系的共同途径。这可能是由于侧根萌发过程中木质发育不完全所致。
3. 荧光假单胞菌对东南景天植物激素信号转导的影响
一些PGPB通过调节寄主植物中的激素串扰来促进植物根的生长。主要通过吲哚乙酸(IAA)和乙烯(ET)/茉莉酸(JA)信号通路之间的相互作用来完成。已有研究表明，一些内生PGPB可以独立于IAA或ET/JA信号通路促进根的发育，说明其他植物激素也可能参与了PGPB诱导的根发育。通过转录组比较了对照植物(CK)和接种植物(BA)的基因表达差异。结果表明，细菌接种后植物激素信号转导系统被激活，有146个基因表达上调。在参与东南景天与荧光假单胞菌相互作用的8种植物激素信号中，IAA、反式玉米素(TZ)、油菜素内酯(BR)、内皮素(ET)和脱落酸(ABA)信号比水杨酸(SA)、赤霉素(GA)和茉莉酸(JA)信号激活得更强。此外，它们还保持着复杂的共表达网络关系，表明荧光假单胞菌通过激活多激素信号协同作用促进了根系的发育。
4. 荧光假单胞菌对植物激素生物合成的影响
最近的一些研究表明，接种PGPB可以改变寄主植物内源激素的生物合成，缓解植物对重金属(Zn、Cd、Ni)的胁迫。关于接种PGPB改变内源激素浓度的程度，不同的研究之间存在着不一致。这可能是由于所研究的重金属及其浓度、植物和细菌种类、植物发育阶段和所调查的组织的不同所致。
植物激素IAA和TZ是调节侧根生长的主要对立因子。侧根形成需要IAA，而TZ与IAA有拮抗作用。此外，BR还通过与IAA的相互作用调节侧根的发育。低浓度的BR通过增加生长素的运输促进侧根的形成，而高浓度的BR通过诱导抑制生长素信号的生长素反应蛋白的表达来抑制侧根的形成。因此，本研究中，BR和TZ浓度的降低与IAA水平的升高似乎是同步的，从而促进了侧根的形成和发育。植物防御相关激素、脱落酸、内皮素和茉莉酸水平的降低，可以进一步解释后者的有益作用。但是更多的研究将更全面地解释这些激素在信号转导和浓度上的变化。
结论
本研究发现在超积累植物东南景天中，新的侧根可以作为PGPB和镉进入的共同途径。接种PGPBP后，植物激素应答基因的表达水平和激素浓度受到显着影响。由于激素的串扰，侧根的出现和更多的镉进入植物根部，极大地促进了东南景天对镉的吸收。本研究结果突出了超积累植物和它们的有益细菌之间的共生互动的双向益处。
评论
东南景天为镉超积累植物，是镉污染农田土壤植物修复的模式植物。本研究表明PGPB诱导金属膜转运蛋白基因的表达促进东南景天对镉的吸收。此外，镉可以通过新出现的侧根直接进入木质部。但是，东南景天接种PGPB后，新出现的侧根是如何增强镉吸收的目前还尚不清晰。本研究通过转录组和代谢组分析阐明了东南景天对接种PGPB的生理和分子机制，揭示了PGPB诱导的侧根形成对于增加超积累植物对镉的吸收的重要性。
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