编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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本文研究了我国广泛使用的天然豆腐凝固剂发酵黄乳清（FYW）对豆浆的凝固性。我们分别用蛋白质组学技术和高效液相色谱分析了FYW引起的蛋白质和异黄酮颗粒的聚集。结果表明，FYW对大豆蛋白的促凝作用主要发生在pH 5.80～5.90之间；当豆乳pH值降低时，7S β、11S A3和部分11S A1a亚基及SBP、Bd、lectin和TA最早聚集，11S A4、其他11S A1a、11S A2和11S A1b亚基最晚聚集，7Sα和α′亚基与TB的聚集有明显的延迟；此外，与糖苷类相比，以苷元形式存在的异黄酮更有可能与蛋白质共沉淀。这些研究结果可为今后传统FYW-tofu的开发研究提供重要的参考和帮助。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 发酵黄乳清中凝血因子的测定
根据植物乳杆菌D1031发酵50h后pH值和总酸度的变化（如附图1所示），我们发现pH值下降，TA增加（均p<0.05）。实验室发酵乳清是一种非常复杂的溶液，含有阳离子、细菌细胞、酶和有机酸。为了测定豆浆凝固过程中FYW中的凝固因子，我们采用不同处理方法的FYW和FYW与两种常见的传统化学凝聚剂一起对加热后的豆浆进行凝固。结果表明，FYW、离心FYW的上清液、酶失活的FYW、CaSO4和MgCl2成功地凝固了豆浆（见补充表1，附图1）。
然而，FYW及其上清液和pH值很低（3.72–3.83）的非酶溶液大大降低了豆浆的pH值，产生的值远远低于CaSO4和MgCl2分别诱导的值，这一观察证实了FYW诱导和盐诱导的凝血是通过不同的内在机制发生的，FYW中的有机酸是FYW的主要混凝因子。此外，我们还检测了发酵过程中大豆乳清中不同有机酸的含量（见补充表2），根据R2分析（FYW pH值与总有机酸含量之比=−0.949），FYW的pH值下降率与植物乳杆菌D1031产生的有机酸积累密切相关。我们有效地分离和检测了丙酮酸、乳酸、乙酸等10种有机酸，其中乳酸是FYW中最丰富的酸，对pH值的降低有很大的贡献（FYW pH值与乳酸含量的R2=-0.947），并对豆乳蛋白的凝固起到一定的作用（附图2）。
2. 不同pH值FYW对豆浆蛋白凝固的影响
2.1 蛋白质凝固
鲜豆乳是一个相对稳定的体系，在1.00×104g离心条件下几乎不发生蛋白质沉淀，但添加发酵黄乳清时，凝固剂会诱导较大的豆乳蛋白颗粒形成团聚体。此外，离心后的豆浆上清液和沉淀物可以分离出来供我们将来分析。
图1显示了pH值在3.67和5.77之间的发酵黄乳清对豆乳蛋白质凝固的影响。当添加量为20%（v/v）时，pH值较低的FYW使豆乳中蛋白质颗粒聚集较多，离心后蛋白质沉淀增加（p<0.05）。当FYW的pH值从4.14变为4.02时，豆浆上清液组分和颗粒组分中的蛋白质总含量突然从8.46 mg/mL下降到1.41 mg/mL，并分别从2.55 mg/mL大幅增加到8.79 mg/mL。此外，在上述条件下，FYW诱导豆浆的pH值从6.02降至5.86，这表明了与FYW的pH值变化类似的下降趋势（豆浆pH值与FYW pH值的R2=0.869），因此，在添加20%（v/v）FYW以凝固豆浆蛋白质时，pH值4.02是迅速累积蛋白质颗粒以达到pH值5.86的关键点（图1A）。
豆浆首先被加热引起蛋白质的离解和变性，如7S和11S类。加热豆浆的表面疏水性大于非加热豆浆，由于二硫键的形成和疏水相互作用，蛋白质被展开并形成细丝。在FYW的诱导下，蛋白质颗粒被酸化中和并相继到达等电点。具有负电荷表面性质的蛋白质细丝之间的静电排斥作用减弱，随后，中和蛋白质分子的疏水相互作用占主导地位，并导致变性蛋白质聚集。
2.2 SDS-PAGE分析
在豆奶中，β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）是两种主要的蛋白质。我们测定了大豆上清和颗粒组分中7S和11S含量的变化以及大豆蛋白质的组成，采用不同pH值（5.77、5.61、5.33、4.58、4.11、4.02、3.95和3.67）的FYW，添加量为20%（v/v）用于大豆蛋白的凝固。图1（B-C）显示了SDS-PAGE结果，表明SPF中的亚基（7Sα'、7Sα、7Sβ、11S A3、11S酸性和11S碱性）浓度随着发酵黄乳清pH值的降低而增加，而上述蛋白质亚基在SSF中的数量随着pH值的降低而减少，因此，豆乳蛋白凝固过程中各亚基含量的变化趋势与SSF和SPF中总蛋白含量的变化趋势相似（不同亚基含量与总蛋白含量的R2为0.991～0.999）。
根据图1（D-E），我们观察到7Sβ和11S A3蛋白质首先在SPF中沉淀，随后随着豆浆pH值的降低，其他亚基凝聚（不同蛋白质亚基含量与豆浆pH值的绝对R2为0.962–0.956）。这一结果与Ringgenberg等人的发现相似，表明在pH<5.90时，与A3甘氨酸多肽一起，β-伴甘氨酸的β亚单位不再存在于上清液中。我们的研究结果也与Malaki-Nik等人的结果一致，表明含有大量A3的沉淀组分中的豆浆颗粒导致豆浆中形成凝胶。此外，当FYW的添加比例为20%时，pH值为4.02是FYW诱导豆浆蛋白质凝固和改变豆浆中不同亚基分布的重要拐点，这一结果与图1A中的结果相似。Li等人一致报告，用菌株JMC-1发酵的大豆乳清产酸率高，在16小时前达到pH<4.00，被认为是合适的豆浆凝固剂。另外也有人表明，3.80–4.00是酸诱导豆浆聚集的最佳pH值，因此，在我们目前的研究中，4.02的pH值被确定为FYW诱导豆奶蛋白凝固的最佳点（图1）。
图1 添加量为20%的FYW的pH值对豆浆凝固过程中蛋白质一维分布的影响
条形代表平均值±SD（n=3）。（A）指示豆浆的pH值。（B）和（C）分别表示SSF和SPF的SDS-PAGE蛋白谱的变化。（D）和（E）分别表示根据（B）和（C）计算的百分比。SPF、SSF、FYW和M分别代表豆乳颗粒部分、豆乳上清液部分、发酵黄乳清和蛋白质标记物。
3. 不同添加量的FYW对豆浆蛋白凝固的影响
3.1 蛋白质凝固
然后我们用pH值为4.0的FYW培养豆浆样品，调节FYW与豆浆的不同比例（0.0%，5.0%，10.0%，15.0%，17.5%，20.0%，22.5%和25.0%，v/v）作为凝固条件。随着添加植物乳杆菌D1031发酵的黄色乳清，豆乳中的蛋白质颗粒逐渐形成团聚体。在图2A中，当FYW的添加量从12.5%（v/v）增加到17.5%（v/v）时，在1.00×104g 离心后，颗粒组分中的总蛋白质含量从1.23急剧增加到8.01 mg/mL，并且我们在上清液组分中分别观察到从8.77到1.87 mg/mL的下降，随着发酵黄乳清添加量的增加，当FYW添加比例为0.0%-15.0%（v/v）时，豆浆的pH值缓慢下降（p<0.05）（豆浆pH值与FYW比例的R2=-1.000）。当FYW添加量为15.0%～17.5%（v/v）时，豆浆pH值变化较大，从6.00降至5.85。FYW比为17.5%（v/v）是豆乳蛋白质凝聚的重要点，在pH5.85时豆乳中蛋白质颗粒大量聚集，这一结果与FYW的pH值对豆奶蛋白凝固的影响一致（图1A）。pH值为5.80–5.90可能是关键和最佳的环境酸度，通过豆浆的直接酸化间接地将蛋白质转化为聚集体。
经FYW诱导凝固后制备的豆浆絮凝物是一种酸诱导凝胶，与GDL诱导凝固形成的凝胶相似。GDL是一种含有内酯基的碳水化合物，在水中逐渐水解形成葡萄糖酸，并导致pH值降低。Hsia等人报告说，添加4 mM GDL后，豆浆的pH值从6.6降至5.90，改变pH值以接近等电点导致静电排斥力降低，并导致低溶解度蛋白质聚集形成蛋白质凝胶，关于酸化诱导大豆蛋白凝固的其他报告也显示了类似的结果，即豆浆的凝胶化发生在pH5.80。
3.2 SDS-PAGE分析
在本研究中，不同浓度的FYW被用作凝聚豆奶蛋白质的凝固剂。图2（B-C）中的SDS-PAGE显示，在不同比例的FYW培养的豆乳上清和颗粒部分中，我们分别分离出7Sα'、7Sα、7Sβ、11S A3、11S酸性和11S碱性蛋白质。结果表明，随着FYW添加量的增加，SPF的亚基蛋白条带强度增强，而对于SSF，谱带深度的变化与FYW浓度之间存在负相关。图2（DE）显示了对应于SDS-PAGE蛋白质图谱的密度图，当FYW添加量为10.0%～17.5%时，颗粒组分中7Sβ、11S A3、11S酸性和11S碱性蛋白含量分别升高（均p<0.05），上清液中7Sβ、11S A3、11S酸性和11S碱性蛋白含量急剧下降（均p<0.05）。与上述结果不同，随着FYW用量的增加，7Sα′和7Sα亚基在大豆蛋白凝固过程中的聚集速率明显减慢；当FYW浓度达到17.5%（v/v）时，超过50%（w/w）的7Sα′和7Sα亚基在SPF中沉淀；不同的7S和11S蛋白最终形成团聚体，并以>95%的相对水平（w/w，SPF和SSF中的单个蛋白质含量）在沉淀中下降。
因此，17.5%（v/v）的FYW浓度被确定为豆乳蛋白凝固的最小适宜添加量。7S和11S大豆蛋白迅速大量沉淀，FYW比率分别在0.0%-17.5%（v/v）和17.5%-25.0%（v/v）之间（不同蛋白质亚基含量与豆浆pH的绝对R2为0.908-0.951），不同亚基的沉淀顺序取决于其等电点（pI）的变化。7Sα′和7Sα亚基的pI值分别为5.43和5.09，低于7Sβ亚基（5.88）和大多数11S蛋白（5.38-5.73），因此，随着FYW与豆浆比例的增加，pI值较大的亚基的聚集形成较早。上述结果不仅对豆乳分段凝固选择性地从大豆中获取或去除某些蛋白质，而且对FYW豆腐的工业化和标准化生产具有指导意义（图2）。
图2 FYW（pH4.00）添加量对豆浆凝固过程中蛋白质一维分布的影响
条形代表平均值±SD（n=3）。（A）指示豆浆的pH值。（B）和（C）分别表示SSF和SPF的SDS-PAGE蛋白谱的变化。（D）和（E）分别表示对应于（B）和（C）计算的百分比变化。SPF、SSF、FYW和M分别代表豆乳颗粒部分、豆乳上清液部分、发酵黄乳清和蛋白质标记物。
3.3 2-DE分析
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳、图像分析和蛋白质数据库的开发被认为是探索蛋白质的有用工具。本研究进一步采用双向电泳技术结合质谱（MS）鉴定蛋白质，研究了蛋白质分布的变化。首先，在pH值为4–7的范围内，我们使用2-DE分离豆浆的蛋白质模式（图3），具有独特分子量（MW）的蛋白质可能被染料标记并在双向凝胶中移动到多个位置，因为有些蛋白质具有不同的电荷量或具有异构体。我们总共选择了29个蛋白质点，并用胰蛋白酶消化，所得的肽混合物通过质谱分析（如补充图2所示）。然后根据表1中的分子量和π，我们对鉴定出的蛋白质进行单独编号和编目，蛋白质点可分为13组，包括7Sα亚基（点1）、7Sα'亚基（点2）、蔗糖结合蛋白（SBP，点3-4）、7Sβ亚基（点5-9）、11S A3亚基（点10-12）、11S A4亚基（点13）、11S A1a亚基（点14-19）、Bd 30 k（点20-21）、11S A2亚基（点22），11S A1b亚单位（点23-24）、凝集素（点25-26）、胰蛋白酶抑制剂A（TA，点27-28）和胰蛋白酶抑制剂B（TB，点29）（表1，图3）。
我们用不同浓度（0.0%、15.0%、20.0%和25.0%，v/v）的FYW孵育加热的豆浆样品，分别用双向凝胶电泳分析SSF和SPF中的蛋白质。根据图3，在豆浆中不添加凝固剂的情况下，大多数蛋白质亚基存在于上清液组分中，而在沉淀物中很少。当FYW浓度增加到15%（v/v）时，SSF和SPF的蛋白质斑点深度分别显著减少和增加。在离心豆乳的表层和沉积部分我们观察到13种蛋白质。图4显示了对应于2-DE分析计算的单个蛋白质含量的倍数变化。与凝固前相比，它们的相对含量在SPF中随FYW浓度的增加而变化（均p<0.05），而在SSF中则相反。这一结果类似于FYW用量对豆浆上清液和颗粒部分蛋白质总含量以及蛋白质颗粒聚集的影响（图2A）（不同蛋白质亚基含量与总蛋白质含量的R2为0.825–0.895）。
此外，特定的蛋白质分布详细说明了FYW浓度对豆浆凝固的影响。当FYW添加量超过15.0%（v/v）时，SSF中SBP、7Sβ亚基、11S A3亚基、11S A1a亚基（17-19点）、Bd 30k、凝集素和TA的含量分别减少到初始量的0.20倍以下。11S A4、11S A1a（14-16点）、11S A2和11S A1b亚基在大豆蛋白质沉淀序列中聚集较晚；对于7Sα、7Sα′和TB蛋白，我们在豆浆中添加15.0%（v/v）的FYW后，它们在SPF中的相对含量仅为0.22、0.28和0.23倍（与未凝固时的相应含量相比），7Sα、7Sα′和TB是FYW诱导豆乳凝固过程中最后形成团聚体的蛋白，这些现象与图1（D-E）和图2（D-E）中观察到的现象一致，即7Sβ和11S A3亚基在豆浆相对较高的pH值下开始凝结，然而，7Sα，7Sα'亚基表现出明显的聚集延迟（图4）。
表1 从2-DE中鉴定和编目的豆奶蛋白质
图3 FYW（pH4.00）添加量对豆浆凝固过程中蛋白质双向电泳图谱的影响
A-D和E-H表示SSF和SPF的变化。SPF、SSF和FYW分别代表豆乳颗粒部分、豆乳上清液部分和发酵黄乳清。
图4 FYW（pH4.00）的添加量对豆浆凝固过程中蛋白质折叠变化的影响
条形代表平均值±SD（n=3）。A和B表示SSF和SPF的变化。SPF、SSF和FYW分别代表豆乳颗粒部分、豆乳上清液部分和发酵黄乳清。
3.4 不同添加量FYW对异黄酮分布的影响
我们用不同量的FYW（0.0%-25.0%，v/v）孵育的豆奶中存在的六种主要异黄酮被鉴定为大豆苷元、大豆苷元、染料木素、染料木素、甘氨酸和甘氨酸，并分别在SSF和SPF中测定其含量（图5），结果表明，热豆奶上清液中异黄酮含量均超过80%（w/w）。随着FYW添加量从15.0%（v/v）增加到17.5%（v/v），异黄酮与蛋白质亚基一起沉淀到SPF中，它们在SSF中的比例突然下降到约20%（w/w）（p<0.05），之后保持稳定。SSF和SPF中不同异黄酮含量与总蛋白含量的R2分别为0.992～0.997，蛋白质-异黄酮复合物可能是通过疏水作用形成的；与这一发现类似，Prabhakaran等人先前也报道了由凝固剂诱导的豆浆絮凝沉淀物是异黄酮的极好来源。
有趣的是，与相应的糖苷形式（大豆苷元、甘氨酸苷元和染料木素）相比，随着FYW比率的增加，异黄酮苷元，包括大豆苷元、甘氨酸苷元和染料木素，更有可能从SSF聚集到SPF中。由于凝固作用，两类异黄酮在豆乳的上清和颗粒组分中的分布不同，这一结果是由于豆奶蛋白质的表面疏水性以及蛋白质与异黄酮之间的相互作用，从而影响了豆腐制品中异黄酮的含量。据报道，葡萄糖苷的官能团使结合物比苷元更具亲水性，使它们在水相中比在蛋白质中更容易接近。我们的结果与Jackson等人的结果也一致，他们证明了豆浆凝固过程中异黄酮数量的损失，以及几种异黄酮释放到上清液中与蛋白质对异黄酮的亲和力之间的关联。我们一致认为，大豆苷元、甘氨酸苷元和染料木素与7S和11S蛋白的结合程度分别大于大豆苷元、甘氨酸苷元和染料木素，并且在氯化钙诱导和GDL诱导的凝血条件下更容易与大豆蛋白共沉淀（图5）。
图5 FYW（pH4.00）添加量对豆浆凝固过程中异黄酮含量的影响
条形代表平均值±SD（n=3）。（A）和（B）表示SSF和SPF的变化。SPF、SSF和FYW分别代表豆乳颗粒部分、豆乳上清液部分和发酵黄乳清。
结论
本文系统地研究了植物乳杆菌D1031发酵黄乳清诱导凝血的蛋白质组学。我们采用不同pH值和添加量的FYW，在FYW豆腐生产过程中诱导豆浆凝固。SDS-PAGE、2-DE和HPLC分析结果表明，有机酸是FYW的主要促凝剂，其中以乳酸为主，对豆浆的促凝作用最大；此外，沉淀豆乳蛋白主要由7S（α'、α和β）、11S酸性（A1a、A1b、A2、A3和A4）和11S碱性（B1a）亚基组成，添加FYW后，7Sα和7Sα'的聚集速度比其他亚基慢。由于糖苷的损失，豆浆沉淀中以苷元形式存在的异黄酮比异黄酮糖苷更容易获得，综上所述，FYW是一种适用于豆浆凝固的工具。我们系统地研究了上清和絮凝豆乳中主要大分子的含量和组成，为FYWFUTU的工业化生产提供了理论依据。不添加化学物质的豆浆聚合可以进一步减少全球环境污染，减少资源浪费。
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