编译：张娜，编辑：Emma、江舜尧。
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对肝纤维化进行准确无创地诊断和分期是慢性肝病(CLD)临床有效治疗的关键。该研究旨在鉴定能够可靠预测CLD患者纤维化分期的血清代谢物标志物。作者对2个独立队列研究对象的血清代谢物进行了定量分析。基于队列1（504例HBV相关性肝纤维化患者和502例正常对照者）的代谢组学数据，作者选择了4种预测代谢物标记物。因此，作者使用随机森林（RF）构建了具有4种代谢物标记的3个机器学习模型，分别用于区分CLD患者和正常对照(NC)、区分肝硬化患者和纤维化患者、以及区分晚期纤维化和早期纤维化。4种代谢物标记物分别为牛磺胆酸盐，酪氨酸，缬氨酸和亚油酸。代谢物组的RF模型显示了队列1中表现出最强的分层能力，以区分纤维化和肝硬化，并对肝纤维化进行分期。独立队列2由300名慢性HBV感染患者和90名NC组成，进一步验证了该模型的准确性。模型的AUC始终高于APRI，FIB-4和AST /ALT比，同时具有更高的敏感性和特异性。本研究表明，这4种代谢物组在慢性乙型肝炎病毒感染患者CLD进展的临床评估中具有潜在的应用价值。
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实验设计
在本研究中，作者对2个独立队列研究对象的血清代谢物进行了定量分析。目的：鉴定出能够预测CLD患者纤维化分期的血清代谢物标志物。
队列1于2013年4月到2015年6月在上海中医药大学附属曙光医院招募，包括1006例研究对象，其中慢性乙型肝炎CLD患者504名，正常对照502例。所有患者均为HBV-DNA阳性或乙肝表面抗原(HBsAg)阳性。慢性HBV感染的诊断依据中国慢性乙型肝炎防治指南。
队列2于2016年12月至2017年12月在厦门中医院招募，包括300名慢性HBV感染的CLD患者和90名NC。从队列2获得的数据用来进一步验证从队列1构建的模型。
实验结果
1. 研究者特征
从队列1建立的模型在队列2(模型1、模型2和模型3)中得到验证。队列分层以及主要的人口学和临床特征见表1。更详细的临床数据见表3：表S1。
所有数值用平均值±SD表示。ALT丙氨酸转氨酶，AST天冬氨酸转氨酶，TBIL总胆红素，ALP碱性磷酸酶，GGTγ-谷氨酰转移酶，ALB白蛋白，TBA总胆汁酸，PLT血小板。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，t检验，CLDvsNC，S3-4 vs S0-2，肝硬化vs纤维化
本研究的两个独立队列(图1)。CLD组根据肝活检结果进行分期和分组。队列1包括1006例研究对象(502例正常对照组和504例经活检证实的HBV-CLD患者，包括400例肝纤维化(S0-3)和104例肝硬化(S4))。队列2包括390例研究对象(90名NC和300名经活检证实的CLD患者，其中141例为纤维化，159例为肝硬化，134例为早期纤维化(S0-2)，166例为晚期纤维化(S3-4))。从队列1构建的模型在队列2(模型1、模型2和模型3)中得到验证。
图1 研究设计
在队列1(504例经活检证实的HBV-CLD患者和502例NC)中对血清代谢物进行量化，并用于确定候选标记物。经过数据分析确定4种代谢物组。采用10X交叉验证对不同模型和临床指标进行比较。在队列1中，构建了三个RF模型来诊断慢性肝病和正常对照组(模型1)，区分纤维化和肝硬化(模型2)，并对早期纤维化和晚期纤维化进行分级(模型3)。这三个模型在独立的HBV队列2中得到了进一步的验证。
2. 血清代谢物定量
使用靶向代谢物实验方法，作者检测了所有研究对象血清中98种代谢物的浓度，包括24种BAs、42种脂肪酸和32种AAs。
3. 血清代谢物标记物选择
随后，作者运用单因素分析(Wilcoxon's秩和检验，p < 0.001)，在3种分类情况(即诊断CLD与NC、区分纤维化与肝硬化、区分晚期纤维化与早期纤维化)下，从98种血清代谢物中，鉴定出了26种不同的代谢物。然后将26个有统计学意义的代谢物输入LASSO和RF，最终选择了4种代谢标志物，包括1个FFA，亚麻酸(C18：2n6t)，1个BA，牛磺胆酸(TCA)，以及2个AAs，酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)(图2)。这四种代谢物标记物的主成分分析(PCA)也显示CLD患者和NC之间有明显的分离。作者还通过Tyr/Val比率，以进一步改善分类性能。采用Spearman相关分析评价4种代谢产物与肝纤维化分期、坏死性炎症、CPA、AST、ALT、AST/ALT比值、PLT、FIB-4、APRI的相关性。经Spearman相关分析，4种代谢物指标(包括TYR/VAL比值)均与肝纤维化分期显著相关。此外，作者发现这五种代谢物标记物与纤维化分期比以前使用的临床指标的相关性更强。
图2 血清代谢物标记物选择流程图
用于三个临床目标(目标1：CLD与NC，目标2：肝硬化与纤维化，目标3：早期纤维化与晚期纤维化)，对98种代谢物(包括AAs、BAS和FFA)进行单变量分析(Wilcoxon秩和检验)。选择出26个p<0.001的代谢物，分别LASSO和随机森林算法。选取随机森林中前5个LASSO非零系数和前5个重要变量。对于目标2和目标3，选择了重叠的变量，并与从目标1中选择的变量相结合，得到最终的4个代谢物。“OR”表示两个集合的并集，“AND”表示两个或多个集合的交集。
为了确定合适的分类模型，作者在队列1上应用10X CV来比较RF模型和两个线性模型(Logistic回归(LR)、线性判别分析(LDA))以及临床指标APRI、STS/ALT比值和FIB4。CV-AUROC和CV-AUPR作为评价指标。作者发现，为了区分CLD和NC，APRI、LR、LDA和RF具有最高的AUROC和AUPR，而RF表现出最稳定的鉴别性能。对于纤维化和肝硬化的鉴别，RF优于其他方法，总体CV-AUROC和CV-AUPR最高。PCA评分图显示了大多数CLD和NC之间的线性可分离，因此，线性模型可以实现较好的分类性能。
4. 模型1：区分CLD患者和NC
对照组的亚麻酸(C18：2n6t)浓度显著高于CLD组，而CLD组的TCA、Tyr和Tyr/Val比值显著高于对照组(图3a，b)。
模型1是使用这4种代谢物标志物的RF模型构建的，用于在队列1中区分CLD患者和NC。RF模型评估采用OOB估计。模型1的AUROC为0.997(0.993-1.000)，AUPR为0.994(0.998-1.000)(图3c，d)，显著高于APRI(AUROC=0.973，p<0.001)、FIB-4(AUROC=0.848，p<0.001)和AST/ALT比值(AUROC=0.665p<0.001)。
基于OOB预测概率，作者使用Logit函数计算了模型1的诊断RF评分。瀑布图显示，从NC(较低的RF评分)到CLD患者(较高的RF评分)RF评分呈明显的上升趋势，4个标记物的热图也显示出明显分化趋势(图3b)。作者在队列1中观察到两组患者RF评分的显著差异(p<0.001，图3g)，在分界值为0.434的模拟组中，CLD患者的敏感度为98.4%，特异度为99%。因此，作者构建的RF模型的灵敏度和特异度优于AST/ALT比值、APRI和FIB-4。
图3 代谢物标志物和CLD伴有慢性HBV感染诊断模型1。
a.队列1和队列2中CLD患者和NC四种标志物的比较。b.四种标志物的RF评分的瀑布图和相应的热图。c.队列1中模型1的ROC曲线，APRI、AST/ALT、FIB-4；d.队列1中模型1的PR曲线，队列1中的APRI、AST/ALT、FIB-4；e.队列2验证集模型1的ROC曲线、APRI、AST/ALT、FIB-4。f.队列2验证集模型1 PR曲线、APRI、AST/ALT和FIB-4。g.模拟和验证集中NC和CLD患者的诊断RF评分。*p<0.001，Wilcoxon秩和检验。RF评分的最佳截止值为0.434
表2 预测肝纤维化的代谢物标志物，APRI，FIB-4和AST/ ALT比的测量结果
＃ 95％CI使用ROC和PR曲线上的1000倍自动重取样计算得出；CI置信区间。†根据最大程度地获得队列1模拟组的敏感性和特异性之和得出临界值；*使用预设的FIB-4临界值（1.45和3.25区分广泛的纤维化）；**使用预设的APRI临界值（1.0和2.0区分肝硬化）；***使用预设的AST/ ALT临界值（0.8和1.0以区分广泛的纤维化）；AST/ ALT：天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶比，FIB-4：纤维化-4指数，AUROC：特征曲线下面积，AUPR：精确召回下（PR）曲线面积；****使用DeLong检验比较生物标志物组与FIB-4，AST / ALT或APRI之间的AUROC。
5. 模型2：在CLD患者中区分肝硬化和纤维化
用4种代谢物标记物随年龄变化的RF模型建立判别预测模型，以区分队列1中有肝硬化和无肝硬化的CLD患者。该模型基于OOB预测，AUROC值为0.941(0.914-0.964)，AUPR0.87(0.824-0.913)(图4a，b)。这些结果优于APRI(AUROC=0.698，P<0.001)、AST/ALT(AUROC=0.815，P<0.001)和FIB-4(AUROC=0.869，P<0.001)。
在队列1中，模型2的RF评分可区分CLD心脏病患者和纤维化患者(p<0.001)(图4e)。当分界值为0.01时，所构建的模型在队列1数据集中的灵敏度为87.0%，特异度为90.4%。在调整了HBV-DNA水平、坏死炎症程度、HBeAb状态、HBeAg状态、体重指数、血小板、肝功能检查(即凝血酶原时间、白蛋白、直接胆红素、间接胆红素)和药物(恩替卡韦)后，RF评分仍然显著，相关系数为0.755(p<0.001)。由此可见，作者构建的RF模型的准确性优于AST/ALT比值、APRI和FIB-4。
图4 区分纤维化与肝硬化的模型2和区分慢性HBV感染的CLD患者早期纤维化与晚期纤维化的模型3
a. 队列1中模型2的ROC曲线、APRI、AST/ALT和FIB-4；b.队列1中的模型2的PR曲线、APRI、AST/ALT和FIB-4；c.队列2验证集的模型2的ROC曲线、APRI、AST/ALT和FIB-4。d.HBV模拟和验证集中CLD患者肝纤维化和肝硬化的RF评分。RF评分的最佳分界值为0.01。f. 队列1中，模型3的ROC曲线，APRI、AST/ALT和FIB-4；g.队列1中，模型3的GPR曲线，APRI、AST/ALT和FIB-4；f.队列2验证集的模型3的HROC曲线，APRI、AST/ALT和FIB-4。i.队列2验证集的模型3 APRI、AST/ALT和FIB-4的I PR曲线。J.HBV模拟和验证集中，S0-2和S3-4期CLD患者的RF评分。RF评分的最佳分界值为−0.115。*p<0.001，Wilcoxon秩和检验。
6. 模型3：在CLD患者中区分早期和晚期纤维化
本研究将纤维化分期中0-2期定义为早期纤维化，将3-4期定义为晚期纤维化。基于年龄和RF模型从队列1数据中选择的4个代谢物标记物构建了模型3。结果显示，在队列1中，AUROC值为0.918(0.889-0.946)，AUPR=0.892(0.854-0.925)(图4f，g)，成功地将CLD早期纤维化患者与晚期纤维化患者区分开。模型3的结果在预测肝纤维化分期方面优于APRI(AUROC=0.647，p<0.001)、AST/ALT(AUROC=0.714，p<0.001)和FIB-4(AUROC=0.802，p<0.001)。
讨论
随着CLD在全球发病率越来越高，能够准确评估其严重程度对于治疗和预后至关重要。其中，患者对无创评估的配合度较高。在该研究中，作者鉴定了一组代谢物标志物，包括C18：2n6t、TCA、Tyr和Tyr/Val比值，该比值与HBV感染患者CLD进展高度相关。
该研究中，肝活检为参考标准。在Scheuer系统中，S0被定义为无纤维化，S1被定义为门静脉纤维化，S2被定义为门静脉周围纤维化，S3被定义为间隔纤维化，S4被定义为肝硬化。肝硬化的临床表现阶段包括伴/不伴门脉高压的代偿性肝硬化和失代偿期肝硬化。在该研究中，作者首先基于单变量、LASSO和RF分析，确定了NC和CLD患者之间的差异候选标记物，这些标记物与纤维化分期和坏死性炎症相关性较高。然后，作者构建了诊断模型来区分CLD患者和NC，并区分不同纤维化阶段的CLD患者，即早期纤维化与晚期纤维化(S0-2和S3-4)和纤维化与肝硬化(S0-3和S4)。经验证，该模型在独立队列性能较好。在生物医学研究中，普遍存在外部验证/测试准确性降低。该生物标志物组的AUROC和AUPR显著高于AST/ALT比值、APRI和FIB-4，表明该代谢物标志物组具有较高的预测价值。
但是，该研究也有局限性，主要包括以下几个方面：(1)药物使用是该模型的一个混杂因素，但在校正药物使用后，发现没有改变。需要更大样本量的研究来进一步评估这些药物的疗效；(2)HBV感染是本研究中CLD的唯一或主要病因，且参与者均为中国人。因此，这些结果不能推断CLD与这些疾病以外的其他病因，或其他种族/民族。未来的大规模验证研究应包括CLD与其他病因和其他种族/民族的研究对象，然后才能在临床实践中实施该标志物。(3)除横断面研究外，还需进一步进行纵向研究，以进一步验证目前研究结果的可重复性和模型的预测价值，特别是用于鉴别早期和晚期肝纤维化的模型。(4)全谱代谢组学分析的成本较高。然而，如果在未来的验证研究中证明了这种4标记物的稳定性，可只对C18：2n6t、TCA、TYR和Val进行特定的测试，以降低成本并将该标记物转化为临床应用。
结论
综上所述，该研究利用靶向代谢组学分析，从血清中确定了四种代谢标志物，它们可以准确地区分CLD患者和NC，并区分不同阶段的肝纤维化。这种新型的无创性标记物组的诊断性能优于FIB-4、AST/ALT比值和APRI，将有助于在早期识别无明显纤维化的患者，并提高患者复查的依从性。
https://bmcmedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12916-020-01595-w
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