编译：阿温，编辑：Emma、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
巨噬细胞是肿瘤微环境中的主要细胞群。它们可以通过肿瘤衍生的可溶性分子被激活并极化成肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)而促进肿瘤进展和转移。在这里，我们使用代谢组学结合生化和动物研究表明癌细胞将琥珀酸盐盐释放到微环境中并激活琥珀酸盐受体(SUCNR1)信号使巨噬细胞极化为TAM。此外，体外和体内的研究结果表明，琥珀酸盐不仅能促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，还能促进肿瘤的转移。这些效应是由SUCNR1触发的PI3K -缺氧诱导因子1α(HIF-1α)轴介导的。与健康人及无肿瘤肺组织相比，肺癌患者血清中琥珀酸盐水平及肺癌SUCNR1表达升高，具有重要的临床意义。总的来说，我们的发现表明肿瘤衍生的琥珀酸盐属于一类新的癌症发展因子，具有控制TAM极化和促进肿瘤发生的作用。
论文ID
实验设计
1.利用代谢组学分析调节巨噬细胞极化的癌细胞分泌物；
2.验证癌细胞分泌物对巨噬细胞的影响；
3.研究癌细胞分泌物及巨噬细胞对癌细胞的影响；
4.探究癌细胞分泌物调控巨噬细胞和癌细胞功能的分子信号通路；
5.在人组织样本中进行验证分析。
实验结果
1. 癌细胞分泌琥珀酸盐使得巨噬细胞转化为TAM
为了验证癌细胞释放的可溶性因子能调节巨噬细胞极化的假设，我们用不同癌细胞系收集的条件培养基(CM)培养小鼠腹腔巨噬细胞，分析TAM标志物精氨酸酶1 (ARG1)的表达。肺癌细胞(鼠源 LLC和人源A549)的CM，而非对照培养基，增加了巨噬细胞ARG1的蛋白水平和mRNA水平(图1A和1B)。另外，人前列腺癌细胞(PC3)的CM也将巨噬细胞ARG1蛋白水平增加到类似程度(图S1A)。人乳腺癌细胞(MCF-7)和结肠癌细胞(HT-29)的CM增加了ARG1和其他TAM标志物的表达，如Fizz1和Mgl1的mRNA(图S1B)。这些结果表明存在介导巨噬细胞向TAM转化的内源性分子。为鉴定这些活性分子，按大小分选LLC的CM (LLC-CM)和A549的CM (A549-CM)，并评估其对巨噬细胞Arg1表达的影响。小分子部分(<3 kDa, SCM)上调了Arg1, Fizz1和Mgl1的表达，增加了VCAM1+CD11c+CD11blow-TAMs的种群，而蛋白-肽片段(>3 kDa, PCM)没有发挥这些作用(图1C和1D)。LLC-CM或A549-CM经煮沸后仍能有效上调Arg1和Fizz1的表达(图S1C)。接下来我们使用LC-MS来识别LLC-SCM和A549-SCM中的可溶性分子。主成分分析(PCA)表明LLC-SCM与对照介质之间的成分分布有明显的分离(图S1D)，说明两组间代谢物组成的差异。为了识别来自癌症的代谢物，我们构建了一个正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型的S-plot图。基于S-plot图，我们鉴定了11个LLC衍生的代谢物，显示显著的变化，p(corr)[1] P和CoeffCS值都很大(大于0.001)(图S1E)。通过内部代谢物数据库搜索和纯化合物验证，我们获得了三个化合物，即琥珀酸盐、乳酸盐和柠檬酸盐。其余八种代谢物的化学性质目前仍不清楚。此外，质谱分析显示癌细胞SCM与对照培养基之间存在显著差异。在LLC-SCM中观察到一个主要的m/z 117.0峰(图1E)和A549-SCM(图S1F)，但不在对照介质中。子离子图谱与纯琥珀酸盐的相吻合(图1F)。为了确定琥珀酸盐在癌细胞CM中的存在，我们通过比色法分析了琥珀酸盐，并在肿瘤的CM中检测了一定量的琥珀酸盐，LLC-CM (0.57 mM)、A549-CM (0.43 mM)、PC3-CM (0.41 mM)、MCF-7-CM (0.28 mM)、HT-29-CM (0.25 mM) (图1G)。巨噬细胞CM (0.07 mM)和新鲜对照培养基(0.07 mM)中琥珀酸盐含量低。这些结果表明，琥珀酸盐是癌症CM的主要代谢物，可驱动巨噬细胞极化。这一新的发现促使我们确定琥珀酸是否可以在小鼠的原发性皮下肿瘤中检测到。在C57BL/6J小鼠皮下注射LLC细胞21天摘除的皮下肿瘤中琥珀酸盐浓度为0.65±0.039 mM (n = 11) (图1H)。这些结果表明，癌细胞释放琥珀酸盐到细胞外环境，这可能是TAM标志物上调和TAM极化的原因。
图1 癌症条件培养基(CM)中的可溶性因子诱导TAM标志物
A-B Western blot和qPCR检测巨噬细胞中的ARG1蛋白(A)和ARG1 mRNA (B)；C qPCR检测经SCM或PCM培养24 h后Arg1、Fizz1和Mgl1的mRNA表达；D 经LLC-CM、LLC-SCM或LLC-PCM处理3天后，流式细胞仪检测VCAM1+CD11c+CD11blow巨噬细胞数量；E 质谱分析；F LC-MS/MS分析LLC-SCM MS1谱的m/z 117.0子谱与纯琥珀酸盐的子谱；G 比较对照培养基中与取自几种癌细胞和腹腔巨噬细胞CM中琥珀酸浓度；H 在C57BL/6J小鼠皮下注射LLC细胞的原发性皮下肿瘤中琥珀酸浓度。
2. LLC细胞比巨噬细胞降低了琥珀酸盐脱氢酶(SDH)的活性
SDH催化丁二酸盐在TCA循环中转化为富马酸盐，被认为是控制线粒体丁二酸盐水平的关键。据报道，SDH具有抑癌作用。据报道，癌细胞中SDH缺陷导致琥珀酸盐在线粒体和细胞质中异常积累，促进肿瘤生长。此外，抑制SDH可导致癌症上皮-间质转化(EMT)。在这里，我们以小鼠巨噬细胞为参照物，测量LLC细胞中SDH的活性。结果表明，与巨噬细胞相比，LLC细胞的SDH活性降低(图S1G)，活性不受外源添加琥珀酸盐的影响，表明SDH不受反馈抑制的调节(图S1H和S1I)。接下来我们用丙二酸钠抑制SDH活性确定是否会进一步增加琥珀酸盐的分泌。2 mM丙二酸钠作用后显著增加了LLC-CM中的琥珀酸盐(图S1J)。
3. 癌细胞来源的琥珀酸盐可诱导巨噬细胞极化
为了确定肿瘤来源的琥珀酸盐与癌症CM诱导的巨噬细胞ARG1的表达有关，我们评估了抗琥珀酸盐抗体对ARG1表达的影响。抗琥珀酸盐抗体抑制了LLC-CM对ARG1的上调，而对照IgG则没有抑制(图2A)。琥珀酸盐剂量依赖性地增加小鼠腹腔巨噬细胞中ARG1蛋白(图2B)和TAM标志物基因的表达，包括Arg1、Fizz1、Mgl1和Mgl2(图2C)。此外，琥珀酸盐可上调TAM表面标志物，包括CD11c和VCAM1 (VCAM1+CD11c+CD11blow)，它们可以被抗琥珀酸盐抗体抑制，但对照IgG不能(图2D)。这一结果表明，琥珀酸盐使巨噬细胞分化为VCAM1 + CD11c + CD11blow-TAMs。我们使用一个同基因的小鼠肿瘤模型来评估琥珀酸盐对小鼠体内TAM极化的影响。将C57BL/6J小鼠皮下注射LLC细胞，随后腹腔注射琥珀酸盐(20和100 mg/kg)或对照生理盐水，每周两次，持续3周。第21天，收集原发性皮下肿瘤，分析TAMs的百分比。琥珀酸盐治疗小鼠的原发性皮下肿瘤中VCAM1+CD11c+CD11blow-TAMs的数量显著高于生理盐水处理小鼠的(图2E)。总的来说，这些观察结果支持了琥珀酸盐促进TAMs功能极化的观点。
图2 琥珀酸盐促进巨噬细胞向TAM极化
A LLC-CM处理后，对照IgG或抗琥珀酸抗体对ARG1蛋白表达的影响；B 不同浓度琥珀酸盐对ARG1蛋白表达的影响；C 1 mM琥珀酸盐对基因Arg1, Fizz1, Mgl1和Mgl2 mRNA表达的影响；D 利用1 mM琥珀酸盐处理3天后，流式细胞仪检测VCAM1+CD11c+CD11blow-TAM数量；E 对照组和琥珀酸盐组在原发性皮下肿瘤中TAMs的百分比。
4. SUCNR1信号参与琥珀酸盐介导的TAM极化
曾鉴定琥珀酸盐为SUCNR1受体的配体。因此，我们研究琥珀酸盐是否通过SUCNR1促进TAM极化。用抗SUCNR1抗体治疗巨噬细胞可以消除琥珀酸盐介导的VCAM1+CD11c+CD11blow-TAMs的上调(图3A)。此外，特异性的siRNA (si-278、si-559、si-758)抑制SUCNR1表达(图3B和3C)可以抑制琥珀酸盐诱导的Arg1、Fizz1、Mgl1和Mgl2的mRNA表达(图3D)。三种不同的SUCNR1 siRNAs消除了由琥珀酸盐介导的VCAM1+CD11c+CD11blow-TAMs的上调(图3E)。这些结果表明琥珀酸盐通过SUCNR1信号通路促进TAM极化。
图3 SUCNR1是琥珀酸盐诱导巨噬细胞极化所必需的
A 1 mM琥珀酸盐处理3天后，流式细胞仪检测VCAM1+CD11c+CD11blow-TAM数量；B-C 验证siRNA对SUCNR1敲低效率；D 敲低SUCNR1且用琥珀酸盐处理16 h，qPCR检测巨噬细胞中Arg1、Fizz1、Mgl1、Mgl2 mRNA表达；E 敲低SUCNR1且用琥珀酸盐处理3天，检测VCAM1+CD11c+CD11blow-TAM数量。
5. 琥珀酸盐激活的SUCNR1促进巨噬细胞迁移
单核细胞和/或巨噬细胞向肿瘤微环境迁移是肿瘤发生的关键事件。我们探索癌症CM和琥珀酸盐是否能诱导巨噬细胞迁移。A549-CM和A549-SCM增加了巨噬细胞的迁移，但抗SUCNR1抗体抑制了这种迁移(图S3A和S3B)。琥珀酸盐刺激巨噬细胞以剂量依赖的方式迁移(图S3C)，抗琥珀酸盐抗体抑制巨噬细胞迁移，而IgG抗体未抑制巨噬细胞迁移(图S3D)。此外，抗SUCNR1抗体抑制了琥珀酸诱导的巨噬细胞迁移(图S3E)。这些观察结果表明，琥珀酸盐激活的SUCNR1信号对巨噬细胞迁移至关重要。为了确定肿瘤来源的琥珀酸盐是否作为巨噬细胞的可溶性趋化因子，通过transwell实验分析巨噬细胞的迁移。与对照组相比，琥珀酸盐显著增加了巨噬细胞的迁移(图S3F)。琥珀酸盐诱导的迁移程度与PDGF诱导的迁移程度相近。这些结果表明肿瘤细胞分泌的琥珀酸盐促进巨噬细胞的招募和迁移。
6. 琥珀酸盐可诱导肿瘤细胞迁移和上皮细胞间充质转化(EMT)和增强肿瘤转移
由于琥珀酸盐促进巨噬细胞迁移，我们想知道它是否也调节肿瘤细胞迁移。抗琥珀酸盐抗体能抑制LLC细胞的迁移(图4A)。此外，琥珀酸盐剂量依赖性地促进LLC的迁移和侵袭(图4B)，以及A549、HT-29、MCF-7和PC3的迁移和侵袭(图S4A和S4B)。2 mM丙二酸盐通过抑制SDH增加了A549细胞内源性琥珀酸盐的释放(图S4C)，并增强了A549细胞的迁移，其程度相当于琥珀酸盐(图S4D)。与琥珀酸一样，在稳定转染shSUCNR1的A549细胞中，其作用被破坏(图S4D)。这一结果证实了释放琥珀酸盐在促进A549癌细胞迁移中的作用。然而，琥珀酸盐对这些癌细胞的生存能力和增殖没有影响(图S4E)。接下来我们确定琥珀酸盐是否影响癌细胞EMT。琥珀酸盐抑制E-cadherin，增强N-cadherin和vimentin，呈浓度和时间依赖性(图4C和4D)，并且增加EMT转录因子SNAIL mRNAs水平(图4S4F)。重要的是，EMT抑制剂二甲双胍可以消除琥珀酸盐诱导的A549迁移(图4E)。这些结果表明，癌细胞分泌的琥珀酸盐以自分泌和旁分泌的方式通过EMT依赖机制促进肿瘤细胞迁移和侵袭。在一个同基因小鼠肿瘤模型中确定了肿瘤来源的琥珀酸盐在肿瘤转移中的生理相关性。将C57BL/6J小鼠皮下注射LLC细胞，然后每周腹腔注射生理盐水或琥珀酸盐两次。3周后手术切除皮下原发肿瘤，并继续保留小鼠2周再处死小鼠。切下肺、肝、脾和肾上腺以确定肿瘤是否转移。与生理盐水组相比，琥珀酸盐组小鼠肺转移性肿瘤结节发生率更高(图4F)，但肿瘤体积未受影响(图S4G)。在琥珀酸盐治疗的小鼠中，肝脏和脾脏的转移性肿瘤结节同样较高(图S4H和S4I)。琥珀酸盐处理的小鼠的肾上腺转移发生率较高，但差异无统计学意义(p = 0.088) (图S4J)。
7. 琥珀酸盐诱导巨噬细胞极化能够增强癌症细胞迁移
由于琥珀酸盐可通过改变巨噬细胞表型而间接增加癌细胞迁移，我们评估了琥珀酸盐诱导的极化巨噬细胞对肿瘤细胞迁移的影响。将琥珀酸盐诱导的极化巨噬细胞与LLC癌细胞共培养，采用transwell法分析癌细胞迁移。与单培养LLC细胞相比，极化后的巨噬细胞增强了LLC细胞的迁移(图4G)。在共培养培养基中IL-6浓度增加，而在单培养培养基中没有增加(图4H)。值得注意的是，加入抗IL-6抗体后消除了LLC细胞与极化巨噬细胞共培养时增强的迁移能力(图4I)，在共培养液中消除了IL-6(图4J)。这些结果表明极化巨噬细胞介导IL-6的分泌在LLC迁移中起关键作用。巨噬细胞瞬时转染SUCNR1 siRNA758，用琥珀酸盐处理3天，与LLC细胞共培养。与转染对照siRNA的巨噬细胞相比，细胞迁移明显减少(图4K)。这些结果表明琥珀酸盐诱导巨噬细胞极化有助于肿瘤细胞迁移。
图4 琥珀酸盐促进肿瘤细胞的迁移和侵袭
A 采用PDGF-BB作为化学引诱剂进行细胞迁移测定；B 不同浓度琥珀酸盐对细胞迁移和侵袭的影响；C-D 不同浓度琥珀酸盐(C)和1 mM琥珀酸盐处理不同时间(D)对EMT标志物蛋白表达的影响；E 琥珀酸盐联合或不联合二甲双胍(2 mM)处理A549细胞24 h，transwell法测定细胞迁移率；F 对裸鼠进行肺切除，并检测转移性结节；G 测定LLC细胞迁移率；H ELISA法测定下腔内IL-6水平；I-J 将抗IL-6抗体或对照IgG加入LLC细胞与极化巨噬细胞共培养24 h，测定LLC细胞迁移率(I)以及IL-6水平(J)；K siRNA敲低SUCNR1并用琥珀酸盐处理，测定细胞迁移率。
8. 琥珀酸盐通过SUCNR1信号促进肿瘤转移
琥珀酸与SUCNR1的结合激活几个信号靶点，特别是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，并增加细胞内钙和前列腺素E2 (PGE2)。为了确定琥珀酸盐激活癌细胞SUCNR1，我们分析了琥珀酸盐刺激A549细胞的典型靶点。经琥珀酸处理后，磷酸化ERK1/2的含量迅速上升，而在稳定转染SUCNR1 shRNA的A549中，磷酸化ERK1/2的含量消失，而在稳定转染对照RNA的A549中，磷酸化ERK1/2的含量没有消失(图S5A)。琥珀酸盐处理A549或LLC细胞2小时后细胞内的Ca2+增加(图S5B)。然而，在稳定转染SUCNR1 shRNA的两种细胞中，Ca2+水平均未升高(图S5B)。稳定转染空白对照shRNA的LLC细胞中释放到培养基中的PGE2增加，而稳定转染SUCNR1 shRNA的LLC细胞中释放到培养基中的PGE2没有增加(图S5C)。这些结果与琥珀酸盐激活SUCNR1的解释一致。接下来我们确定是否琥珀酸盐通过SUCNR1诱导癌细胞迁移。在有SUCNR1抗体或对照IgG的情况下，用琥珀酸盐处理癌细胞。琥珀酸盐可诱导LLC、A549、PC3和HT-29细胞迁移，抗SUCNR1抗体可阻止此细胞迁移，但对照IgG抗体不能阻止(图5A、5B和图S5D、S5E)。此外，琥珀酸盐诱导LLC和HT-29细胞侵袭同样受到SUCNR1抗体抑制(图S5F和S5G)。接下来，我们分析了在稳定转染SUCNR1 shRNA的A549中，SUCNR1表达降低对琥珀酸盐诱导的细胞迁移和侵袭影响(图S5H)。SUCNR1敲低抑制了琥珀酸盐诱导的A549的迁移和侵袭(图5C)。此外，与对照组相比，稳定转染shSUCNR1的LLC细胞(LLC/shSUCNR1)表达的SUCNR1降低，减少了琥珀酸盐诱导的细胞迁移(图S5I和S5J)。
为了研究SUCNR1在琥珀酸盐能增强体内转移中的作用，我们将裸鼠皮下注射稳定转染对照shRNA (A549/shNC)或SUCNR1 shRNA (A549/shSUCNR1)的A549细胞。第56天对小鼠实施安乐死，切除肺组织，检查转移性结节。接种A549/shSUCNR1的小鼠肺转移性结节明显低于接种A549/shNC的小鼠(图5D)。同样，接种LLC/shSUCNR1的小鼠肺转移性结节显著减少(图S5K)。相反，A549/shSUCNR1组和A549/shNC组之间的肿瘤体积和肿块无显著差异(图S5L-5N)。这些结果表明琥珀酸盐可通过SUCNR1促进肿瘤转移。
9. 琥珀酸盐通过PI3K/ AKT和HIF-1α信号诱导肿瘤转移
MAPK、PI3K/AKT和AMPK介导的缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)上调在巨噬细胞激活和癌症发展中起着关键作用。因此，我们研究琥珀酸的作用是否可能是通过这些信号分子介导的。在LLC和A549细胞中，琥珀酸诱导p38 MAPK、AKT和AMPK的磷酸化，并以时间依赖性的方式增加HIF-1α蛋白(图S6A和S6B)和mRNA的表达(图5E)。抑制PI3K/AKT，而不抑制p38 MAPK，可以抑制琥珀酸诱导的Hif-1α的表达(图S6C和图5F)。为了了解SUCNR1在促进HIF-1α表达中的作用，我们测定A549/shSUCNR1细胞中HIF-1α表达水平。在琥珀酸盐处理的A549/shNC细胞中观察到HIF-1α上调(图S6D)。A549/shNC细胞经膜透性琥珀酸二甲基酯(DMS)处理后HIF-1α升高。然而，在A549/ shSUCNR1细胞中，琥珀酸盐诱导HIF-1α的表达被抑制，而DMS没有诱导HIF-1α的表达(图S6D)，提示琥珀酸盐诱导HIF-1α的表达依赖于SUCNR1的表达，而DMS诱导的HIF-1α表达不依赖于SUCNR1。因为有报道HIF-1a途径通过诱导EMT介导肿瘤转移，我们确定是否琥珀酸盐通过HIF-1α依赖的信号通路促进肺癌细胞迁移和EMT。LLC和A549细胞被HIF-1α特异性抑制剂处理，并评估细胞迁移。HIF-1α的药理抑制剂2-MeOE2和Bay 87-2243以剂量依赖的方式抑制琥珀酸盐介导的LLC和A549的迁移(图5G)。脯氨酰基羟化酶(PHD)通过羟基化HIF-1α中两个保守的脯氨酸残基来控制HIF-1α蛋白的稳定性，从而加速HIF-1α的降解。为了提供支持HIF-1α在琥珀酸盐诱导癌细胞迁移中的关键作用的额外证据，我们使用PHD抑制剂二甲氧基沙酰甘氨酸(DMOG)或激活剂α酮戊二酸(α-KG)处理细胞，并分析细胞迁移。DMOG升高琥珀酸盐介导的细胞迁移，而α-KG降低琥珀酸盐介导的细胞迁移(图S6E和S6F)。此外，HIF-1α敲低(A549/shHIF-1α)抑制琥珀酸盐诱导的A549迁移，而对照(A549/shNC)没有抑制(图S6G)。LY294002抑制PI3K或Bay 87-2243抑制HIF-1a能够抑制琥珀酸盐介导的E-cadherin减少和vimentin增加(图S6H和S6I)。接下来，我们使用移植瘤A549/shHIF-1α模型来确认HIF-1α在琥珀酸盐诱导的体内转移中的作用。接种A549/shHIF-1α的小鼠肺转移性结节明显低于接种A549/shNC的小鼠(图S6J)。此外，与A549/shNC肿瘤相比，琥珀酸盐诱导的原发性皮下肿瘤的E-cadherin减少和vimentin升高被逆转(图S6K)。综上所述，这些结果表明琥珀酸盐激活SUCNR1是通过PI3K/AKT信号通路诱导HIF-1α介导EMT，从而促进肿瘤转移。
图5 肿瘤分泌的琥珀酸盐通过SUCNR1信号通路促进肿瘤转移
A-B 琥珀酸盐(1 mM)与对照IgG或抗SUCNR1抗体处理LLC 和 A549细胞，测定细胞迁移率；C 琥珀酸盐(1 mM)处理A549/shSUCNR1稳定细胞24 h，测定细胞迁移和侵袭率；D A549/shNC或A549/shSUCNR1细胞皮下植入裸鼠，随后腹腔注射琥珀酸盐，每周两次，最后评估肺转移性结节；E qPCR检测经琥珀酸盐处理的LLC细胞在指定时间段内的Hif-1α mRNA水平；F LY294002或SB202190预处理LLC细胞1 h，用琥珀酸盐处理12 h，测定Hif-1α mRNA水平；G 琥珀酸盐加HIF-1α抑制剂2-MeOE2和Bay 87-2243处理LLC和A549细胞24 h，transwell测定细胞迁移。
10. PI3K/AKT/HIF-1α信号触发琥珀酸盐诱导TAM极化
HIF-1α在巨噬细胞中表达，在调节巨噬细胞的代谢和极化中起关键作用。我们想知道琥珀酸盐是否通过SUCNR1诱导巨噬细胞中HIF-1α的表达。琥珀酸盐激活SUCNR1可以显著增加巨噬细胞HIF-1α的表达，而SUCNR1敲低可抑制HIF-1α的表达(图6A)。Bay 87-2243抑制HIF-1α能剂量依赖性地抑制琥珀酸盐介导的巨噬细胞中Arg1和Vegf的表达(图6B)。此外，HIF-1α siRNA显著降低巨噬细胞中HIF-1α水平，并降低琥珀酸盐介导的Arg1、Fizz1和Mgl1的表达(图6C)。DMOG剂量依赖性增加琥珀酸盐诱导的Arg1和Fizz1表达，而α-KG显著降低琥珀酸盐诱导的Arg1和Fizz1表达(图6D和6E)。总的来说，这些结果表明通过琥珀酸盐- SUCNR1途径上调HIF-1α表达在驱动TAM标志物表达和极化中发挥核心作用。
考虑到PI3K介导的HIF-1α信号在琥珀酸盐诱导的癌症转移中发挥重要作用，我们对此进行探究PI3K信号是否参与琥珀酸盐诱导的TAM极化。LY294002抑制PI3K后显著抑制琥珀酸盐诱导的Arg1、Mgl1和Mgl2的表达(图6F)，提示PI3K-HIF-1α信号在琥珀酸盐介导的TAM极化中是必需的。此外，这些结果表明，巨噬细胞中琥珀酸盐激活的SUCNR1信号级联与癌细胞中的类似。
图6 琥珀酸盐诱导巨噬细胞极化是通过HIF-1α介导的
A siRNA敲低SUCNR1并用琥珀酸盐处理，测定Hif-1α mRNA水平；B 琥珀酸盐和Bay 87-2243处理细胞，测定Arg1和Vegf mRNA水平；C 转染HIF-1αsiRNA，用1 mM琥珀酸盐处理16 h，qPCR检测巨噬细胞中的Hif-1α、Arg1、Fizz1和Mgl1 mRNA；D-F 用DMOG (200 μM)、α-KG (20和200 mM)或LY294002 (10 mM) 1h，用琥珀酸盐(1 mM)刺激细胞16 h，qPCR检测巨噬细胞中Arg1、Fizzl、Mgl1或Mgl2 mRNA。
11. UCNR1在人肺癌中表达升高
为了提供临床相关性，我们通过qPCR分析了213例人肺癌组织和78例无肿瘤肺组织中的SUCNR1 mRNA水平(表S2A)。肺癌组织中SUCNR1受体平均mRNA水平明显高于无肿瘤肺组织(图7A)。肺癌组织中SUCNR1受体mRNA水平分布广泛，有相当一部分(37.56%)高于正常值(图7A)。我们想知道肿瘤SUCNR1水平是否与肺癌患者的生存相关。为了解决这个问题，我们分析了来自癌症基因组(TCGA, http://www.cancer.gov/tcga/)的8个肺腺癌患者队列研究(n = 664)的SUCNR1表达谱和总体生存数据。根据SUCNR1 mRNA低表达 (n = 340)和SUCNR1 mRNA高表达(n = 324)分析生存率。Kaplan-Meier图显示SUCNR1 mRNA低、高表达之间的生存率无显著差异(图7B)。这些结果提示肿瘤中SUCNR1水平与生存无关，但有助于琥珀酸盐的促肿瘤活性。
12. 血清琥珀酸盐是一种潜在的肺癌生物标志物
癌症CM中含有琥珀酸盐的新发现促使我们确定琥珀酸盐是否可在血液循环中检测到，其水平是否与肺癌的风险有关。我们将C57BL/6J小鼠皮下注射LLC细胞，分析LLC细胞接种前后小鼠血清中琥珀酸盐的水平。LLC细胞接种16天后小鼠血清琥珀酸盐显著高于接种前(图7C)，表明移植瘤小鼠血清琥珀酸盐水平升高。为了确定血清琥珀酸盐的临床相关性，我们测量了21名健康受试者和97名非小细胞肺癌(NSCLC)患者的血清琥珀酸盐(表S2B)。肺癌患者琥珀酸盐平均浓度显著高于健康受试者(图7D)，提示NSCLC患者血清琥珀酸盐水平升高可能反映癌症的发展，可能是癌症发展的一个标志。为了提供证据来支持这一观点，我们分析了AUROC曲线下的面积来确定区分效能。如图7E(右图)所示，血清琥珀酸盐具有较高的鉴别能力，可以作为NSCLC的生物标志物。
图7 血清琥珀酸盐与肿瘤SUCNR1基因在NSCLC中的临床意义
A qPCR检测无瘤肺组织(n = 78)和肺癌组织(n = 213)中SUCNR1 mRNA的表达情况；B TCGA数据库中Kaplan-Meier生存曲线；C LLC细胞接种前和接种16天后小鼠血清琥珀酸盐浓度；D 用琥珀酸盐比色法试剂盒测定健康受试者和非小细胞肺癌患者血清琥珀酸盐浓度；E AUROC曲线分析非小细胞肺癌患者血清琥珀酸盐鉴别能力。
讨论
琥珀酸盐由琥珀酰辅酶A经过TCA循环酶琥珀酰辅酶A合成酶生成，在线粒体能量代谢中起重要作用。线粒体的代谢畸变可能导致细胞和/或细胞外琥珀酸的积累。据报道，脂多糖诱导的巨噬细胞活化可触发琥珀酸盐释放到培养基中，促进IL-1b的生成并促进炎症。据报道，TCA循环功能障碍导致的癌细胞浆内琥珀酸积累有助于肿瘤的发生。然而，肿瘤细胞分泌琥珀酸盐到细胞外环境及其病理作用尚未见报道。在本研究中，我们使用代谢组学方法在体内外鉴定了琥珀酸盐是一种肿瘤细胞分泌的新型因子，可触发TAM极化，促进肿瘤转移。我们的研究结果表明，琥珀酸盐可以增强巨噬细胞的迁移和癌细胞的迁移和侵袭，促进癌症的转移。我们的结果进一步表明，琥珀酸盐通过SUCNR1激活，如细胞内钙的增加，ERK1/2信号和PGE2产生。当特定的SUCNR1 siRNA敲除癌细胞SUCNR1时，琥珀酸盐的促肿瘤作用消失。综上所述，这些发现表明癌细胞分泌琥珀酸盐到培养基中，通过SUCNR1增强癌细胞的迁移和侵袭，促进癌细胞在体内转移。癌细胞分泌琥珀酸盐到培养基中的确切机制尚不完全清楚。我们的结果表明，降低SDH活性有助于琥珀酸盐的积累和分泌。另外，过量的琥珀酸盐可能来源于谷氨酰胺的回补，这是活化的巨噬细胞中琥珀酸盐的主要来源。需要进一步的研究来阐明癌细胞中琥珀酸盐过量积累和分泌的机制。
我们的结果首次表明肺癌患者的血清琥珀酸盐浓度与健康受试者相比升高。这一发现表明，在癌症的发生发展过程中，癌细胞会释放大量的琥珀酸盐进入循环。我们的分析表明，血清琥珀酸盐具有很高的鉴别能力，代表了一种新的循环单异代谢物，对预测NSCLC具有潜在的价值。此外，由于LLC肿瘤模型中琥珀酸盐水平的升高伴随着皮下肿瘤TAMs的增加和肿瘤转移的增强，血清琥珀酸盐可能是治疗NSCLC的有用的生物标志物。
结论
总之，我们发现肿瘤细胞分泌琥珀酸盐进入细胞外环境，增强巨噬细胞迁移能力并介导TAM极化。此外，在小鼠模型中，琥珀酸盐可诱导肿瘤细胞EMT，增强肿瘤细胞迁移，促进肿瘤转移。我们提供的证据表明琥珀酸盐通过SUCNR1发挥作用，通过PI3K/HIF-1α途径传递信号。这些新发现表明琥珀酸作为一种单一代谢物，可能是癌症化学预防和治疗的一个有价值的靶点。
联系客服
