编译：王艳林，编辑：Emma、江舜尧。
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杂种优势广泛存在于动植物中。尽管杂种优势的分子基础已得到广泛研究，但是代谢和蛋白质组学对杂种优势的贡献仍然未知。在本研究，作者报道了玉米杂种及其自交亲本中时间序列代谢组和蛋白质组数据的综合分析。玉米的许多代谢物和蛋白质都受到昼夜调节，其中许多在杂种中显示出非加性丰度，包括参与碳同化作用的关键酶和代谢物。与强性状杂种优势相比，代谢杂种优势相对温和。有趣的是，大多数氨基酸显示出负的中亲杂种优势（MPH），即，其值低于亲本的平均值，而糖，醇和核苷代谢物则显示出正的MPH。从网络的角度来看，光合途径中的代谢物显示正MPH，而光呼吸途径中的代谢物显示负MPH，这对应于杂种各自途径中非加性蛋白质的丰度和关键酶的酶活性。此外，在杂种中上调的日间调节蛋白在光合作用相关的GO术语中被富集。杂种可以更有效地去除光呼吸过程中产生的有毒代谢物，从而保持较高的光合作用效率。这些代谢和蛋白质组学结果提供了对杂种优势及其在高产玉米和其他农作物中的利用的独特见解。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 玉米杂种及其亲本的昼夜调节和代谢组的独特模式
对玉米自交系B73和Mo17，F1杂种（B73×Mo17，BM）和反向杂交的Mo17×B73（MB）的幼苗（播种后9天，DAP）的一个昼夜周期内每三小时的样品（三个重复）进行了代谢物含量的测定。[M1] 使用非靶向气相色谱飞行时间质谱（GC-TOF-MS），在6个日间和3个夜间点鉴定了447种非冗余代谢物，包括每种基因型的191种带注释代谢物（补充数据集1）。在本研究中生成的代谢组数据通常是高质量的，对于90％的代谢物，生物学重复的变异系数（CV）低于0.1（补充图1）。
对9个时间点（图1A）鉴定出的代谢物进行了主成分分析（PCA）。值得注意的是，自交和杂种中的代谢物彼此明显分开（对应于PC2），表明杂种与其亲本之间存在主要的代谢组学差异。尽管数据仅限于一个昼夜周期，但自交系和杂种中昼夜之间的代谢物分离（对应于PC1）表明玉米中代谢物的潜在昼夜调控。两个自交亲本之间的代谢组比两个杂种之间的差异更大，杂种的代谢组在两亲本中间。
方差分析（ANOVA）进一步证实了基因型和昼夜变化对这些代谢物的影响（FDR调整的P <0.05）。在447种代谢物中，有369种（82.6％）受到了昼夜效应，而265种（59.3％）表现出了基因型效应，而44种（9.8％）表现出了基因型和昼夜效应之间的相互作用（图1B，补充数据集2）。关键代谢过程的一些重要组分或中间体是最主要的代谢物，包括丙酮酸和半乳糖6-磷酸（昼夜效应）作为CO2穿梭和C4光合作用的中间体，果糖和甘露糖-6-磷酸（昼夜效应）是植物发育中的能源或信号分子，核糖，腺嘌呤和苏氨酸（基因型效应）是大分子的组成部分（表1）。
代谢丰度的层次聚类分析表明了玉米代谢组的昼夜调节（图1C）。确定了三个主要的簇：簇1由132种代谢物组成，在清晨比夜晚显示出更高的丰度；簇2，最大的簇，由174种代谢物组成，在夜间达到峰值；簇3，由141种代谢物组成，在不同时间点的基因型之间显示出丰度的混合模式。代谢途径分析（FDR调整的P <0.05）表明，代谢物在簇1和3中富集，主要涉及柠檬酸循环，碳固定和氨基酸代谢（补充表1）。
图1 玉米代谢组的时间和基因型影响模式
（A）种植后第9天（DAP）的4个基因型（B73，Mo17和两个杂种F1BM和F1MB）在9个时间点的玉米代谢组的主成分分析。生物重复显示为个体。杂种样品用椭圆表示；日间和夜间时间点分别是ZT0-15和ZT18-24。（B）447种代谢物的双因素方差分析显示了昼夜或基因型效应在统计学上的显著水平（P＜0.05）。（C）在整个昼夜周期内代谢丰度分布的层次聚类分析。计算了代谢丰度平均值，并进行z分数转换。每个柱（时间点）由四列组成，分别代表B73，Mo17，F1BM和F1MB（从左到右）。补充表2总结了每个簇中代谢途径的GO富集。水平线表示聚类之间的边界。
表1 方差分析确定了受到昼夜（15）或基因型影响（10）的主要代谢物
2. 杂种中代谢物的普遍非加性和轻度杂种优势水平
接下来，租着研究了杂种中有多少种鉴定出的代谢物显示出偏离中亲本值（MPV，两个亲本的平均值）非加性积累模式（图2A）。在447种代谢物中，在一个或多个时间点（在F1BM和F1MB中分别为265和266）被确定为在互交杂种中非加性积累或非加性代谢物（P <0.05，Student's t检验）为356个（79.6％），两个杂种共享约49.2％（175/356）的代谢物（图2B）。它们中的大多数（133，76％）显示出相同方向的变化，高于或低于BM和MB的MPV。日间和夜间的非加性代谢物数量分别为291和232，而日间非加性代谢物的57.4％（167/291）与夜间的重叠（图2B）。日间每个时间点的非加性代谢物的平均数量略高于夜间（103对88）（P = 0.08，Welch t检验）。在整个日间时间点，高于或低于MPV的非加性代谢物的数量是相当的，而在夜间早期（ZT18）高于MPV的比例明显低于夜间晚期时间点（ZT21，ZT24）（P <0.005，Fisher精确检验）（图2A）。
为了定量研究代谢杂种优势，作者计算了191种带注释的代谢物的每一个的中亲杂种优势率（MPH），为MPH = 100 * D/A，其中“D”是杂种与两个亲本平均值之间的偏差（“A”）。发现，胺和氨基酸等代谢物显示出显著的负MPH，而糖，脂质和核苷则显示出正MPH（图3，A和B）。令人惊讶的是，日间和夜间的绝对MPH中位数分别为2.7％和2.6％，观察到的最大MPH为33.4％。其中，119（62.3％）和108（56.5％）个代谢物具有相对“较小”的绝对MPH，在日间和夜间时间点分别从2.0％到5.0％（图3，C和D），而42 在白天和晚上，分别有（22.0％）和37（19.4％）个带注释的代谢物具有“大的”绝对平均MPH，在所有时间点上均大于5.0％。而在日间和夜间时间点，分别有42个（22.0％）和37个（19.4％）的带注释的代谢物具有“较大”的绝对平均MPH，在所有时间点均大于5.0％。这种代谢物杂种优势的规模对于玉米杂种来说是温和的，与以前报道的更高的表型杂种优势形成鲜明对比。
图2 日间和夜间非加性表达代谢物的分析
（A）使用Student t检验确定每个时间点的非加性代谢物数量（P <0.05）。红色和蓝色柱子分别表示杂种中代谢物的含量高于或低于亲本中值。**表示P <0.005（Fisher精确检验）的统计显著水平。（B）互交杂种之间（F1BM和F1MB，左）以及日间和夜间时间点之间（右）的非加性代谢物的重叠。
图3 玉米代谢杂种优势的昼夜调控
（A-B）箱线图显示了日间（ZT0、3、6、9、12、15）和夜间（ZT18、21、24）每个代谢类别中相对中亲杂种优势的分布。*和***分别表示中亲杂种优势（MPH）的平均值在P <0.05和P <0.0005水平具有统计学意义（Student t检验）。（C-D）箱线图显示了日间和夜间时间点每种已知代谢物的MPH分布。通过虚线表示负杂种优势（中位数MPH值<-2％）和正杂种优势（中位数MPH值> 2％）。图3C，D中的色标与图3A，B中的色标相同。垂直虚线表示MPH为负或正的代谢物的临界值。
3. 节律性代谢物在杂种中往往是非加性的
在整个昼夜周期的9个时间点的代谢数据使作者能够研究玉米代谢组的节律性。根据JTK_CYCLE方法确定昼夜节律性，其中447种（59.5％）代谢物中的266种（在基因型中介于145至158之间）被确定为有节律性代谢物（FDR调整的P <0.05）（图4A）。在每个主要代谢类别中，超过一半的代谢物具有节律性，尤其是氨基酸和醇类，其中超过70％具有节律性。大部分氨基酸（86％）在日间达到峰值，而近一半（47％）在ZT9达到峰值（图4B）。到了夜间，每种类别的酸，醇和糖的一半以上都显示出峰值，其中最大的峰出现在ZT21。重要的是，所有糖类从下午（ZT9）到午夜（ZT21）达到峰值，并且没有糖类在深夜（ZT24）达到峰值。
对于266种节律性代谢物，所有四个基因型共享65种（24.4％），两个自交亲本和互交杂种分别共享96种（48.2％）和93种（42.9％）（图4C）。该结果表明节律性代谢物在自交亲本之间和/或自交与F1杂种之间是可变的。测定代谢物的技术限制也可以造成某些变化。有趣的是，F1BM（127/152）和F1MB（133/158）的大部分节律行代谢物在杂种中也显示出非加性模式（图4D）。节律性非加性代谢物的比例（F1BM为83.6％，P = 2.3E-08或F1MB为84.2％P = 5.8E-09）显著高于所有测定代谢物的非加性代谢物（55.6％，265/447）（Fisher的精确检验），这表明节律性代谢物在杂种中倾向于非加性模式。
此外，大多数氨基酸在杂种中显示负MPH，而糖，醇，脂质，核苷，磷酸糖和其他代谢物倾向于随时间点变化显示正MPH（图4E）。酸在各个时间点和互交杂种中表现出MPH的较大差异，并且在黎明和夜间更可能呈现负MPH（图4E）。在23个氨基酸中，有15个和19个的MPH中值分别在日间和夜间时均低于零，其中14个具有统计学意义（图4F）。脯氨酸，瓜氨酸和谷氨酰胺等某些氨基酸在日间和夜间改变了MPH的变化方向。在夜间，正MPH的核苷多于日间（图4G）。腺苷和腺嘌呤在日间和夜间均持续显示出显著的正MPH。有趣的是，腺苷-5'-单磷酸（AMP）将其MPH方向从日间的不显著转换为夜间的显著负值。
图4 玉米杂种及其自交系中代谢组的昼夜和非加性调控
（A）饼状图显示了不同类别的振荡代谢物的相对组成。括号中显示了每个类别中节律性代谢物的百分比。（B）在各时间点振荡代谢物在四个主要类别中的分布。（C）F1杂种及其自交亲本中节律性代谢物的比较。（D）互交F1杂种（BM和MB）的节律性和非加性代谢物的比较。（E）热图显示所有带注释的节律代谢物的相对中亲杂种优势（MPH）。（F）各个氨基酸中MPH的变化；三角形标记节律性代谢物；绿色和红色箱线图分别表示标准氨基酸和修饰氨基酸。（F）和（G）中的*表示在显著水平P <0.05（Student t检验）下的MPH平均值。（G）各个核苷中MPH的变化；三角形标记节律性代谢物；绿色和红色箱线图分别表示核苷酸和核苷酸碱基。
4. 光合途径中的正MPH，光呼吸途径中的负MPH
这些昼夜之间以及亲本与杂种之间节律性代谢物非加性积累的数据可能表明代谢杂种优势中代谢途径的时间调控。进一步的分析表明，参与光合作用，卡尔文循环和糖代谢的代谢物（图5A）倾向于表现出正MPH（图5，C和D），包括丙酮酸和苹果酸（光合作用中重要的CO2穿梭），核糖1,5-双磷酸酯（RuBP；卡尔文循环中的CO2受体）以及蔗糖和麦芽糖（光合作用的产物）。参与光呼吸途径的代谢物（图5B），如谷氨酰胺，甘氨酸和丝氨酸，在统计上显著水平显示出负的MPH（图5，C和D）。此外，这些代谢物中的许多代谢物都是有节律性的，并且在昼夜之间的杂种中具有不同程度的MPH（图5E）。例如，丙酮酸在日间（P = 0.001）仅显示出显著正的MPH，而在夜间（P = 0.84）则没有显示出正的MPH，这与其在光合作用中的作用是一致的。这些结果表明，与亲本相比，杂种中更高的光合作用效率可能是由于光合作用中关键的CO2转运蛋白的升高和光呼吸抑制所致。总的来说，这些变化可以使杂种通过增加光合产量同时减少光呼吸消耗来增强净CO2吸收。
图5 C4光合和光呼吸途径中代谢杂种优势的昼夜调节
（A）示意图显示了C4光合作用中的关键酶和代谢物。Chl，叶绿体；Pero，过氧化物酶体；Mito，线粒体。CO2进入叶片的叶肉（M）细胞，并通过碳酸酐酶（CA）转化为碳酸氢盐（HCO3-）。HCO3-用于通过PEP羧化酶（PEPC）生产羧化碳酸烯醇式丙酮酸（PEP）。产生的草酰乙酸（OAA）在叶肉叶绿体中被苹果酸脱氢酶（MDH）转化为苹果酸，然后扩散到维管束鞘（BS）细胞中。苹果酸在BS叶绿体中被苹果酸酶（ME）脱羧释放出CO2，最终进入卡尔文循环并被固定生成糖。（B）示意图显示了光呼吸途径中的关键酶和代谢产物。在叶绿体中，RuBisCO将RuBP（核糖1,5-二磷酸核糖）转化为3PGA（甘油酸-3-磷酸）和2PG（2-磷酸乙醇酸）。然后在卡尔文循环中将3PGA转换回RuBP，将2PG转换为乙醇酸，然后在过氧化物酶体中通过乙醇酸氧化酶（GOX）将其氧化为乙醛酸和H2O2。乙二醛与谷氨酸（Glu）一起用于产生甘氨酸，然后通过线粒体中的甘氨酸脱羧酶（GDC）释放CO2和氨，将其转化为丝氨酸。在过氧化物酶体中，由丝氨酸制成加氢吡啶（羟基丙酮酸），然后通过HPR（羟基丙酮酸还原酶）还原为甘油酸酯。当甘油酸酯最终在叶绿体中转化回3PGA时，光呼吸完成，这可以重新进入卡尔文循环以产生碳水化合物。2OG，2-酮戊二酸；G3P，3-磷酸甘油醛。（C）在C4光合，光呼吸，卡尔文循环和糖代谢途径中鉴定出的代谢物的聚类分析；每个时间点的两列表示两个F1（BM和MB）杂种；热图色标指示中中亲杂种优势（MPH，％）；代谢物的文本颜色表示与（D）中不同的途径；Gln，谷氨酰胺；Gly，甘氨酸；Ser，丝氨酸；Asp，天冬酰胺；Glu，谷氨酸。（D）不同途径的代谢物表现出不同的模式。*和***分别表示代谢物MPH的平均值分别在P <0.05和P <0.0005的水平上具有显著差异（Student t检验）。（E）玉米C4光合和光呼吸途径中代谢过程中的节律性调节实例。线的颜色表示MPV（蓝色），F1（BM，红色）和F1（MB，绿色）。Y轴表示经过log2转换的归一化原始光谱的代谢物丰度。时间点上方的*和**分别表示MPV与其中一个杂种或两者之间在P <0.05和P <0.01水平上的显著性差异（Student t检验）。
5. 玉米蛋白质组表现出昼夜调控以及自交和杂种之间的差异
植物中的各种代谢物是代谢活动的中间产物或终产物，它们是由多种酶（蛋白质）催化的。为了探究自交亲本及其杂种之间代谢差异的原因，作者分析了B73和Mo17及其互交杂种（BM和MB）中四个不同时间点（ZT3，ZT9，ZT15和ZT21）的玉米幼苗蛋白质组（9 DAP）。对每个样品的所有三个重复样品中存在的蛋白质进行后续分析。使用非标记液相色谱-质谱（LC-MS）方法，在至少一个样品中检测到4,792个非冗余蛋白的表达，在基因型和时间点的变化范围从2,312至3,290个蛋白不等（补充图2A）。PCA结果显示，自交与杂种之间以及跨不同时间点的玉米蛋白质组均清晰分离（补充图2B）。
通常，植物在早晨和下午早期（ZT3和ZT9，n = 3,114和3,036）表达的蛋白质要多于黄昏（ZT15，N = 2,522）或晚上（ZT21，n = 2,662）。尽管自交和杂种在早晨（ZT3；3,155 vs. 3,072）和中午（ZT9；3,054 vs. 3,018）表达的蛋白质数量相当，但在自交亲本中表达的蛋白质比杂种中显著更多，即黄昏（2,654 vs. 2,391，P <0.0005）和夜间（2,902 vs. 2,423，P <0.0001，补充图2A和方法）。就平均值而言，跨时间点的所有四种基因型之间大约共享三分之二的蛋白质（补充图3）。在鉴定出的所有蛋白质中（4,792），分别有743（15.5％）和1,392（29％）代表显著的基因型和时间效应，而306（6.4％）个蛋白质代表了基因型和时间之间的显著相互作用（P <0.05，双因素方差分析）。约有一半显示基因型效应的蛋白质也表现出显著的日间效应（补充图4，A和B）。
在杂种中，在至少一个时间点（P <0.05，Student t检验）鉴定出1,025种蛋白质是非加性表达的，与其他时间点相比，在清晨（ZT3，362个蛋白质）和夜间（ZT21，503个蛋白质）中检测到的非加性蛋白质相对较多（补充图4C）。在互交杂种之间，F1BM中的592个非加性蛋白中的205个（占34.6％）与F1MB中的非加性蛋白重叠（补充图4D）。在不同的时间点上，非加性蛋白质的重叠部分很小（补充图4E），表明杂种中非加性表达的蛋白质的快速时间调控。分别有380和691个非加性蛋白在MPV之上和之下（补充图4F），在每个时间点内，MPV之下（110）的非加性蛋白质比MPV之上（62）的非加性蛋白质显著更多（P = 0.014，Student t检验）。
在整个时间点，通过JTK_CYCLE将2540种蛋白质鉴定为有节律性的（FDR调整P <0.05），占所有可检测蛋白质的一半以上（53％）（补充图5A）。在节律性蛋白质中，约60％对各个基因型具有特异性（补充图5B）。节律性蛋白的相位分布分析显示，杂种与自交亲本之间的相位相似，但与自交亲本相比，杂种在清晨（ZT3）和夜间（ZT21）上显示出较大比例的节律性蛋白（补充图6）。该数据支持了以前的发现，即在杂种中ZmCCA1（昼夜节律钟相关1）结合靶点到清晨的时间变化，作为光合作用活动的起点。
约30％的非加性蛋白质与节律性蛋白质重叠（补充图5，C和D）。有趣的是，对于那些既显示出非加和性又表现出节律性的蛋白质，杂种中上调的蛋白仅富集在与光合作用（GO：0015979，P = 1.00E-12），光合作用-光反应（GO：0019684，P = 7.70E-11），光系统I中的光和电子传递（GO：0009773，P = 3.80E-10）和细胞组分如光合膜（GO：0034357，P = 7.00E-15）相关的GO生物学过程术语（补充数据集3）。这种富集与杂种中代谢物丰度的富集类似。
6. 杂种中蛋白质（酶）和代谢物的一致变化
以上数据表明，玉米杂种中可能发生光合作用和光呼吸途径中的酶和代谢物之间的一致变化。作者测定了C4光合途径中的关键酶的丰度（图5A），这些酶在CO2的转运和固定中起着重要的作用。在F1MB杂种中，羧化磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）和苹果酸酶（ME）的丰度在早晨（ZT3），中午（ZT9）和晚上（ZT21）的均显著上调（P <0.05，Student t检验）（图6）。在F1BM杂种中，PEPC的丰度在ZT9和ZT21上调，ME在ZT21上调。丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）在两个互交杂种的上午（ZT3）以及F1MB晚上（ZT21）上调。而且，所有这些酶在早晨和中午（ZT3和ZT9）的丰度都比黄昏（ZT15）和夜间（ZT21）的丰度高。这些结果与同一时期幼苗的光合速率变化是一致的。这些关键酶在日间的上调可能赋予杂种更高的光合作用效率，也可以解释中亲杂种优势以及相关代谢物（如PEP，苹果酸，丙酮酸，RuBP，蔗糖和麦芽糖）中观察到的非加性更高的丰度（图5，CE）。
在光呼吸途径中（图5B），相对于MPV，杂种中的几种酶含量丰富（图7A）。在四个时间点，乙醇酸氧化酶（GOX）的丰度均高于MPV，且在ZT9具有显著性。作者提出，杂种中GOX丰度的非加性上调可以产生更高的H2O2浓度。为了验证这一点，作者针对每种基因型测定了同一阶段幼苗的叶片中的H2O2浓度（补充图7和方法）。在大多数时间点，杂种中的H2O2浓度均高于MPV，但仅在早上具有统计学上的显著性差异（ZT3，P <0.05）。经过分析，将日间时间点（ZT3，ZT9，ZT15）结合在一起，并与夜间（ZT21）时间点进行了比较后发现，两种互交杂种中的H2O2浓度在白天而非夜间显著高于MPV。
观察到的H2O2趋势与过氧化氢酶（CAT）蛋白丰度相一致，在两种杂种的夜间（ZT21）均被上调（图7A）；CAT负责清除乙醇酸氧化过程中产生的H2O2。进一步测定了GOX和CAT的酶活性，这与它们的蛋白质水平一致，并且分别在中午和夜间显示出非加性增加（补充图8），支持了它们在H2O2产生和清除中的各自作用。
对于杂种中的一些关键代谢物，PEP和丙酮酸（光合作用）在早晨或午后表现出较高的丰度，甘氨酸和谷氨酰胺（光呼吸）在下午表现出较低的丰度，蔗糖和果糖（卡尔文循环）在下午和夜间的某些时间点具有较高的丰度（补充图9）。甘氨酸脱羧酶（GDC）在夜间（ZT21）被上调，在午间（ZT9）被下调。F1BM杂种中ZT3，ZT9和ZT21的谷氨酰胺酮戊二酸氨基转移酶（GOA）被上调（补充图8）。结果表明，这些酶可能会在中午到下午早期加速代谢物（如Gln，Gly和Ser）的快速周转，从而导致夜间的丰度降低（补充图9）。
RCA和TK，这两个卡尔文循环中的关键酶在早晨和中午都具有相对较高的丰度（图7B）。互交杂种中，激活RuBisCO的RuBisCO活化酶（RCA）在ZT15被上调。值得注意的是，激活的RuBisCO位点的丰度而不是RuBisCO本身的丰度与玉米RuBisCO过表达品系的光合速率和鲜重呈正相关。此外，RCA基因表达与玉米籽粒产量呈正相关。转酮醇酶（TK）是加尔文循环中的关键酶，与糖的合成有关，在这两个杂种的ZT9和ZT21中均被上调。研究发现TK活性的小幅下降对烟草的RuBP再生和光合作用具有显著的抑制作用。与蛋白质丰度的结果一致，RCA和TK在不同时间点也显示出比MPV显著更高的酶活性（补充图8），这可能会导致下午和夜间的光合产物（如蔗糖，果糖和麦芽糖）的含量出现非加性高丰度（图5E；补充图9）。
代谢物2-磷酸乙醇酸（2PG），乙醇酸和乙醛酸对卡尔文循环和RuBisCO活性有毒。因此，有效地解毒这些代谢物对植物很重要。作者假设光呼吸途径中上述关键酶的上调可能通过有效去除抑制性代谢物来帮助杂种维持相对更有效的光合作用系统。这一假设得到了以下发现的支持：光呼吸相关的代谢物（如甘氨酸，丝氨酸和谷氨酰胺）在杂种中显示出负的MPH（图5，C和D）。此外，杂种中这些代谢物的下调也可能表明它们更快地转化为甘油酸-3-磷酸（3PGA），可用于卡尔文循环中进行糖的生物合成。
图6 C4光合作用途径中关键酶的时间丰度
蛋白质丰度显示为经log2转换和归一化的光谱数（y轴）。*表示杂种中的蛋白质丰度显著高于双亲中值（Student t检验）（P <0.05）。CA：碳酸酐酶（GRMZM2G121878），PEPC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（GRMZM2G083841），ME：NADP依赖性苹果酸酶（GRMZM2G085019），PPDK：丙酮酸磷酸双激酶（GRMZM2G097457）。
图7 光呼吸途径和卡尔文循环中关键酶的时间丰度
（A）光呼吸途径中蛋白质丰度变化的实例。蛋白质丰度显示为经log2转换和归一化的光谱数（y轴）。（A）和（B）中的*表示杂种中的蛋白质丰度水平显著高于双亲中值（Student t检验）（P <0.05），但有一个例外（如箭头所示低于MPV）。GOX：乙醇酸氧化酶（GRMZM2G129246），CAT：过氧化氢酶（GRMZM2G090568），GDC：甘氨酸脱羧酶（GRMZM2G104310），GOA：谷氨酰胺酮戊二酸氨基转移酶（GRMZM2G036609）。（B）卡尔文循环中蛋白质丰度变化的实例。RCA：RuBisCO活化酶（GRMZM2G162200）。TK：转酮醇酶（GRMZM2G033208）。
讨论
在这项研究中，对时间序列数据的综合分析显示，F1杂种与其自交亲本之间具有明显的和非加性模式的玉米代谢组和蛋白质组的昼夜调控。代谢物和蛋白质水平的这些差异可能有助于杂种优势。具体来说，通过昼夜调节参与光合作用和光呼吸途径的关键酶的非加性表达，杂种可以优化相应代谢物的丰度，以改善碳同化作用并排解有毒代谢物，从而最终促进植物生长。
1. 玉米杂种和自交系的代谢和蛋白质组节律性
玉米中基因表达的昼夜调节发生在10％至30％转录本的之间。已有研究显示这种调节影响玉米和其他植物物种的杂种优势。然而，关于代谢物和蛋白质的昼夜调节，基因表达的终产物及其在玉米杂种优势中的作用，人们所知甚少。以前的研究分别在玉米叶和水稻幼苗中鉴定出了632（36％）和354（12％）的节律性蛋白。在本研究中，尽管在一个有限的时间点的一个昼夜周期内可获得的代谢组和蛋白质组数据集可能会阻碍JTK_CYCLE捕获某些微妙的节律性，但本研究的分析已经确定了一些总体趋势，为将来的研究提供了一些方向。
研究发现，82％的代谢物（369/447）和29％的蛋白质（1,392/4,792）具有节律性积累，表明杂种和自交系的代谢组和蛋白质组均具有广泛的昼夜调控。例如，所有糖类都在中午（ZT9）开始并一直持续到深夜（ZT21）都有积累峰，在夜间结束时（ZT24），没有糖类达到峰值（图4B）。该观察结果与净光合作用速率变化相吻合，从清晨开始增加，在中午达到峰值，然后降低直到一天结束。碳水化合物（如蔗糖）的浓度在中午达到峰值，直到深夜一直保持较高水平，在夜间结束时耗尽。
与先前关于杂种中ZmCCA1结合靶点到清晨的时间变化的发现一致，杂种在清晨（ZT3）中显示出比亲本更多的节律性蛋白（补充图6）。该结果表明，杂种在基因和蛋白质表达方面具有先发优势，因此具有光合作用等生理过程的优势。尽管自交系和杂种之间所有节律性蛋白的总体振幅相似，但一些非加性蛋白显示出更高的振幅水平，表明维持昼夜节律稳健性的潜在机制。如在拟南芥中的研究，可通过染色质和对生物钟基因的其他表观遗传修饰来实现生物钟振幅的变化。
2. 杂种中的非加性代谢物和蛋白质
研究中测定的大多数代谢物在不同时间点的杂种中均显示出非加性值。同样，超过一半的代谢物在不同拟南芥杂种中表现出非可加性。在本项研究中，显示出非可加性的蛋白质比例（-21％）高于之前在根中进行的研究（-9％）。这种差异可能是由多种因素引起的，例如蛋白质组分析，植物组织或采样时间点。作者发现，节律性的非加性蛋白中有30％被富集在光合作用GO术语中，可能有助于杂种优势。应当注意，未被鉴定为节律性的其他非加性蛋白质，例如热休克蛋白和核糖体蛋白，也可以在杂种优势中发挥作用。
还值得注意的是，互交杂种之间非加性蛋白（补充图4D）或代谢物（30％，图2B）的重叠相对较低。在互交杂种中的低重叠结果在种根的蛋白质组数据（-9％）和胚乳的基因表达数据（-10％）中也有报道。如在拟南芥杂种或玉米胚乳中观察到的，这可能与亲源效应有关。在本研究中，作者揭示了对蛋白质组数据的时间影响。根据PCA图（补充图2B），尽管彼此聚类在给定的时间点上，但互交杂种之间的变化在很大程度上被不同的时间点分开。尽管造成这种差异的原因有待进一步研究，但作者预测互交杂种之间的差异在生物学上是相关的。
在本研究中观察到的代谢物的温和的MPH与先前的发现相似。据报道，芥菜型油菜和拟南芥也有类似的温和代谢物MPH。尽管本研究的数据是从幼苗中获得的，代谢过程中温和增加的大量和放大可能会导致表型性状的杂种优势更大，例如在玉米杂交物中观察到的生物量，植物高度、根长、叶长、碳固定的增加。此外，光合作用中的正杂种优势和光呼吸中的负杂种优势可能以加速级联的方式相互作用产生更大的表型杂种优势。
3. 杂种优势关键酶和代谢物的时间正负调节
杂种中观察到光合作用，卡尔文循环和糖代谢途径中代谢物的正MPH以及光呼吸途径中的负MPH，与这些途径中涉及的关键酶的含量一致。例如，糖类的正MPH（图3）受到上调的蛋白质的支持，这些蛋白质在光合相关过程（例如丙酮酸代谢过程（GO：0006090，P = 2.00E-06）），糖和淀粉代谢（GO：0019252，P = 6.80E-06），双糖代谢过程（GO：0005984，P = 0.0003）和单糖分解代谢过程（GO：0046365，P = 0.0011）中被富集（补充数据集3）。
光呼吸途径中代谢物的负MPH可能与杂种中GOX蛋白的非加性积累有关（图7A）。由于RuBisCO的加氧酶活性无处不在，因此乙醇酸的合成是不可避免的，可以通过光呼吸过程进行介导，从而避免乙醇酸积累的毒性水平。在C4植物（例如玉米）中，由于碳穿梭增加了维管束鞘叶绿体中的CO2浓度，从而抑制了光呼吸作用，与C3植物相比，光合作用效率更高。然而，光呼吸不仅是C4植物必不可少的，而且在C4光合作用的进化中也起着重要的作用。
在光呼吸中，GOX负责催化高等植物中乙醇酸到乙醛酸的氧化（图7B）。有效清除乙醇酸对于维持光合作用效率至关重要。例如，低的GOX活性可能会通过抑制RuBisCO活性而严重损害水稻，拟南芥和玉米叶片中的CO2同化率。玉米杂种中GOX的较高活性（图7A）可以更快速地除去有毒的乙醇酸。实际上，乙醇酸在ZT9处显示负MPH（F1BM为-7.7％，F1MB为-2.4％），直到夜间早期（ZT15）仍为负值（图5C）。此外，杂种在ZT9处GOX活性的非加性上调与同时刻最大净光合速率一致，这可能表明高GOX活性对于维持高水平的光合作用是必需的，以阻止光抑制。结果就是诸如蔗糖的光合作用物质从ZT9开始达到峰值。
H2O2在光合作用的过程中作为副产物伴随产生，其中GOX将乙醇酸催化生成乙醛酸（图5B）。活性氧（ROS）在植物防御中的作用已得到充分证明。例如，GOX产生的H2O2与植物的基因对基因响应和非寄主抗性响应都相关。越来越多的证据支持以下观点：ROS在调节多种生物过程（例如植物生长和发育）中作为信号分子起着不可或缺的作用。日间作为信号分子的H2O2的非加性积累（补充图7）可能会增强杂种的光合作用效率，而在夜间通过增加CAT活性而被解毒。
4. 光合和光呼吸途径在玉米幼苗杂种优势中的作用
根据观察和数据，作者提出在黎明或清晨，杂种通过昼夜节律蛋白结合活性和/或其他信号分子，例如H2O2，可以比自交亲本更有效地感知光线，这可以增强对不断增加的光照条件的适应能力。在正午，当光强度达到最高水平时，杂种可以比自交种更有效地忍受光抑制胁迫并保持较高的光合作用水平，而又不会过度提高其光呼吸机制，这可能是通过上调GOX活性对乙醇酸快速解毒而实现的。
这与以下发现一致：杂种中非加性上调的蛋白质仅在光合作用相关的GO术语中的富集，以及光合作用（PEPC，ME和PPDK）和卡尔文循环途径（RCA和TK）中关键酶的丰度和关键酶活性的上调。结果表明，参与光合作用的代谢物，例如苹果酸，丙酮酸和RuBP，显示正MPH，而参与光呼吸途径的代谢物，例如甘氨酸，谷氨酰胺和丝氨酸，显示负MPH。因此，杂种可以积累更多的光合同化物，例如蔗糖和麦芽糖。到了夜间，当昼夜节律钟和/或信号分子的水平发生变化时，CAT活性的增加可将H2O2的丰度降低至MPV水平，以保护植物免受过度的氧化胁迫。总体而言，这些有关光合作用和光呼吸的代谢和蛋白质组学过程的新见解将为杂交作物的育种和生物技术改良提供概念性进展。
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