编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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平衡和定时的新陈代谢是制作高质量卵子的必要条件，然而，支持卵母细胞发育的代谢框架仍然知之甚少。在本篇文章中，我们通过分离大量处于关键阶段的细胞，获得了小鼠卵母细胞在体内成熟的时间代谢组谱。与此同时，定量蛋白质组分析被我们用于支持代谢组数据，协同描绘卵母细胞的整体代谢模式，我们还发现了减数分裂成熟过程中的代谢特征，如多不饱和脂肪酸(PUFAs)水平的下降和活跃的丝氨酸-甘氨酸-一碳(SGOC)途径。利用功能学方法，我们进一步确定了PUFA-花生四烯酸(ARA)是调控减数分裂成熟的关键靶点，并证明了SGOC网络对成熟卵母细胞表观遗传标记的调控作用。我们的数据为卵母细胞成熟过程中代谢组和蛋白质组动态变化提供了广泛的资源。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 小鼠卵母细胞成熟的代谢组学和蛋白质组学分析
虽然体外卵母细胞代谢变化已经有相关报道，但人们对体内卵母细胞成熟过程的代谢动力学研究是相对缺乏的，这主要是由于实验材料的数量有限。卵母细胞是哺乳动物雌性中最大的细胞，但与体细胞相比数量非常少。在这里，我们在减数分裂成熟的三个关键时间点(胚泡阶段(GV)，胚泡断裂阶段(GVBD)和MII期卵母细胞)，在三个关键时间点分离了大量的小鼠卵母细胞（总共54000个卵母细胞），并使用超高效液相色谱-串联高分辨率质谱(UHPLC-HRMS)分析了细胞内代谢组(图1 A和1 B)，根据t检验(p<0.05)结合可变重要性(VIP)(VIP >1.00)共鉴定出57种差异代谢物(表S1)。稳定的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)显示出三组卵母细胞的分离与阶段相关，而交叉验证预测能力为Q2 (cum) R≥0.832(图1C-1E)，减数分裂成熟过程中代谢物水平的变化以热图表示(图1F)。Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes (KEGG)中描绘了它们各自生化途径的差异代谢组学概况，揭示了不同的代谢产物模式(图1F)。一般来说，氨基酸/碳水化合物/核苷酸在减数分裂恢复期间(GV到GVBD)或者减数分裂成熟(GV到MII)增加，而脂质代谢物在减数分裂恢复期间(GV到GVBD)显著减少(图1F-1H)。
代谢酶是细胞代谢的介质。为了确定底物/产物的变化是否与相应的酶蛋白积累变化相关，我们同时对GV、GVBD和MII卵母细胞进行了定量的蛋白组学分析(图S1A)。我们检测到46,016个肽段，定量分析了4,694个蛋白，共鉴定出2,081个差异水平蛋白(错误发现率[FDR] = 0.05)(图S1B;表S2)。基因本体论(GO)分析显示与代谢途径相关的类别显著富集，如谷胱甘肽/碳/丙酮酸代谢和三羧酸循环(TCA循环)(图S1C和S1D)。为了更好地理解卵母细胞发育的代谢过程，我们还将所有积累差异的酶绘制到主要KEGG代谢途径上，揭示了在减数分裂成熟过程中大量显著改变的事件/过程(即氧化磷酸化和辅因子/维生素代谢)(图S2)。总之，这些数据提供了体内小鼠卵母细胞成熟过程中代谢组和蛋白质组动力学的广泛资源。下面我们以代谢组学和蛋白质组学数据为基础，详细阐述代谢物变化对卵母细胞成熟和向合子发育过渡的可能后果，并揭示哺乳动物减数分裂成熟所必需的机制。
2. 卵母细胞成熟过程中的脂质代谢
从卵母细胞代谢产物图(图1F)中，我们观察到卵母细胞成熟过程中两种不同的脂质代谢模式。与未成熟的GV卵母细胞相比，减数分裂恢复时肉碱和棕榈肉碱的水平显著升高(图2A和2B)，而大多数脂质代谢相关产物(即花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、胆固醇、胆酸、糖胆酸、牛磺胆酸、十八酰胺和十二烷酸)随着卵母细胞减数分裂进程而下降(图2C 2H;图S3)，这些观察结果表明了脂质代谢在减数分裂卵母细胞中的不同作用，如下所述。
图1 小鼠卵母细胞成熟的代谢组学分析
(A)小鼠GV期、GVBD期和MII期卵母细胞的体内分离说明。(B)卵母细胞代谢组分析工作流程概要。(C E)分离GV、GVBD和MII卵母细胞样本的OPLS-DA评分图(椭圆:Hotelling’s T2 99%;C: R2X(cum) = 0.607,Q2X(cum) = 0.832;D: R2X(cum) = 0.52, Q2X(cum) = 0.848;E: R2X(cum) = 0.584,Q2X(cum) = 0.943)。(F)热图显示卵母细胞成熟过程中57种不同代谢物的动态变化，按代谢途径分类。(G) GV和GVBD卵母细胞(减数分裂恢复)20个代表性代谢物的Z-score图。(H) GV卵母细胞(减数分裂成熟)与MII卵母细胞(减数分裂成熟)比较的20个代表性代谢物的Z-score图。每个点代表一个样本中的一个代谢物，按阶段类型着色。
3. 脂肪酸利用在卵母细胞的成熟阶段依赖性增加
长链脂肪酸降解的主要途径是线粒体脂肪酸-氧化(FAO)。脂肪酰辅酶A在线粒体外膜上生成，并通过肉碱棕榈酰转移酶I (CPTI)转化为脂肪酰肉碱(即棕榈酰肉碱)。肉碱通过肉碱-肉碱转位酶进入线粒体内膜的内部部分，肉碱棕榈基转移酶II (CPTII)将脂肪性的肉碱转化为脂肪性的酰基辅酶A，在线粒体基质中进行-氧化(图2I)。尽管FAO被认为对小鼠卵母细胞的成熟很重要，但这一过程的代谢基础仍不清楚，而我们的代谢组学分析发现，在减数分裂恢复期间，卵母细胞的肉碱和棕榈肉碱含量增加了3-4倍(图2A和2B)。与此同时，蛋白质组数据显示CPTII水平可重复上调，且具有统计学意义(图2I)，表明FAO活性增强。此外，蛋白质组时间谱和代谢途径的综合分析显示，与GV卵母细胞相比，被检测的8种酶中有7种(ACOX3、ACAT1、ECHS1、HADHA、ALDH2、ALDH3A2和ALDH7A1)在MII卵母细胞中升高(图S4)。这些数据表明脂肪酸在小鼠卵母细胞成熟过程中的利用增强。
4. 在卵母细胞成熟过程中胆汁酸及其衍生物的减少
胆汁酸是由胆固醇合成的两亲性分子。尽管最近的文献将胆汁酸描述为多功能信号分子，但它们大多被认为是溶解脂质和脂溶性维生素的生物洗涤剂。然而，到目前为止，在卵母细胞成熟过程中胆固醇和胆汁酸的水平尚不清楚。我们发现，从GV到MII阻滞的卵母细胞转变过程中胆固醇水平下降(图S3A)。同样，在减数分裂恢复后，胆酸及其衍生物(糖胆酸和磺酚胆酸)的水平显著下降(图2C-2E)。先前的研究表明，在没有受精的情况下，体内和体外过量的胆固醇会导致MII的自发激活和逃逸。因此，我们观察到胆固醇(可能还有胆汁酸)的下降，很可能反映了需要降低胆固醇水平来促进MII的阻滞。
5. PUFA代谢参与卵母细胞成熟
哺乳动物可以拉长亚油酸并降低其饱和度，从而产生一系列长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)。我们发现，在减数分裂恢复期间，PUFAs花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的水平下降(图2F-2H;表S1)。二十烷类化合物是由ARA在响应刺激下合成的，诱导细胞质磷脂酶A2 (PLA2)转位到内质网、高尔基体或核膜，在那里催化磷脂膜释放PUFA；游离的PUFAs可以被环氧合酶(COX1/2)处理形成前列腺素/血栓烷，也可以被脂合酶(LOX)处理形成白三烯家族的二十烷类(图S5A)。虽然PUFAs及其信号传导衍生物(二十烷类)参与多种生物过程，但这些代谢物如何发挥其对哺乳动物卵母细胞的影响，目前尚不清楚。于是，我们使用小分子抑制剂研究了不同PUFA代谢途径在卵母细胞成熟过程中的潜在作用，如图S5B和S5C所示，我们用芝麻素或姜黄素抑制D6/ d5去饱和酶似乎既不影响GVBD，也不影响极性体(Pb1)的释放，表明亚油酸合成PUFAs对卵母细胞成熟可能是不必要的，或者在GV阶段可能有足够的ARA/DHA/EPA来进行正常的减数分裂成熟，而蛋白质组数据显示在成熟过程中PLA2水平逐渐降低(图S5A)，考虑到卵细胞中PUFAs水平降低，我们认为PLA2控制的磷脂分子释放是小鼠卵母细胞中ARA/DHA/EPA的主要来源。我们用BWA4C对LOX进行较小程度的抑制，会导致减数分裂成熟率的剂量依赖性下降(图S5B和S5C)，表明卵母细胞通过PUFAs分解代谢合成前列腺素/白三烯，可能具有促进减数分裂成熟的自分泌功能。
为了测试细胞内PUFAs的减少是否对减数分裂成熟很重要，我们考虑了PUFA可用性的提高是否会破坏卵母细胞成熟。总之，我们将成熟的GV卵母细胞在添加不同浓度ARA的培养基中培养，在指定的时间点检测成熟表型(图2J)，发现ARA治疗对GVBD卵母细胞影响不大(数据未显示);然而，Pb1挤压以剂量依赖的方式减少(图2K和2L)，表明减数分裂I分裂中断；冲洗实验表明ARA抑制作用几乎完全可逆(图2M)，此外，我们发现ARA的补充导致了中期I卵母细胞的减数分裂缺陷，包括纺锤体紊乱和染色体错位(图2N和2O)。在一些细胞中，纺锤体甚至没有形成，存在不规则的染色质肿块(图2N，箭头)，反映了减数分裂结构的改变。我们还发现，在添加了ARA的培养基中培养的卵母细胞中，与对照组相比，在7h时细胞内ARA水平增加了1.5-2.0倍(图2P)，这一变化与体内检测到的减数分裂恢复期间ARA水平的下降一致；DHA/EPA对卵母细胞成熟也有类似的影响(图S6;图S7)。我们观察到ARA/PUFAs水平在减数分裂恢复期间下降，以及过量的ARA/PUFAs干扰减数分裂成熟，从而得出以下假设：ARA / PUFA信号传导抑制卵母细胞成熟，必须下调ARA/PUFA信号以减轻这种抑制机制。
图2 卵母细胞成熟过程中脂质代谢特征
(A-H)不同时期卵母细胞脂质代谢相关代谢物的相对水平。(I)线粒体内肉碱转运系统和脂肪酸氧化原理图。红色填充的三角形表示成熟卵母细胞代谢产物增加，蓝色填充的三角形表示成熟过程中代谢酶上调。CPTII蛋白在不同发育阶段卵母细胞中相对丰富。(J)图示:研究补充ARA对卵母细胞成熟的影响的实验方案。(K)对照卵母细胞和ARA处理卵母细胞亮场图像。箭头指向无法挤压极体的卵母细胞。标尺，50 μm。(L)对照卵母细胞和ARA处理卵母细胞Pb1挤压的定量分析。(M)ARA冲洗后卵母细胞Pb1挤压的定量分析。(N)对照卵母细胞和ARA处理卵母细胞的典型共聚焦图像，用α-tubulin抗体染色可见纺锤体(绿色)，用碘化丙啶染色可见染色体(红色)。纺锤体紊乱和染色体错位分别用箭头和箭头表示。标尺，25 μm。(O)对照组和ARA处理的纺锤体/染色体异常卵母细胞的定量分析。(P)对照卵母细胞和ARA处理卵母细胞的相对ARA水平。
6. ARA抑制促进减数分裂成熟靶点的鉴定
为了阐明ARA水平降低促进卵母细胞成熟的潜在机制，我们对在有ARA和没有ARA的培养基中培养7 h的卵母细胞进行了蛋白质组学比较分析(图3A)，共检测到35344个多肽，3787个蛋白中有87个蛋白的积累显著改变(FDR = 0.05, Log2 FC>1.5;图3B和3C;表S3)。GO分析表明，许多差异积累的蛋白质在减数分裂、细胞周期和RNA加工中富集(图3D)。其中，NFKB激活蛋白(NKAP)和B细胞易位基因4 (BTG4)是非常值得关注的，因为(1) NKAP是一种高度保守的蛋白，在有丝分裂和转录调节中发挥作用，而且与我们在无核卵母细胞中观察到的情况相似，NKAP的缺失会导致人类细胞中染色体错位、中期前阻滞和非整倍体。(2) BTG4作为调节母体mRNA稳定性的重要因子，其表达在正常卵母细胞成熟过程中急剧增加(表S2;GVBD/GV ~3倍，MII/GV ~99倍)。
7. ARA通过控制NKAP的积累来调节卵母细胞的减数分裂
我们首先对蛋白质组数据进行了验证，western blot分析显示，在ARA处理的卵母细胞中NKAP水平降低了约70%(图3E)。免疫染色显示NKAP存在于GV卵母细胞的细胞质和细胞核中，一旦卵母细胞恢复减数分裂，NKAP就集中在纺锤体区域(图3F)，表明它可能在减数分裂器的形成或稳定中发挥作用。为了验证这一可能性，我们将NKAP靶向小干扰RNA (siNKAP)微注射到成熟的卵母细胞(图S8A)，导致NKAP蛋白显著降低(图S8B)。虽然siNKAP卵母细胞在GVBD阶段正常，但与对照组相比，Pb1挤压明显减少(图S8B S8E)，表明成熟缺陷；而且，NKAP缺失的卵母细胞很容易检测到纺锤体紊乱和染色体聚集失败(图S8F和S8G)，与ARA处理的卵母细胞的表型相似。纺锤体维持和染色体运动之间的协调依赖于着丝点微管动力学。根据这一观点，在MI期卵母细胞中，NKAP的敲除导致了丝粒-微管(K-MT)的高频率附着错误(图S8H和S8I)，从而促使染色体双定向不稳定。监测和响应着丝点-微管(K-MT)附着的机制是主轴装配检查点，其中BubR1是SAC复合体不可分割的一部分。在正常的中期卵母细胞中，当BubR1适当地附着在染色体上时，它会从着丝点中丢失。然而，在siNKAP卵母细胞中着丝点上的BubR1信号显著增加(图S8J和S8K)，表明SAC的激活导致了成熟缺陷，siNKAP敲低的特异性通过mRNA救援实验得到证实(图S13A S13D)，这些数据表明NKAP在调节卵母细胞减数分裂结构和成熟进程中起着重要的作用。考虑到ARA处理的卵母细胞中NKAP积累的减少，我们测试了提高NKAP水平是否可以抑制一个或多个卵母细胞成熟缺陷。为了达到这一目的，我们通过向ARA处理的GV卵母细胞中注入Nkap-cRNA进行过表达实验(图3G)，Western blotting证实外源性NKAP蛋白在卵母细胞中有效表达(图3H)，而NKAP的过表达部分抑制了ARA的纺锤形和成熟缺陷(图3I-3K)。总的来说，这些结果表明NKAP在减数分裂装置的装配中起着重要的作用，在GV期，高水平的ARA抑制了这一活性，但在减数分裂恢复期间ARA水平下降，这一活性有所缓解。
8. ARA影响BTG4控制的mRNA在减数分裂成熟过程中的降解
在没有mRNA转录的情况下，卵母细胞的减数分裂恢复耦合降解发生。在减数分裂成熟期间，BTG4通过刺激卵母细胞的poly(A)尾脱腺苷化来触发卵母细胞mRNA的衰变。与蛋白质组数据相似，Western blotting显示，ARA处理的卵母细胞中BTG4水平较对照组降低了约80%(图3L)，然后我们想知道在成熟过程中ARA的补充是否影响了卵母细胞mRNA的稳定性，为了解决这个问题，我们使用poly(A)tail (PAT)实验评估了卵母细胞中几种代表性的母细胞转录本(Padi6、Nobox、ZP2和Fgf8)的聚腺苷化水平(图3M)。与之前的报道一致，对照组成熟卵母细胞的poly(A)尾缩短，但在ARA处理的卵母细胞中，这一过程被阻断(图3N 3R)，相应的转录本具有抗降解性(图3S)，这些数据表明，减数分裂恢复期间ARA的减少使BTG4积累，触发母系RNAs的降解。
图3 ARA对卵母细胞成熟影响因素的鉴定
(A)鉴定蛋白质差异积累的蛋白质组学工作流程概述。(B)显示蛋白质相对丰度的火山图。(C)对照卵母细胞和ara处理卵母细胞差异累积蛋白的热图。(D)差异积累蛋白的基因本体网络富集分析。(E)对NKAP表达的Western blot分析验证了蛋白组学的结果(每条带200卵母细胞)。(F) NKAP在GV、GVBD、MI期卵母细胞中的分布。箭头指向NKAP信号。标尺，25 μm。(G)给出实验方案，检验过表达NKAP是否能抑制无核卵母细胞的缺陷表型。(H)免疫印迹显示外源性NKAP蛋白在卵母细胞中过表达(OE)。(I)提示卵母细胞Pb1挤压的发生率。(J)所示卵母细胞中减数分裂纺锤体和染色体的代表性例子。纺锤体紊乱和染色体错位分别用箭头和箭头表示。标尺，25 μm。(K)指示卵母细胞减数分裂缺陷的定量分析。每组分析至少100枚卵母细胞，实验进行3次。(L) BTG4表达的Western blot分析验证了蛋白组学的结果(每条带 200个卵母细胞)。(M) mRNA poly(A) tail(PAT)实验策略图。P1,锚定引物;P2, P1-反义引物;Pn, 基因特异性引物。(N-R) PAT分析显示对照卵母细胞和ARA处理卵母细胞中所显示的转录本的poly(A)-尾长度的变化。(S) 实时定量PCR测定对照卵母细胞和ARA处理卵母细胞中所示转录本的相对丰度。
9. 卵母细胞成熟过程中氨基酸代谢的不同模式
除了脂肪酸代谢的变化，我们的代谢物图谱显示了卵母细胞成熟过程中某些氨基酸水平的变化(图4;图S9)。我们检测到的大多数氨基酸(即丝氨酸、谷氨酸和组氨酸)的丰度在减数分裂恢复期间显著增加，然后在成熟卵母细胞中减少(图4A–4H;表S1 GVBD >MII)，而一些氨基酸(如甘氨酸和缬氨酸)从GV期到MII期不断增加(图4I和4J)。在减数分裂恢复期间，其他氨基酸(如乙酰丙酸、胱氨酸和次氨基磺酸)水平下降(图S9E-S9H)。标准氨基酸水平的降低，至少在一定程度上，可以归因于对组成型翻译mRNA的持续翻译利用和在卵母细胞成熟过程中新mRNA种类向多核糖体募集。氨基酸也是核苷酸和脂类合成、碳氮稳态和氧化还原缓冲的中间体。因此，卵母细胞代谢的这种多样性反映了氨基酸代谢的复杂精细调控。
10. 减数分裂恢复过程中上调丝氨酸-甘氨酸-一碳途径
我们发现，在减数分裂恢复期间，蛋氨酸循环中的许多代谢物(即s -腺苷蛋氨酸[SAM]和50-甲基硫代腺苷[MTA])和转硫途径(即谷氨酸和焦谷氨酸)均升高(图4K)。蛋白质组学特征显示，成熟卵母细胞中叶酸循环、蛋氨酸循环和经硫酸化途径相关的酶水平升高(图4L-4N;图S9I-S9M)；经硫化途径是将蛋氨酸的硫原子转移到丝氨酸生成半胱氨酸，半胱氨酸可用于谷胱甘肽(GSH)的合成，抵御氧化应激。丝氨酸-甘氨酸-一碳(SGOC)途径是一个代谢网络，由两个核心相互连接的循环组成:叶酸循环和蛋氨酸循环。SGOC途径的输出包括维持核苷酸、蛋白质和脂类生物合成的关键代谢物;它还促进甲基转移酶反应，从而形成表观遗传景观，考虑到丝氨酸/甘氨酸水平的明显增长(高达10-12倍)，上述研究结果强烈表明，SGOC通路在减数分裂恢复期间上调。
图4 在卵母细胞成熟过程中氨基酸的代谢变化
(A-J)不同时期卵母细胞氨基酸代谢相关代谢物的相对水平。(K)由代谢组学和蛋白质组学得到的卵母细胞成熟过程中SGOC网络示意图。成熟卵母细胞代谢物的增加和减少分别以红色填充和空三角形表示。蓝色的填充三角形和空三角形分别表示代谢酶被上调和下调。(L-N)参与叶酸/蛋氨酸循环和硫酸化途径的代表性酶(MTHFD2L、GGCT和MAT2B)的相对丰度。
11. SHMT2缺失会损害成熟卵母细胞的表观遗传景观
丝氨酸通过丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT1/2)进入SGOC通路的核心，该酶将丝氨酸(3个碳)转化为甘氨酸(2个碳)，并将1个碳转移至四氢叶酸盐(THF)(图4K)。缺乏SHMT1的小鼠没有明显的表型，而缺失SHMT2则是胚胎致死的，这表明线粒体SHMT2可能更为重要，因此可以弥补细胞质SHMT1的缺失。为了研究SGOC代谢在卵母细胞发育中的功能参与，我们进行了SHMT2敲除实验(图5A)：转染小干扰RNA (siRNA)后，内源性SHMT2蛋白被有效地耗尽(图5B)。我们发现，相对于对照，在基因敲低过程中丝氨酸/甘氨酸的比例增加了，这与甘氨酸是SHMT2反应的产物一致(图5C)，而SAM水平显著降低(图5D)，这与siShmt2卵母细胞的SGOC通路活性降低一致。如图5E所示，虽然Pb1挤压略有下降，但SHMT2的损失似乎对减数分裂成熟的执行没有显著影响，且受精后，只有30%的胚胎来源于Shmt2基因敲除的卵母细胞在第1.5天发育到2细胞期，明显低于对照组（图5F和5G），反映出卵母细胞的发育潜能受损。我们通过进行mRNA拯救实验证实了siShmt2的特异性（图S13E–S13G）。
哺乳动物细胞中所有的甲基转移酶反应都依赖于甲基供体SAM，这是一种重要的SGOC输出。考虑到正常卵母细胞成熟过程中SAM水平的变化，在GVBD卵母细胞中升高，然后在MII时降低，我们接下来试图评估SHMT2敲低对卵母细胞表观基因组的影响。我们收集了对照和siShmt2 MII卵母细胞，使用亚硫酸氢盐测序(BS-seq)方法对小样本进行全基因组DNA甲基化分析(图5H)，如我们之前所述，数据显示平均基因组甲基化减少(图5I和5J)。对不同基因组特征的对比分析进一步揭示了重复元件中显著的低甲基化(图5K-5M;图S10A-S10K)，特殊低拷贝重复(LCRs)，转座子和短点缀核元件(SINEs)，此外，我们发现差异甲基化的LCRs在基因间区域显著减少，但在50个未翻译区域(UTR)、外显子和启动子中富集(图S10L)。接下来，我们开始探究卵母细胞中SAM水平的降低是否会因此影响最终胚胎的表观遗传修饰，我们对对照和siShmt2卵母细胞进行体外受精(IVF)，然后收集受精卵，检测组蛋白甲基化状态(H3K4me3/H3K9me2/H3K27me3)，其中，SHMT2缺失时，母体前核(PN)中的H3K4me3水平显著降低(图5N和5O)；在减数分裂成熟过程中，CpG和非CpG从头DNA甲基化均增加，我们假设SHMT2活性是减数分裂恢复过程中SAM生成所必需的，因为MII降低了SAM的水平，至少部分是由于它在DNA甲基化中的利用，这些结果表明，在减数分裂成熟过程中SGOC介导的SAM产生对于建立合适的卵母细胞向胚胎过渡的表观遗传标记具有重要意义。
图5 SHMT2缺失会损害卵母细胞的表观遗传景观
(A)Shmt2敲低实验的示意图介绍。(B)通过Western blot分析证实内源性SHMT2蛋白缺失(每条带 200个卵母细胞)。(C)对照卵母细胞(n = 300)和siShmt2卵母细胞(n = 300)的丝氨酸-甘氨酸比率。(D)对照卵母细胞(n = 300)和siShmt2卵母细胞(n = 300)的相对水平。(E)对照卵母细胞(n = 102)和siShmt2卵母细胞(n = 105) Pb1挤压定量分析。(F) 对照组(n=85)和siShmt2(n=92)卵母细胞衍生胚胎在体外培养期间发育到2-细胞期的百分比。(G)对照卵母细胞和siShmt2卵母细胞E1.5胚胎亮场图像。标尺，100 μm。(H)用于全基因组甲基化分析的BS-seq程序流程图。收集MII卵母细胞，将DNA进行亚硫酸氢盐转化，然后文库制备和高通量测序。(I)对照组和siShmt2卵母细胞Slc16a8的甲基化模式图示。选择紫色框高亮的区域显示Shmt2消融后该位点显著的低甲基化。(J-M)小提琴图显示了对照卵母细胞和siShmt2卵母细胞不同基因组特征的甲基化水平。平均甲基化水平用数值和绿叉表示。(N)对照与siShmt2合子共染anti-H3K4me3抗体(红色)和Hoechst 33342 抗体(蓝色)图像。雄性和雌性分别表示父原核和母原核。PB：极体。(O) H3K4me3荧光定量如(N)所示，每个数据点代表一个合子(每组N = 15)。
12. 卵母细胞成熟过程中的碳水化合物代谢
碳水化合物的代谢是卵子形成的必要条件，这已被科学人员广泛接受，然而，数据显示碳水化合物动态在卵母细胞成熟是缺乏的。时间代谢物图谱清楚地显示，在卵母细胞成熟过程中，许多碳水化合物代谢物增加(图6A-6H)，主要富集于TCA循环和磷酸戊糖途径(PPP)。
13. 在成熟过程中增强TCA循环活性和丙酮酸氧化
在成熟卵母细胞中，TCA循环的三个关键组成部分的丰度显著增加(柠檬酸: 5倍;顺乌头酸: 6倍;延胡索酸酯: 2倍) (图6A-6C, 6J)，此外，在我们检测到的10种TCA循环酶中，有8种在减数分裂成熟期间经历了一致且具有统计学意义的上调(图6K 6O;图S11)，表明TCA循环激活。另外，丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物中PDHA1、二氢脂转乙酰化酶(DLAT)、二氢脂脱氢酶(DLD)三种酶的积累量在成熟过程中均有所增加(图6J;图S11)，PDH复合物负责丙酮酸的氧化脱羧作用，最终产物为乙酰辅酶A，并由此调节葡萄糖衍生碳进入TCA循环，代谢组和蛋白质组数据的综合分析(图S11)突出了代谢产物水平和酶积累的协调上调。总之，结果表明，产生一个有能力的卵子需要丙酮酸代谢和TCA循环活性增强。
14. 在减数分裂卵母细胞中激活PPP功能
大量证据表明卵母细胞的糖酵解活性较低。与此观点一致，根据我们的代谢组学和蛋白质组学分析，我们发现糖酵解过程中很少有代谢产物和酶发生变化，而PPP的几个关键中间产物表现出了巨大的变化，例如，在卵母细胞成熟过程中我们发现葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖酸内酯增加了30倍，葡萄糖醛酸增加了10倍(图6E-6G；图S12A)，这表明PPP是活跃的；此外，我们检测到的5/6 ppp相关酶在减数分裂成熟期间水平也有统计学意义上的显著提高(图S12B S12G)，在PPP的两种主要起始代谢物中，甘油醛在减数分裂成熟期间下降了3倍，山梨醇在减数分裂恢复期间增加了5倍，然后在MII停止时下降了2倍；这些变化的机制和发育意义值得进一步研究。
Downs等人已经证明，通过PPP而不是通过糖酵解的葡萄糖流量影响小鼠卵丘-卵母细胞复合体中减数分裂的恢复。为了剖析PPP在卵母细胞中的作用，我们利用G6pdx靶向siRNA(siG6pdx)特异性地去除了PPP的限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)(图S12H和S12I)，与对照组相比，siG6pdx卵母细胞成熟率略有下降，但显著降低(图S12J)。siG6pdx卵母细胞的一个主要表型是产生过多的活性氧(ROS)(图S12K和S12L)，这意味着氧化还原平衡失衡，而且当成熟的siG6pdx卵母细胞在体外受精时，发育停滞是明显的，与对照相比，显示了准时的2细胞胚胎形成比例减少(图S12M和S12N)，这表明卵母细胞向胚胎转化受损。通过mRNA拯救实验恢复敲低表型，我们证实了siG6pdx的靶点特异性(图S12H S12K)，这些发现清楚地表明，PPP在卵母细胞成熟过程中是活跃的，并且需要母体为早期胚胎的发育。
图6 卵母细胞成熟过程中的碳水化合物代谢
(A-I)不同阶段卵母细胞碳水化合物代谢相关代谢物的相对水平。(J)由代谢组学和蛋白质组学得到的卵母细胞成熟过程中TCA循环和丙酮酸氧化的示意图。红色填充三角形表示成熟卵母细胞代谢物增多。蓝色填充三角形和空三角形分别表示代谢酶被上调和下调。(K-O)参与TCA循环和丙酮酸氧化的代表性酶(IDH3A、OGDH、SDHB、MDH2和PDHA1)的相对丰度。
15. 在卵母细胞成熟过程中核苷酸代谢的逐渐增加
嘌呤和嘧啶核苷酸是核酸的主要能量载体、亚单位和合成核苷酸辅因子的前体，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和SAM，5-磷酸核酮糖(R5P)是PPP氧化反应的最终产物，嘌呤的从头合成开始于R5P活化成磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，结束于肌苷一磷酸(IMP)的生产。与成熟过程中活跃的PPP一致，10个核苷酸代谢物中有7个的丰度在减数分裂成熟过程中增加(图7A-7K)，两种嘌呤的含量都增加了，特别是在IMP增加了14倍，嘧啶核苷酸增加了5倍，尤其是胞苷增加了5倍，而蛋白质组学和代谢途径的综合分析显示，23种核苷酸代谢酶中有17种水平升高(图7L-7P);图S14-S16)，例如，在成熟的卵母细胞中，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，嘌呤挽救途径中的一种酶，表现出3到6倍的增加(图7L)，二氢月桂酸脱氢酶(DHODH)，一种嘧啶从头生物合成的限速酶，表现出2倍的增加(图7O)，嘌呤和嘧啶水平的增加可能为胚胎早期发育期间将发生的大量DNA和RNA合成提供母体支持。我们还观察到，肌苷和黄嘌呤水平在卵母细胞成熟过程中显著下降(图7I和7J)。先前的研究表明，肌苷和次黄嘌呤参与了小鼠GV期二倍体阻滞的维持，我们观察到的下降可能反映了降低肌苷和黄嘌呤的水平以恢复减数分裂的必要性。总的来说，这些数据表明核苷酸代谢途径是调节减数分裂成熟机制的重要参与者。
图7 卵母细胞成熟过程中的核苷代谢
(A-J)不同时期卵母细胞中与核苷酸代谢相关的代谢物相对水平。(K)从代谢组学和蛋白质组学得到的卵母细胞成熟过程中嘌呤和嘧啶代谢示意图。成熟卵母细胞代谢物的增加和减少分别以红色填充和空三角形表示。蓝色填充三角形和空三角形分别表示代谢酶被上调和下调。(L-P)参与嘌呤和嘧啶代谢的代表性酶(PNP、PRM2、DUT、DHODH和CMPK2)的相对丰度
结论
本研究通过代谢组学和蛋白质组学的综合分析，揭示了卵母细胞在体内成熟过程的整体代谢模式。利用功能方法，我们进一步确定了介导PUFAs对卵母细胞减数分裂影响的关键因素，并发现了通过SGOC途径控制卵母细胞表观遗传景观的方法。
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