编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
GPR52是一种A类孤儿G蛋白偶联受体（GPCR），被认为是治疗亨廷顿病和多种精神疾病的理想靶点。尽管最近有研究发现GPR52的结构揭示了一种可能由所有已报道的激动剂共享的结合机制，但小分子拮抗剂E7不能进入这种激动剂结合囊，其与受体的相互作用模式仍然未知。在本篇文章中，我们采用靶向蛋白质组学和亲和质谱方法来揭示E7作为GPR52共价和变构配体的独特结合模式。在本研究确定的与E7形成共价结合物的三个Cys残基中，细胞内的C1564.40对E7的拮抗活性贡献最大。发现这种新的拮抗剂共价连接细胞内位点将有助于设计GPR52选择性负变构调节剂，以作为治疗亨廷顿病的潜在疗法。
论文ID
实验设计
实验结果
1. E7是GPR52的共价配体
最初，我们采用基于亲和质谱（MS）的分析来测量配体E7与GPR52的结合亲和力，然而令人惊讶的是，该分析未能检测到任何E7结合信号。由于亲和质谱分析仅捕获非共价蛋白质-配体相互作用，该结果排除了E7与GPR52非共价相关的可能性。当我们注意到E7具有亲电的α，β-不饱和羰基时，我们怀疑该化合物可能通过迈克尔加成15与受体中Cys和Lys的亲核残基形成共价加合物（图1A）。
为了验证这一新假设，我们首先从过度表达重组受体的sf 9昆虫细胞中纯化了人GPR52蛋白（图S1），将该蛋白与化合物E7在50μM的洗涤剂胶束中孵育，然后在LC-MS/MS分析之前用双蛋白酶进行消化以确定潜在的E7结合位点。使用的两种蛋白酶——糜蛋白酶和胰蛋白酶，序列覆盖率高达84%（图1B），而纯化受体的三个Cys残基，即跨膜区的C27和c143.25和C1564.40（上标表示根据Ballesteros-Weinstein命名法16的残基数），被E7化学修饰。在C27、C1143.25和C1564.40与E7共轭的GPR52肽的MSMS光谱中，携带E7修饰的肽片段离子被清楚地注释（图1C-E）。值得注意的是，对于一种新合成的化合物（Comp-43），也具有Michael系统，并且在GPR52上显示出低微摩尔拮抗活性（支持信息，图S2），我们没有在化合物培育后在受体的Cys或Lys残基上鉴定出任何共价修饰，这一结果强烈支持E7与GPR52中所选Cys残基的特异性结合。
为了研究E7是否能与活细胞中GPR52的特异性Cys残基共价结合，我们用相同浓度的E7处理表达GPR52的HEK293F细胞，然后从分离的细胞膜上鉴定GPR52中的E7修饰位点。结果发现C1143.25和C1564.40在活细胞中也与E7结合，MSMS光谱支持与纯化的GPR52的E7修饰肽非常相似（支持信息，图S3）。然而，在本实验中，我们不再观察到E7对C27的改性。综上所述，E7是一种共价配体，主要针对活细胞中GPR52的这两个Cys残基，E7与C27的结合仅发生在纯化的受体上，其生理相关性较小。
为了研究E7是否能与活细胞中GPR52的特异性Cys残基共价结合，我们用相同浓度的E7处理表达GPR52的HEK293F细胞，然后从分离的细胞膜上鉴定GPR52中的E7修饰位点。结果发现C1143.25和C1564.40在活细胞中也与E7结合，MSMS光谱支持与纯化的GPR52的E7修饰肽非常相似（支持信息，图S3）。然而，在本实验中，不再观察到E7对C27的改性。综上所述，E7是一种共价配体，主要针对活细胞中GPR52的这两个Cys残基，E7与C27的结合仅发生在纯化的受体上，其生理相关性较小。
值得注意的是，C1143.25位于跨膜螺旋（TM）3中，它与细胞外环（ECL）2中的C193形成二硫键，如GPR52蛋白质结构所示（图1F）。这种二硫键在A类GPCRs中高度保守，并被认为是GPR52内在信号活性所必需的。更有趣的是，C1564.40位于TM4的细胞内侧，与细胞内环（ICL）2非常接近（图1F）。该残基远离细胞外侧的典型正构囊，用于配体结合到各种A类GPCRs（图1F），从未报道被GPCRs的任何化学配体靶向。
图1 GPR52中E7结合位点的鉴定
(A)通过Michael addition将E7偶联到Cys残基上的反应体系，可以生成两种可能的产品。（B）双蛋白酶消化蛋白质的LC-MS/MS分析中GPR52的序列覆盖图。(C−E)在C27（C）、C114（D）或C156（E）处用E7修饰的GPR52肽的MS/MS光谱。（F）GPR52的snake图显示了跨膜结构域和细胞内/细胞外环（ICL/ECL）的拓扑结构。
2. 位点特异性E7与GPR52结合的化学计量
为了了解E7与GPR52特定Cys残基结合的化学计量，我们进行了基于平行反应监测（PRM）分析的靶向蛋白质组学实验，以量化不同条件下E7修饰肽和未修饰肽的丰度。纯化的GPR52蛋白用增加量的E7（10 μM、25 μM和50 μM）处理，蛋白质消化物进行PRM分析，该分析监测具有较高灵敏度和特异性的选定肽组（图2A）。在给定的化合物处理条件下，E7与特定Cys残基的结合百分比可基于来自相应E7修饰肽和未修饰对应物的片段离子的靶向MS峰强度来估计（图2B，D；表S1，S2）。
靶向蛋白质组学结果表明，最低浓度（10 μM）的E7处理导致纯化受体与C1143.25和C1564.40有少量结合（<10%），而与C27没有结合。将E7浓度增加到50μM导致在不同位置与E7结合的GPR52蛋白质分数增加（C27为58.9%，C1143.25为6.63%，C1564.40为39.8%；图2C）。同样，当E7以更高浓度（10 μM和50 μM）处理时，活HEK293F细胞中表达的GPR52显示E7与C1143.25和C1564.40共轭的化学计量比增加（图2E）。具体来说，E7结合水平在C1143.25和C1564.40分别达到1.3%和29.1%，处在较高的测试浓度。
图2 E7与GPR52位点特异性偶联的PRM分析
（A）PRM分析中监测的E7修饰肽和未修饰对应物的列表。（B）从与E7在不同浓度下孵育的纯化GPR52蛋白质中提取监测肽（左侧，E7修饰；右侧，未修饰）的片段离子色谱图。（C）测定E7与纯化的GPR52与E7孵育的特定Cys残基结合的化学计量比。（D）从不同浓度E7处理的活细胞中的GPR52中提取监测肽（左侧，E7修饰；右侧，未修饰）的片段离子色谱图。（E）测定用E7处理的活细胞中E7与GPR52的特定Cys残基结合的化学计量比。
3. E7作为GPR52的变构配体
据报道，E7是一种新型的GPR52拮抗剂，其抑制受体活化和细胞内cAMP信号传导的效力适中（IC50为12.0 μM）。值得注意的是，在我们的研究中确定的E7（C1564.40）主要靶向位点既不在A类GPCR的细胞外正位囊中，也不在所有报道的GPR52激动剂所占据的特定侧位囊中，而是附着在细胞内Cys残基上。因此，我们推测E7可能是负变构调节剂（NAM）。
虽然没有建立这种孤儿受体的放射配基结合试验，但我们采用了我们实验室开发的基于亲和质谱的试验来测量受体-配体的相互作用。在这个亲和质谱实验中，纯化的受体被固定在亲和树脂上并与给定的配体孵育。然后，我们从溶液中分离配体结合的蛋白质复合物，将配体从复合物中解离并进行LC-MS分析以进行化合物检测（图3A）。我们根据MS峰强度确定单个配体的定量结合指数，以反映其结合特异性和相对亲和力等级。
利用这种亲和质谱分析，我们对一组GPR52激动剂（EXseries和WO-459）进行了配体竞争实验，这些激动剂都被预测与细胞外侧的侧袋结合（图S4）。通过亲和质谱分析测定的所有受试激动剂的结合指数均显著超过通常定义的阈值2（P<0.01，n=4），表明与对照组相比与GPR52特异性结合。这些激动剂与另一种过量激动剂7m的竞争显著降低了它们的结合指数，这证实了所有受试激动剂和7m都与GPR52的同一口袋结合（图3B），而用大量过量的E7培养受试激动剂对与GPR52结合的激动剂影响很小或没有影响（图3C）。E7无法从侧袋中竞争大多数激动剂，这意味着E7与变构位点结合。
我们还进行了反向配体竞争实验，通过使用靶向PRM分析监测激动剂7m存在下位点特异性E7与GPR52的结合。与亲和力MS测量一致，当用过量的7m处理蛋白质时，C1143.25和C1564.40残基处E7与纯化的GPR52蛋白质结合的化学计量没有减少，而是略有增加（图3D，支持信息，表S3）。这一结果表明，激动剂7m不能竞争，而是增强了E7与受体的结合，从而巩固了E7是一种主要针对GPR52的细胞内位点的变构配体概念。
图3 配体竞争实验表明E7与变构位点结合
（A）我们的实验工作流程示意图。（B）所有受试激动剂（EX系列和WO-459）与过量的另一种激动剂显著竞争。（C）所有受试配体均未与过量E7显著竞争。（D）过量的激动剂7m使E7与GPR52的C114或C156的化学计量学略有增加。
4. GPR52的C1564.40有助于E7的拮抗活性
为了阐明不同Cys残基在介导E7拮抗作用中的作用，我们使用cAMP累积试验评估了野生型受体与单个Cys突变体在E7存在或不存在时的信号活性。宽型受体虽然具有很强的组成活性，但能被激动剂WO-459进一步激活（EC50为0.67 nm）。E7不仅降低了受体的组成活性，而且使激动剂的剂量-反应曲线向右侧移动，对应于WO-459的EC50增加了10倍以上，并证实了E7的拮抗活性（图4A，表1）。考虑到突变可能会影响激动剂或拮抗剂的组成活性和效力，我们使用了有无E7时激动剂的EC50的比率，EC50（E7/DMSO），排除突变对受体组成活性和激动剂效价变化的影响，仅评估E7拮抗剂对激动剂诱导的受体激活的强度。
对于C27A突变体，它仍然显示出显著的组成活性，而C114A突变完全消除了受体的组成活性。然而，这两种突变体仍然可以被激动剂WO-459以低于野生型的效力激活（图4B，C，表1）。E7处理几乎完全消除了两种突变体的WO-459诱导的受体激活（图4B，C），这导致了EC50（E7/DMSO）的高比率（表1），表明E7的拮抗活性不受这两个Cys突变的影响甚至增强，证实了我们先前的发现，即C27和C114可能不是活细胞中E7的主要靶向位点。而E7没有引起突变株C156A上WO-459剂量-反应曲线的显著右移（EC50（E7/DMSO）=1.1），表明当C1564.40被Ala取代时，E7不再能够抑制激动剂诱导的受体激活（图4D，表1）。综上所述，在本研究确定的三个E7结合残基中，细胞内位点C1564.40对E7对GPR52的拮抗活性贡献最大。
由于假设E7扩散穿过细胞膜并与C156形成功能性结合物，因此当C156附近的其他关键细胞内残基突变为Cys时，E7也可能以其为靶点，从而增强其拮抗作用。我们选择位于ICL2的S148来验证这一假设，ICL2是已知G蛋白相互作用和受体激活所必需的区域。与野生型（EC50（E7/DMSO）=12.6）和C156A突变体（图4E，表1）相比，S148C突变体（EC50（E7/DMSO）=33.3）中E7的拮抗活性确实增强。此外，与S148C（图4F，表1）相比，双突变体S148C/C156A（EC50（E7/DMSO）=3.7）中E7的拮抗作用显著减弱，再次表明C1564.40是E7在活细胞中的主要靶向位点，E7对S148C的拮抗作用也取决于E7与该Cys残基的结合。
为了检测野生型受体和每个Cys突变体的表面表达，我们通过FACS进行免疫染色（图S5）。突变体C156A、S148C/C156和S148C的表面表达与野生型相当，虽然C27A和C114A的表面表达低于50%，但我们从相对比EC50（E7/DMSO）得出的结论仍然适用于这两个突变体。
图4 E7对不同Cys突变体激动剂诱导的GPR52活化的拮抗作用
用电穿孔法将野生型GPR52（A）、C27A突变体（B）、C114A突变体（C）、C156A突变体（D）、S148C突变体（E）或S148C/C156A突变体（F）转染HEK293细胞。
表1 通过cAMP累积试验测定在E7存在或不存在的情况下激活GPR52的WO-459的EC50值
5. 提出了E7对GPR52的拮抗作用模型
受靶向蛋白质组学、亲和质谱和功能测定结果的启发，我们提出E7是GPR52的共价配体，主要靶向C1143.25和C1564.40两个残基。在没有拮抗剂的情况下，载脂蛋白受体被组成性激活并与其信号转导子异三聚体Gs复合物相关（图5A）。在E7处理后，小部分化合物共价连接到C1143.25上，这可能会破坏受体自动激活所需的二硫键。出乎意料的是，我们的研究发现，该化合物的很大一部分可以通过细胞膜并与C1564.40共价连接。由于TM4中的这种细胞内残基与ICL2非常接近，因此大块化合物的共价修饰可能破坏G蛋白与受体的相互作用，导致E7的拮抗行为（图5A）。
两个E7靶向位点的序列比对显示C1143.25在A级GPCR中高度保守，而C1564.40是仅存在于GPR52中的受体选择性残基（图5B）。值得注意的是，Gs偶联信号的E7拮抗作用仅在GPR52上有效，而在一些被测试的A级和B级GPCR上无效。这一结果与我们的发现一致，即C1564.40是E7的主要靶位点，使其具有受体选择性。然而，它也可以解释E7拮抗作用相对较低的效力，因为它不直接针对已知对G蛋白偶联更重要的ICL2或ICL3中的关键位点。
图5 提出了E7对GPR52的拮抗作用模型
（A）E7与两个半胱氨酸残基结合的示意图及其拮抗作用。GPR52蛋白结构（PDB 6LI3）用蓝色表示，二硫键用黄色表示，mini-Gs用绿色表示异三聚体Gs蛋白，E7用红色表示。在缺乏激动剂的情况下，载脂蛋白GPR52与Gs蛋白有内在联系。当E7共价连接到特定的Cys残基时，GPR52 Gs复合物可能解离。（B）在含有E7靶向残基C1143.25（上）和C1564.40（下）的区域中GPR52和选定的A级GPCR的序列比对。
结论
到目前为止，E7是唯一报道的孤儿受体GPR52的拮抗剂，但其结合机制尚不能通过分子对接来阐明。我们的研究采用了两种质谱技术，靶向蛋白质组学和亲和质谱分析，以揭示E7独特的结合模式。E7与GPR52在特定Cys残基处形成共价结合物，并且位点特异性结合化学计量比以化合物剂量依赖性方式增加。更有趣的是，E7主要靶向细胞内位点C1564.40，定点突变导致E7对激动剂诱导的受体信号的拮抗作用显著减弱。
尽管GPCRs与下游信号传导伙伴之间的细胞质界面已被报道被几种变构调节剂靶向，但它们都主要通过非共价π-π相互作用与TM2、TM7或螺旋8中的保守残基相互作用。C1564.40位于TM4区，是我们研究中发现的一个新的细胞内变构位点，可以通过共价修饰靶向。总之，我们发现拮抗剂共价结合的细胞内位点将为GPR52选择性负变构调节剂的设计提供新的线索。鉴于GPR52在介导亨廷顿病相关表型中的作用，这种NAM分子可能在亨廷顿病治疗中具有巨大潜力。
联系客服
