编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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在一些国家，仿冒使用复原乳来模拟鲜奶主要是牟取暴利；因此，建立一个强有力的市场监督方法是很重要的。本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC–Q-TOF-MS）技术，建立了一种非靶向代谢组学方法，以发现可用于超高温乳（UHT）和复原乳分类的生物标志物。此外，我们选择36个正电离模式和24个负电离模式特征作为候选标记，建立了UPLC-串联质谱（UPLC-MS/MS）多反应监测（MRM）方法；采用支持向量机（SVM）方法对所选潜在标记的响应进行处理，并观察到100%的可分类性。通过层次聚类分析，我们发现标记代谢物可分为三类：肽、脂类和核酸，结果表明，非靶向MRM代谢组学方法是鉴别UHT和复原乳的有效工具。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 代谢谱
我们使用UPLC–Q-TOF-MS获得复原乳和UHT乳的光谱，分别以正离子和负离子模式提取总共1885和1077种化合物（图S1），然后对代谢物数据进行无监督主成分分析以识别异常值并初步区分样本组。PCA得分图显示，几乎所有数据点都位于95%置信椭圆内，有两个明显分开的组（图1a和S2a）。前五个主成分（PCs）的变化在正离子模式下分别为31.5%、10.0%、8.3%、5.6%、5.2%，在负离子模式下分别为20.4%、14.6%、11.6%、7.7%、4.9%。所有质量控制结果都出现在主成分分析得分图的中心，这表明该仪器具有很高的准确性，并且能够以可重复的方式提供数据；此外，QC和其他样品表现出明显的聚类，表明不同品种的牛奶之间存在显著差异。无监督PCA表明，非目标方法可以有效地分离样本（图1a和S2a）。
为了确定区分正电离模式和负电离模式下牛奶的最佳特征，我们对数据进行监督OPLS-DA，以进一步研究两组之间的差异（图1b和S2b），两种类型的牛奶在正电离模式下由一个预测组分和两个正交组分拟合（图1c）。测定系数（R2X）为13.8%，这解释了正电离模式下重组乳和UHT乳之间响应（R2Y）方差的87.4%（图1c）。在负电离模式下，R2X的方差为9.3%，这解释了实验组之间（R2Y）86.5%的差异（图S2c）。在交叉验证7次后，我们测定了阳性（图1c）和阴性电离（图S2c）模式下的平均预测能力（Q2）分别为83.1%和82.3%。R2Y和Q2残差分别为0.034和0.042，说明OPLS-DA具有良好的累积预测能力。PLS-DA模型还进行了置换测试，以研究由OPLS-DA模型引起的过度拟合。我们的验证产生了两个R2Y值（0.974，0.966，p<0.001），排列数为1000，这证实了正离子和负离子模式下良好的累积预测能力（Q2:0.937，0.921，p<0.001）（图S3）。这些结果表明，OPLS-DA模型并没有过度拟合，在统计上是有效的。
2. 潜在生物标志物挖掘方法
为了筛选和鉴定重组乳和超高温乳中潜在的生物标志物，我们进行了OPLS-DA和t检验，VIP>1，校正p<0.01（FDR）；此外，我们使用预标准化数据计算复原乳和UHT乳之间的倍数变化（FC），并选择FC阈值1.5，如火山图所示（图1d和S2d）。数据显示，正电离模式下的63个特征在UHT牛奶中比在复原牛奶中高出1.5–126.6倍（log2FC>0.58，-log10 p>2，图1d中的右上区域）；此外，与复原乳相比，UHT乳中检测到的负电离模式下的29个特征高出1.5–92.6倍（图S2d）。这些特征可能是由于奶粉加工过程中的营养损失或UHT牛奶在储存过程中潜在的营养水解造成的；同时，与UHT样品相比，复原乳中正电离模式下的34个特征是UHT样品的1.5–7.5倍（log2FC<–0.58，–log10 p>2，图1d中的左上角区域），而负电离模式下的10个特征是UHT样品的1.6–4.8倍（图S2d）。尽管复原乳的变化幅度不如上述UHT乳，但这些结果仍然表明，在奶粉和UHT乳加工过程中，某些成分产生或数量增加。
图1 （a）牛奶样品（QC，混合牛奶；R，复原牛奶；U，UHT牛奶；n=30）正电离模式下的PCA评分图；（b）正电离模式下的OPLS-DA评分图（红圈和蓝圈为95%置信椭圆）。（c）正电离模式下的OPLS-DA模型（一个预测和两个正交分量）。（d）基于t检验的p值和正电离模式下获得的fold change（FC）值的化合物丰度火山图。
3. 独立数据采集（IDA）到多反应监测（MRM）工作流
我们从IDA数据集中筛选出165种代谢物（94种为正离子模式，71种为负离子模式）；其中，同位素、低丰度或无MS2信息的离子被去除，然后我们选择具有完整MS1和MS2信息的60个特征（正电离模式36个，负电离模式24个），使用UPLC–MS/MS建立MRM工作流（表1和表2），另外40个样本的SVM结果显示了100%的识别率（图S4），这表明选择的标记和识别模型是可靠的。
我们通过数据库搜索对候选代谢物进行注释和鉴定，并使用参考标准进行最终确认；鉴定了14个标记物（表3）。补充材料中提供了潜在标记物的提取离子色谱（XIC）色谱图和片段离子信息（图S5）。
表1 正电离模式下选定生物标志物的HPLC–MS/MS MRM参数和fold change
表2 负电离模式下选定生物标志物的HPLC–MS/MS MRM参数和fold change
表3 UHT和复原乳分化的生物标志物特征信息
4. 选定的生物标志物分类
为了进一步说明所选生物标记物的化学性质，我们对60份牛奶样品进行了层次聚类分析（HCA）（图2），在正电离模式下鉴定的36种代谢物在热图中聚集成三个区域（图2）。区域A、B和C分别含有16、9和12种代谢物。两个肽（m/z+=344.2542；254.1617）聚集在A区。同样，同样聚集在A区的剩余代谢物（m/z+=997.5778；850.9908；937.5269；206.0662；368.1179；932.1971）与两个特征肽高度相关（r2>0.89）；因此，它们也可能是肽。水溶性维生素B5和核酸代谢物，包括烟酰胺、胞苷和腺苷，聚集在B区。磷脂即溶血磷脂酰乙醇胺18:1（LPE 18:1，m/z+=480.3080）、磷脂酰胆碱15:0（pC15:0，m/z+=482.3221）、溶血磷脂酰胆碱16:1（lpC16:1，m/z+=494.3234）和溶血磷脂酰胆碱14:0（lpC14:0，m/z+=468.3082）聚集在C区。结果表明，蛋白质、核酸，重组乳和超高温乳的脂代谢；此外，在36种聚类代谢物中，超高温奶中33种代谢物的含量高于复原奶，以负离子模式鉴定的24种代谢物也接受HCA。正如在阳性模式下观察到的，脂质和肽是区分牛奶加工方法的主要因素（图S6），UHT乳中23种代谢物的含量高于复原乳。
图2 正离子化代谢产物的层次聚类分析
R、复原乳；U，UHT乳。
5. 阐明生物标记物的生物学功能
我们的研究结果显示，复原乳中蛋白质、核酸和脂质的含量明显较低，复原乳中胞苷和腺苷的含量分别是UHT乳的2.7倍和3.7倍。Fang等人还报道，婴儿奶粉中的核苷酸含量低于初乳和成熟乳中的核苷酸含量，大约70%的核苷酸以游离形式存在于液态奶中，在整个哺乳期内含量略有不同。我们的研究结果表明，核苷酸是高温和喷雾干燥加工牛奶的良好标志。
众所周知，牛奶中的水溶性维生素，特别是B族维生素，在热加工过程中会减少。维生素B6被选为时间和温度指标，用于研究各种保鲜技术生产的超高温奶，然而，我们的结果没有发现UHT和复原乳中维生素B6的含量有任何差异，这是因为UHT和复原乳都是在高温下加工的。我们的研究发现，UHT和复原乳中维生素B5及其衍生物（如烟酰胺）的含量存在显著差异，这与之前的一份报告一致，即喷雾干燥降低了维生素B5的含量。牛奶中的维生素B5主要以游离形式存在，在中性条件下稳定，但在干燥环境或用碱处理时容易被破坏。
在本实验中，复原乳中LPE18:1、PC15:0及其降解产物（LPC16:1和LPC14:0）的相对比例均低于UHT乳，这与以往的报道一致。由于据报道，PEs和PCs对氧化和水解很敏感，因此我们假设复原乳和UHT乳中PCs和PEs的浓度较低可能是由于前者在喷雾干燥过程中的自氧化作用，以及后者在储存过程中的耐热脂肪酶活性。此外，超高温奶中的三种含氧脂质2-羟基癸酸、12-羟基十二酸和2-羟基肉豆蔻酸的含量高于复原奶。含氧脂质来源于多不饱和脂肪酸（PUFAs），热不稳定，易自氧化；复原乳中多不饱和脂肪酸的低氧化程度主要归因于乳糖结晶和低水活性。先前的研究发现，在UHT、生牛奶和巴氏杀菌牛奶中，七种氧脂质的含量有显著差异，这支持了氧脂质易受热的观点。
这项研究表明，一些水解肽的水平是显着不同的重组和超高温奶。超高温奶中H-Leu-Ile-Val-OH（m/z+=344.2542）的含量高于复原奶，缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）是重要的支链氨基酸（BCAAs），主要来源于乳清蛋白；它们比牛奶中的其他结构蛋白更容易水解。此外，超高温灭菌和复原乳中H-Pro-Arg-OH（m/z+=254.1617）的含量也存在差异，复原乳中几乎检测不到这种肽。这些肽可能是通过超高温奶中耐热蛋白酶水解蛋白质而产生的，而奶粉中的蛋白酶活性因其水活性较低而受到限制。综上所述，这些肽被认为是很强的标记，可以区分重组和超高温奶。
结论
基于UPLC–Q-TOF-MS和多变量数据分析的高通量非靶向代谢组学方法被用于鉴定有助于区分UHT和复原乳的潜在代谢物。此外，我们选择60个特征（正电离模式下36个，负电离模式下24个）建立了UPLC–MS/MS MRM工作流程，而外部验证数据具有100%的可分类性，HCA用于进一步说明所鉴定代谢物的化学性质。我们还注意到，与UHT牛奶相比，复原牛奶中的营养成分含量普遍较低；这一观察结果需要进一步研究。我们的研究表明，基于UPLC–Q-TOF-MS结合UPLC–MS/MS和化学计量学分析的非靶向MRM代谢组学方法是鉴别不同加工乳的一种有效方法，需要进一步的研究来阐明候选标记形成的机制与牛奶加工的影响有关。
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