编译：Aimee，编辑：Emma、江舜尧。
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胰腺导管腺癌（PDAC）的特点是广泛的纤维化和血管化，引发显著的瘤内缺氧（低氧），从而导致其侵袭性、抗治疗性和高死亡率。氧气是许多细胞和代谢过程的基本需求，缺氧对PDAC有重要影响，但是其生物学作用尚不清楚。作者研究了PDAC细胞如何在几乎无氧气的条件下生存，发现PDAC细胞株在氧气紧张度降至0.1%的情况下能够稳健生长，维持线粒体形态、膜电位和合成关键代谢产物所需的氧化代谢活性。通过靶向线粒体呼吸超复合物组装来干扰电子传递效率，特别影响缺氧PDAC的增殖、代谢和体内肿瘤生长。总的来说，该结果确定了一种机制，使PDAC细胞能够在严重缺氧的微环境中生长。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 胰腺癌细胞在严重缺氧时维持生长和氧化代谢
为了了解胰腺癌细胞如何适应严重的缺氧环境，作者在病理生理氧张力为0.1%的条件下培养PDAC细胞系，这与胰腺癌的瘤内氧测量结果一致。值得注意的是，作者发现所有的PDAC细胞株在0.1%的氧气和≥50%的常氧率下都能保持旺盛的生长（图1A和S1A）。这与来源于低缺氧肿瘤类型的细胞系不同，如肺（A549）和结肠（HCT116和DLD-1），在严重缺氧（常氧的10%-30%）时，其增殖明显减少（图1A和S1B）。转移性乳腺癌细胞系（MDA-MB-468和MDA-MB-231）在肺/结肠和PDAC细胞系之间表现出生长缺陷（图1A、S1A和S1B）。然而，所有细胞系都能在较温和的缺氧条件下增殖（图S1A和S1B），这表明PDAC细胞对极端缺氧具有独特的适应能力。尽管肺癌、结肠癌和乳腺癌细胞都可能在体内遭遇肿瘤缺氧，但没有一种细胞显示出与胰腺癌相同的缺氧水平，因为氧气是合成代谢和增殖的基本代谢需求，我们假设细胞在完全缺氧（缺氧）下无法维持生长，但可能受到条件限制而存活。为了验证这一假设，我们在缺氧条件下培养细胞，通过使用钯催化剂消耗氧气来维持3.5ppm（<0.001%）的水平。所有细胞系，无论肿瘤类型如何，都无法在缺氧条件下生长（图S1A和S1B）；然而，我们发现所有PDAC细胞系以及其他一些癌症细胞类型（例如，MDA-MB-231、MDAMB-468和DLD-1）能够在缺氧条件下维持数天的生存能力（图1B）。总的来说，这些数据表明来自极度缺氧环境的细胞系已经进化出强大的机制/代谢途径来维持缺氧微环境中的增殖和生存能力。此外，作者的数据强调了癌细胞生长需要消耗氧气的细胞过程。
线粒体是哺乳动物细胞内的中心耗氧细胞器，利用氧气作为电子受体维持细胞内的生物能量和关键的生物合成反应。细胞呼吸通常被认为是细胞中最重要的耗氧途径。为了了解严重缺氧时维持PDAC增殖对线粒体活性的需求，我们构建了线粒体DNA缺陷细胞（p0），这些细胞缺乏线粒体基因组中编码的关键呼吸链催化亚基。在正常氧条件下，呼吸功能不全的细胞与呼吸正常的细胞相比，其增殖能力下降（图1C）。我们发现，在常氧和严重缺氧条件下，p0胰腺癌细胞的增殖同样受到线粒体缺失的影响（图1C）。相反，缺氧条件下非PDAC-p0细胞在外源性尿苷和丙酮酸存在下似乎获得增殖优势（图1C）。这些数据表明线粒体活性对PDAC的增殖至关重要，而不依赖于氧的有效性。
图1 胰腺癌细胞在严重缺氧的情况下维持生长
(A)细胞暴露在0.1% O2下的相对增殖率，以常氧生长的百分比表示(平均值±SEM, n = 3)。增殖率由图S1所示的三条独立生长曲线的指数生长方程计算。(B)缺氧(0% O2)5天(D5)后活细胞的百分比(平均值±SEM, n = 3)。(C)线粒体完整或耗尽的细胞常氧和缺氧(0.1% O2)生长变化(p0)。p0显示为完整线粒体的百分比(平均值±SEM, n = 3)。(D)在常氧和低氧(0.1% O2)条件下使用四甲基罗丹明(TMRE)进行膜电位测量。每个条件记录10-20个字段。低氧数据以常氧条件的百分比表示。(E)用ETC抑制剂粉蝶霉素A (25 nM)和抗霉素A (50 nM)处理缺氧(0.1% O2)细胞5天。处理后的细胞以未处理细胞的百分比表示(平均值±SEM, n = 3)。(D)和(E)采用Dunnett’s多重比较检验检验显著性，其中n.s.≥0.05，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p ≤ 0.0001。
有研究表明，线粒体呼吸链的一个主要功能是再生用于天冬氨酸生成的电子受体，据报道，天冬氨酸既能限制体外缺氧生长，也能限制体内某些实体肿瘤的生长。我们的实验得到了与此一致的结果，即补充外源性电子受体丙酮酸盐（提供氧化过剩细胞质NADH）会显著增加癌细胞在0.1% O2中的生长（图S1D）。在这些条件下，添加全身或线粒体靶向抗氧化剂并不能促进癌细胞的增殖(图S1D)。我们推测PDAC细胞在严重缺氧条件下仍能维持天冬氨酸的生物合成，并进行了验证，我们观察到细胞暴露于低氧环境时，天冬氨酸水平下降了70% - 90%(图S2A)，这与先前的研究结果一致，即天冬氨酸限制了低氧生长。然而，为了评估天冬氨酸产量的限制是否会导致天冬氨酸水平的降低，以及更好地了解PDAC细胞在严重缺氧状态下如何重构中心碳代谢，我们采用稳定同位素标记示踪。在常氧条件下，20% - 50%的柠檬酸碳来自统一标记的13C6葡萄糖(图S2B)，与常氧条件不同，在严重缺氧条件下，所有细胞系的线粒体葡萄糖利用率都显著下降(图S2B)。这伴随着线粒体丙酮酸氧化的减少(图S2C)，这与广泛报道的通过典型HIF1介导的丙酮酸脱氢酶激酶1 (PDK1)转录抑制丙酮酸脱氢酶(PDH)活性的结果一致。有研究表明，在某些细胞环境中，丙酮酸羧化酶(PC)的活性增加是对PDH失活的一种代偿性失活机制。然而，我们发现PC活性的增加并不适用于所有的PDAC细胞系，但在被测的非PDAC细胞系中，PC活性的增加是一致的(图S2D和S2E)。总的来说，这些数据表明，缺氧的PDAC细胞经历了典型的葡萄糖代谢重组，并不是主要使用葡萄糖来合成天冬氨酸来应对严重的缺氧。对低氧胰腺癌细胞的定量蛋白质组学分析显示，HIF1a水平持续升高，且在下游靶细胞中富集，证实PDAC细胞对严重缺氧进行典型的HIF依赖性适应(图S2F S2H)。
我们实验室此前报道PDAC细胞表现出高谷氨酰胺依赖性。由线粒体天门冬氨酸氨基转移酶2 (GOT2)产生的线粒体谷氨酰胺衍生的天门冬氨酸与细胞内苹果酸交换生成草酰乙酸，细胞内天门冬氨酸氨基转移酶(GOT1)通过转换成苹果酸和丙酮酸生成细胞内NADPH。为了检查在缺氧条件下谷氨酰胺衍生的碳对天门冬氨酸池的贡献，我们下一步使用统一标记的13C5 -谷氨酰胺示踪剂进行追踪。我们发现，PDAC细胞通过线粒体中GOT2的活性维持大部分天冬氨酸的生成(图2A)，而其他类型的肿瘤通过缺氧反应中GOT1的活性增加细胞中天冬氨酸的生成(图2B和2C)。与此相反，在任何细胞系中，在严重缺氧环境下，GOT1和GOT2的表达都没有持续变化(图S2I和S2J)，尽管在0.1% O2下，GOT1的表达有上升的趋势。使用RNA干扰去除GOT2(图S2K)可显著降低PDAC细胞系的天冬氨酸水平(图S2L)和低氧生长(图S2M)，这与天冬氨酸生成的作用一致。此外，缺氧时GOT2的活性与缺氧生长速率呈正相关(图2D)。这些观察结果表明，胰腺癌细胞维持谷氨酰胺缺氧性病变，以维持氧化的谷氨酰胺代谢。此外，氧化性谷氨酰胺代谢的维持是严重缺氧PDAC细胞生长的关键决定因素。
为了评估胰腺癌细胞在严重缺氧时是否能够维持足够的线粒体天冬氨酸的产生，我们进行了动力学通量分析（KFP）测量从13C5谷氨酰胺到下游代谢物的同位素标记动力学，所得的动力学标记数据结合绝对代谢物水平被用来量化暴露于0.1%氧张力的细胞中的合成通量。我们发现PDAC细胞维持天冬氨酸生产通量（图2E和2F），其中大多数天冬氨酸来自谷氨酰胺（图S2N）。代谢物水平的变化并不一定与流量的变化有关，我们的数据表明，尽管在缺氧条件下，天冬氨酸水平急剧下降，但生产流量是持续的，这与天冬氨酸对缺氧PDAC细胞生长的生物合成限制相矛盾。在稳定状态下，代谢产物产生的流量等于其消耗的流量。因此，尽管生产流量持续，但天冬氨酸浓度的显著下降可能表明天冬氨酸利用率和细胞需求发生了变化。由于天冬氨酸为增殖所需的嘧啶生物合成提供燃料，缺氧PDAC细胞在极端缺氧时产生天冬氨酸的能力也意味着PDAC细胞能够维持核苷酸的合成。我们观察到，相对于非PDAC细胞，PDAC细胞在缺氧状态下仍能持续合成核酸酶，这表明天冬氨酸生产下游的代谢途径仍能持续活性(图S2O)。值得注意的是，A549肺癌细胞系在严重缺氧条件下，13C5谷氨酰胺形成的天冬氨酸动态标记模式不稳定，这妨碍了对合成流量的准确估计（图2G）。在引入标记培养基后，A549细胞试图维持类似于常氧培养条件的氧化天冬氨酸（M+4）标记动力学。然而，标记模式很快（在1小时内）转变，以建立一个独特的稳定状态，由此M+4产量显著减少，接近0%（图2G）。这些数据表明A549细胞具有显著的相对静态的耗氧量，能够迅速地排出维持M+4产生所需的有效氧。
为了了解还原性谷氨酰胺代谢是否能够补偿氧化GOT2依赖性天冬氨酸生物合成的减少，我们量化了摩尔百分比富集（MPE），这是谷氨酰胺碳随时间对天冬氨酸的总贡献。与8988T细胞不同，A549细胞同时具有M+4标记（图2E）和来自谷氨酰胺的MPE（图S2P），A549细胞在严重缺氧条件下表现出谷氨酰胺对天冬氨酸生物合成（图S2P）的贡献减少了30%，并且不能被还原性胞质天冬氨酸（M+3）生成的增加所补偿（图S2Q），因此我们假设PDAC细胞可以通过有效利用缺氧微环境中的氧气来维持氧化代谢；缺氧条件下PDAC细胞中13C5谷氨酰胺13C掺入的稳态分析表明，在缺氧的情况下（图2H），天冬氨酸的氧化产物显著减少，与0.1% O2条件下非PDAC细胞中观察到的情况相似，表明PDAC耗氧效率提高。缺氧时耗氧效率的提高将延长肿瘤中的氧利用率，在血管扩散受到限制的肿瘤中赋予氧化代谢和增殖能力。
图2 胰腺癌细胞在严重缺氧时维持氧化代谢
(A)通过计算[U]-13C5谷氨酰胺在稳态下M+4:M+3的分数，测定缺氧（0.1% O2）中24小时后GOT2的相对活性(平均值±SEM, n = 3)。(B)通过计算[U]- 13C5谷氨酰胺在稳态下M+3:M+4的分数，测定缺氧（0.1% O2）中24小时后GOT1的相对活性(平均值±SEM, n = 3)。(C)显示下游标签掺入[U]- 13C5谷氨酰胺的示意图。M+4通过线粒体天冬氨酸转氨酶2 (GOT2)的氧化活性(浅灰色)产生，M+3通过细胞质天冬氨酸转氨酶(GOT1)的还原活性产生(深灰色)。(D)低氧(0.1% O2) GOT2活性(M+4:M+3)与低氧(0.1% O2)生长速率(每小时)的线性回归。根据图S1中的生长曲线计算缺氧（0.1% O2）增长率。(E)用[U]- 13C5谷氨酰胺在正常和严重缺氧（0.1%O2）8988T细胞中的动力学标记数据(平均值±SEM, n = 3)。(F)用[U]- 13C5谷氨酰胺计算正常和严重缺氧（0.1% O2）8988T细胞的天冬氨酸生产通量（平均值±95%可信区间[CI]，n=3）。(G)用[U]- 13C5谷氨酰胺在正常和严重缺氧（0.1% O2）A549细胞中的动力学标记数据（平均值±SD，n=3）。(H)在缺氧（0% O2）或缺氧（0.1% O2）条件下24小时后，8988T和A549细胞中[U]-13C5谷氨酰胺的天冬氨酸（M+4）百分比（平均值±SD，n=3）。缺氧（0.1% O2）8988T和A549的数值如（E）和（G）所示。(A)和(B)采用Dunnett’s多重比较检验检验显著性，其中***p < 0.001, and ****p ≤ 0.0001。(B)-(E)采用Dunnett’s多重比较检验检验显著性，其中n.s.≥0.05，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p ≤ 0.0001。
2. 线粒体呼吸超复合体支持胰腺癌严重缺氧期间有效的电子转移
我们的研究结果表明，在低氧条件下，胰腺癌细胞的线粒体氧化代谢被保留以允许生长。我们假设，为了实现这一点，PDAC细胞必须使用机制来保存健康的线粒体池，并使有效利用低浓度的氧气可用。透射电镜(TEM)分析显示，8988T细胞在严重缺氧状态下仍能维持线粒体数量(图3A和3B)和形态(图3)。然而，A549细胞在缺氧条件下无法增殖或维持细胞活力，线粒体数量、嵴密度和形态显著下降，表明线粒体适合度下降(图3)。维持健康的线粒体池需要生物发生、裂变、融合和降解的动态平衡。这些过程的差异可能会损害细胞活力，表明线粒体动态在严重缺氧的胰腺癌细胞中保持完整，并可能是观察到的生长和氧化线粒体活性的一个关键组成部分。
呼吸链复合物在线粒体内膜褶皱内组装成称为超复合物的四级结构，线粒体嵴形状决定呼吸链超复合物的组装和呼吸效率。由于在缺氧胰腺癌细胞中线粒体和嵴的形态没有改变，我们推测线粒体超复合物的存在可能有助于提高ETC效率。通过蓝绿温和胶（BN-PAGE）对超复合物形成的对比分析证实，缺氧PDAC细胞中存在呼吸超复合物，其中呼吸超复合物的丰度和组成似乎并未受到氧张力的实质性影响（图S3A和S3B）。然而，在缺氧A549细胞中观察到高分子量超复合物的丰度显著降低（图S3A和S3B）。线粒体呼吸超复合物稳定的关键决定因素是特定的组装因子，如SCAF1（SCAF1是COX7A2（COX7A2L）的长亚型），是稳定含有超络合物的络合物III和络合物IV所需的真正的超络合物组装因子。由于HIF已被报道通过更有效的电子转移来调节细胞色素C氧化酶（COX）亚型的表达以优化低氧下的呼吸效率，我们评估了严重缺氧时COX7A2L的表达。与这些报告一致，我们检测到COX4-2的mRNA表达增加（图S3C），同时COX4-1（图S3D）在暴露于0.1% O2的所有细胞系中同时降低。与PDAC细胞不同，在肺癌细胞中观察到COX7A2L的mRNA和蛋白质表达均降低（图S3E和S3F），这与在极低氧条件下观察到的线粒体数量减少一致。总的来说，这些结果表明PDAC细胞系在严重缺氧时维持线粒体数量和形态，维持呼吸活动和线粒体超复合物的组装。
图3 胰腺癌细胞在严重缺氧时维持线粒体形态
（A）正常氧（左）或严重缺氧（0.1% O2）（右）24小时后8988T（上）和A549（下）细胞系的典型TEM图像。（B）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）条件下8988T和A549细胞的线粒体数量。利用单盲法（平均值±SEM，n=6），在34003倍放大率下，每个条件收集了至少6张图像。（C）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）8988T和A549细胞线粒体嵴数的定量分析。用单盲法收集的图像中随机计算每个条件下21到39个线粒体的最大嵴宽度（平均值±SEM，n>20）。（D）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）下8988T和A549细胞平均嵴长度的定量分析。平均嵴长度是从每个条件下随机收集的2139个线粒体从用户盲法收集的图像（平均值±SEM，n>20）计算。（E）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）下8988T和A549细胞最大嵴宽度的定量分析。从每个条件下随机采集的2139个线粒体，用单盲法收集的图像计算最大嵴宽度（平均值±SEM，n>20）。
我们假设通过COX7A2L的基因靶向破坏超复合物的组装可能会通过降低ETC的效率而使PDAC细胞系对低氧环境敏感。使用两个独立的发夹对抗COX7A2L（图4A和S4A），我们发现复合I连接和复合IV连接呼吸减少（图S4B），但对基础呼吸无显著影响（图S4C）。与此同时，还观察到含有复合物III和复合物IV的超配合物的减少(图S4D)，表明两种发夹均有靶向效应。透射电镜分析显示，在失去COX7A2L后，嵴长度显著减少（图S4E）和最大嵴宽度增加（图S4F），这对线粒体数量（图S4G）或每个线粒体的嵴数量（图S4H）没有显著影响，与氧张力无关。重要的是，COX7A2L的缺失并不影响内源性ETC复合物I、III和IV的表达（图4A），这意味着通过COX7A2L的基因靶向而丧失超复合物组装提供了一种将超复杂物活性与单个ETC复合物活性分离的机制。
为了评估失去超复合物形成的功能影响，我们描述了COX7A2L缺陷PDAC细胞的代谢特征。COX7A2L的丧失显著降低了ATP水平（图4B），在严重缺氧中观察到更为严重的下降，这表明呼吸超复合物的耗竭选择性地影响这些氧张力下的线粒体效率。接下来，我们推断氧化还原平衡（氧化还原反应）也会因COX7A2L的丢失而受到干扰。缺氧通过减缓电子传递和降低NADH氧化速率来降低线粒体NAD+/NADH比率。除了在缺氧时观察到的NAD+/NADH降低外，COX7A2L的损失在NAD+/NADH比率中降低，特别是在低氧条件下（图4C）。因此，我们推测COX7A2L缺陷细胞表现出线粒体效率降低，这将限制PDAC细胞在严重缺氧条件下的增殖能力。我们发现COX7A2L缺陷细胞在0.1% O2中表现出明显的膜电位（图4D）和天冬氨酸生产通量（图4E）的降低。此外，我们观察到COX7A2L缺陷PDAC细胞的增殖能力显著降低，特别是在低氧环境中（图4F），通过添加丙酮酸盐（图4G）而不是Mito-TEMPO（图4G）可以持续挽救这种细胞的增殖能力。为了探讨外源性COX7A2L的表达是否能够挽救缺氧性生长，我们在8902细胞系（图S4I）中过度表达COX7A2L，与其他PDAC细胞系相比，其内源性COX7A2L水平较低（图S3D）。适度过度表达COX7A2L可增加基础呼吸、复合物III连接呼吸和复合物IV连接呼吸（图S4J和S4K），导致增殖能力增加，与氧张力无关（图4L）。总的来说，这些数据表明线粒体超复合物的维持对于严重缺氧的生长非常重要，因为它为胰腺癌细胞提供了代谢优势（图4H）。
图4 在严重缺氧的胰腺癌细胞中，线粒体呼吸超复合体是代谢适应所必需的
（A）具有代表性的蛋白质印迹显示在8988T细胞中COX7A2L被敲除，内源性复合物I（NDUFB8）、复合物III（UQCR2）和复合物IV（MTCO1）的表达不变。ERK2用作加载控制。（B）重度缺氧（0.1% O2）24小时后8988T细胞（左）和MIAPaCa-2细胞（右）细胞ATP水平下降百分比，并伴有COX7A2L丢失。ATP水平标准化为蛋白质含量。数据以shGFP（绿色荧光蛋白）的百分比表示（平均值±SEM，n=3）。（C）严重缺氧（0.1% O2）8h后，8988T细胞（左）和MIAPaCa-2细胞（右）中NAD+/NADH的比值（平均值±SD，n=3）。（D）正常氧和重度缺氧（0.1% O2）条件下COX7A2L敲除8988T细胞的相对TMRE荧光。TMRE值标准化为线粒体大小和FCCP处理。每个条件记录12-22个字段。（E）用[U]-13C5谷氨酰胺（平均值±95%可信区间[CI]，n=3）量化在常氧和严重缺氧（0.1% O2）条件下COX7A2L缺失的8988T细胞的天冬氨酸生产通量。（F）在常氧或严重缺氧（0.1% O2）条件下5天后，通过COX7A2L敲除的8988T、MIAPaCa-2、PANC-1、HPAC和8902细胞的相对细胞数（数据与shGFP对照组相关），（平均值±SEM，n=3）。（G）在严重缺氧（0.1% O2）下，用外源性丙酮酸（0.25 mM）或米托替波（20 mM）处理5天后，8988T细胞（左）和MIAPaCa-2细胞（右）生长变化的百分比。所示数据与shGFP相关（平均值±SEM，n>3）。（H）图解说明缺氧胰腺癌细胞失去超复合物的代谢后果。完整的超复合物（左）和丢失的超复合物（右）是使用呼吸体（复合物I，III2和IV）来证明的。在（B）–（G）中使用Dunnett的多重比较试验确定显著性，其中n.s.≥0.05，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
3. 有效的电子转移通过减少氧化应激和提高代谢效率对体内肿瘤的生长非常重要
由于氧张力的降低增加了胰腺癌细胞线粒体呼吸超复合物的功能相关性，我们假设扰动超复合物的形成会影响肿瘤的生长。为了验证皮下肿瘤模型中是否存在肿瘤缺氧，我们进行了光声成像以区分氧和脱氧血红蛋白的区域（图S4M）。皮下肿瘤显示出相似的氧合模式，其中组织氧合在增生边缘周围较高，而向肿瘤核心持续降低（图S4M）。为了确定失去超复合物是否能减少肿瘤生长，我们将COX7A2L基因敲除的胰腺癌细胞皮下植入，并评估肿瘤进展情况。胰腺癌细胞中COX7A2L的缺失导致肿瘤生长动力学和负荷显著降低（图5A 5D），其中在发夹处观察到更显著的影响，从而导致更强的COX7A2L敲除（图S4N）；相反，COX7A2L的过度表达增强了肿瘤生长动力学（图S4O和S4P）。这些结果表明，通过超复合物组装进行有效的电子转移对于体内肿瘤的生长是非常重要的。为了证实超复合物在维持体内ETC效率中的作用，我们利用脂质过氧化的标志物丙二醛（MDA）评估了由ETC损伤引起的活性氧物种（ROS）的生成。与对照组相比，缺乏COX7A2L的皮下肿瘤的MDA染色呈上升趋势(图S4Q)。此外，裂解的caspase-3的染色也有所增加(图S4R)。然而，Ki67的染色没有显著差异（图S4S）。这些结果表明，由于ETC效率受损，失去超复合物会增加ROS介导的损伤和细胞死亡。
除了在所有真核生物中发现的COX依赖性呼吸途径外，植物和低等生物通过交替氧化酶（AOX）进行另一种呼吸途径。AOX能使电子从泛醌转移到氧而不影响质子梯度，从而绕过内源性复合物III和IV的活性：因为AOX的存在不影响NADH连接的氧化磷酸化，所以膜电位/完整性和超络合物组装都不会受到影响。在内源性ETC络合物存在下，AOX竞争电子。然而，与络合物III相比，AOX对泛醌的亲和力较低（0.53 0.38 mM，而<20 mM）；因此，当复合物III和下游细胞色素途径功能完整时，AOX不接受电子。只有当泛醌被过度还原时，例如当复合物III或IV功能失调时，AOX才会将电子从泛醌转移到氧。
为了确定绕过ETC的复合物III和IV是否能减轻缺氧胰腺癌细胞在超复合物组装破坏时所观察到的生长缺陷，我们在PDAC细胞中异位表达玻璃海鞘中的AOX，并用复合物III抑制剂抗霉素A处理细胞以确保AOX的功能性。表达AOX的胰腺癌细胞能够在抗霉素A存在下恢复耗氧量（图S5A）、生长（图S5B）和天冬氨酸丰度（图S5C），这意味着AOX在内源性复合物III的存在下具有适当的功能。因为AOX对氧的亲和力比COX低（1 2 mM比0.1 0.15 mM），我们的体外研究将氧的功能性从0.0%增加到1%。在暴露于1%氧气的细胞中，AOX的表达恢复了天冬氨酸水平（图S5D和S5E），并显著挽救了COX7A2L缺陷细胞的缺氧生长（图5E）。重要的是，在COX7A2L野生型细胞中没有观察到差异，这表明在完整超配合物存在的情况下，AOX不参与电子转移。这些结果表明，AOX的存在可以绕过在体外缺氧应激条件下与超复合物形成丢失有关的代谢和生长缺陷。
为了确定AOX的表达是否能在COX7A2L被敲除时挽救体内生长，我们将COX7A2L缺失的对照或AOX表达细胞皮下植入以评估肿瘤生长；我们发现AOX的表达在肿瘤进展和体重方面弥补了COX7A2L敲除的体内生长缺陷（图5F和5G）。接下来，我们评估了肿瘤内的天冬氨酸水平，发现COX7A2L的缺失降低了肿瘤内的天冬氨酸，这与体外数据一致，AOX的加入完全挽救了这一点（图5H）。此外，在具有完整的超复合物组装的情况下，对照组和表达AOX的肿瘤在生长或大小上没有差异，这表明AOX只有在破坏超复合物形成时才具有功能活性。总的来说，这些数据表明，失去超复合物组装会影响体内ETC的效率/功能性，使AOX活性得以挽救与COX7A2L损失相关的生长和代谢缺陷（图5I）。
图5 通过超复合物组装的呼吸效率对体内生长很重要
（A）在皮下植入2×106个8988T细胞并丢失COX7A2L后，记录测定肿瘤体积的测量值，以评估肿瘤生长情况（平均值 SEM，每组n≥8，第93天p=0.015）。（B）在终点测量肿瘤重量（平均值 SEM，每组n≥8，第93天p=0.021）。（C）在2×106个缺失COX7A2L的MIAPaCa-2细胞皮下植入后，记录测定肿瘤体积的测量结果，以评估肿瘤生长情况（平均值 SEM，每组n≥7，第24天p=0.0059）。（D）在终点测量肿瘤重量（平均值 SEM，每组n≥7，24天p=0.0302）。（E）表达空载体（EV）或AOX的MIAPaCa-2细胞在1%氧气条件下增殖5天后的相对细胞数（平均值 SEM，每组n=5，p=0.0223）。（F）在2×106个表达EV或AOX的MIAPaCa-2细胞在COX7A2L缺失的情况下被植入皮下后，记录确定肿瘤体积的测量结果，以评估肿瘤生长情况（平均扫描电镜，每组nr9，第18天p=0.0271）。（G）在两个独立实验的终点测量肿瘤重量（平均值 SEM，每组n≥14，p=0.0147）。（H）用气相色谱-质谱法（GC-MS）从第12天采集的5mg组织中定量分析肿瘤天冬氨酸水平（平均值 SEM，n=5，p=0.0116）。（I）示意图显示AOX表达的胰腺癌细胞如何拯救与缺氧胰腺癌细胞超复合物形成丢失相关的代谢和增殖缺陷。在（A）–（G）中使用Dunnett的多重比较试验确定显著性，其中n.s.≥0.05，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
讨论
胰腺癌严重缺氧的程度被预测对这些肿瘤的生物学意义重大。我们的数据表明胰腺癌细胞在极度缺氧的环境（0.1%的氧气）中保持着旺盛的增殖，在这种极端缺氧环境中生长的能力矛盾地依赖于氧化代谢和线粒体呼吸的活动和维持。
缺氧是一种生理状态，它可以作用于主要器官和组织，导致氧张力低于空气饱和组织氧合在3%到7%之间，但可以低至0.5%，例如，在大范围内。对于ETC活性，氧气水平在0.3%时成为速率限制；然而，COX对氧气具有非常高的亲和力，表观KM值接近0.1% O2。我们发现胰腺癌细胞在缺氧水平下有效率，这种现象在其他低缺氧的肿瘤类型中并不普遍，对高效呼吸的要求决定了胰腺癌的缺氧生长。
我们的研究表明，通过COX7A2L基因靶向形成线粒体超复合物有助于提高呼吸效率；然而，这并不排除其他环境中其他组装因子的扰动也可能导致线粒体柔软度降低的可能性。线粒体超复合物的形成在正常氧的胰腺癌细胞中是多余的，这表明在有限的氧气条件下，有效的电子转移变得越来越重要。与我们的发现一致，线粒体超复合物最近被描述为增加胸廓子宫内膜癌的耐缺氧能力。此外，我们显示这些肿瘤类型在缺氧条件下保持显著的生存能力，说明了胰腺癌缺氧的严重性，并强调了肿瘤根治术具有挑战性的另一个原因。我们的数据表明，生长需要氧气，但不一定要维持生存能力，这可能对肿瘤生物学有重要意义。
没有完整或有功能的线粒体，细胞将被迫依赖外源性营养来源，例如如修复和增殖，从而进行细胞过程。胰腺癌的特点是基底水平高的自噬和大胞饮增多，这被认为在缺氧时增加，提供细胞代谢物。我们的结果表明，独立于此，胰腺肿瘤细胞有独特的能力维持氧化线粒体代谢，持续合成代谢和在缺氧下生长。此外，这种表型可能与Kirsten大鼠肉瘤（KRAS）状态无关，因为研究中使用的大多数PDAC细胞系都是KRAS突变株，MDA-MB-468除外。据报道，天冬氨酸可抑制体内某些类型肿瘤的生长，但在胰腺癌中未发现这种情况。通过调节线粒体氧化还原以允许卵泡和维持天门冬氨酸的合成，胰腺癌中的线粒体效率可能为这种情况提供一种解释。据报道，HIF1通过抑制GOT1和GOT2活性和表达直接抑制天冬氨酸生物合成；虽然我们观察到所有受测细胞系的HIF1稳定，但我们没有观察到GOT1或GOT2表达的普遍抑制（图S2J）。
线粒体功能障碍的细胞和缺氧细胞中，还原性羧化作用的增加已经得到了很好的描述。据推测，线粒体NAD+/NADH降低时，还原性羧化作用增加，以转移氧化TCA循环代谢中的碳，增加新生脂肪生成，并通过苹果酸脱氢酶再生NADH，以维持糖酵解。因为我们的数据表明，胰腺癌细胞在缺氧时诱导还原性羧化的程度与其他细胞类型不同，这可能表明它们更有效地维持NAD（H）内稳态。
我们的研究结果表明，PDAC中的呼吸超复合物对严重缺氧条件下的代谢效率是必要的。细胞株在严重缺氧时不能维持增殖或在缺氧中存活，线粒体数量和形态都会发生生理性的下降，这可能会对呼吸功能产生负面影响。据报道，缺氧可诱导线粒体分裂以促进有丝分裂，通过自噬有效地消除受损的线粒体，从而限制ROS的生成。进一步说来，这可能表明胰腺癌细胞已经进化出强大的细胞机制来减少线粒体ROS和/或损伤。尽管我们的数据有力地支持PDAC细胞在严重缺氧下保持完整的ETC功能，但通过TMRE荧光强度测量线粒体膜电位可能会因线粒体形态、位置或质量的差异而混淆。此外，在能量学受损的情况下，通过逆转不健康线粒体中的ATP合成酶可以维持膜电位。
总的来说，我们的研究表明，无论在体外还是在体内，线粒体呼吸超复合体都是胰腺癌细胞在严重缺氧状态下生长的重要组成部分。通过靶向促进其组装或维持其稳定性的关键蛋白来扰乱超复合体的形成，可能对这种致命疾病有治疗应用。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124720312201
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