编译：思越，编辑：Tracy、江舜尧。
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糖尿病足是糖尿病主要的慢性并发症，是导致残疾和死亡的主要原因，目前的临床诊断和预后不足。对于糖尿病人来说，早期将糖尿病组进行风险分层，可降低住院、残疾和死亡率。除了降钙素原、白介素-3、C反应蛋白、白介素-1、肿瘤坏死因子α等炎性指标外，我们需要更全面的生物标志物去预测糖尿病足的风险和严重程度，以反应治疗干预的作用。由于全世界糖尿病人的数量不断上升，且具有复杂性，因此，整合多组学方法，去探究糖尿病相关的生物标志物是十分必要的。这些生物标志物的发现，有助于进一步优化早期临床诊断，促进疾病预防和预测，以及治疗评估，从而防止溃疡引起的截肢事件发生。近年来，对糖尿病足的发病机理和治疗方面的研究，已经取得巨大进展。在这篇综述中，我们详细地讨论了可以进行准确诊断和风险分层的新的生物标志物，并对它们做了总结。
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内容
1.简介
糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢疾病，主要由于胰岛素分泌和利用缺陷引起。目前，糖尿病治疗药物只能控制血糖水平，不能完全治愈该疾病。由于控制不当，糖尿病可能导致慢性并发症。据统计，15–25％的糖尿病患者会患上糖尿病足溃疡（DFU），并最终发展为糖尿病足和截肢。Zhang等人发现糖尿病足溃疡的患病率为6.3％，且男性发病多于女性，存在国家和地区差异。
由于DFU与微血管和大血管的长期并发症相关，因此有必要及早发现。对于糖尿病人来说，早期将糖尿病组进行风险分层，可降低住院、残疾和死亡率。生物标志物与生物学过程、致病过程以及对治疗干预的药理反应有关，对于早期临床诊断、疾病预防、以及疾病进展预测具有重要意义。随着分子生物学，基因组学，转录组学，蛋白质组学，代谢组学和微生物组学等发展，生物标志物呈现出了多样化趋势。基于DFU生理因素和愈合过程（图1），以下展示了部分潜在的生物标志物，并将其应用于临床实践当中（表1）。
图1 DFU病理生理因素及愈合过程
糖尿病的发生与环境、基因、胰岛功能障碍以及其他导致DFU的因素有关。在DFU溃疡愈合过程中，在结痂后，可能进一步恶化为坏疽，并最终导致截肢。愈合过程通常分为至少四个阶段：凝血，炎症，迁移扩散（包括基质沉积）和重塑
表1 DFU早期诊断的生物标志物
2.DFU的病理改变及其护理
2.1 病理因素
DFU的病理变化与高血糖症，周围神经病变，周围血管疾病，足部畸形，败血症，炎性细胞因子和感染易感性有关，其中大多数因素并不会单独导致DFU的发生。当胰岛素反馈回路发生异常时，胰岛素在敏感组织的作用会受到影响，进而导致胰岛β细胞功能异常。在2型糖尿病中，胰岛素抵抗会增加肝脏中的葡萄糖生成，减少肌肉和脂肪组织中的葡萄糖吸收，并由于β细胞功能障碍导致胰岛素释放减少，并最终引起血糖水平升高。若患者血糖控制不良，高血糖症会通过多种机制引起神经纤维损害，例如慢性炎症，晚期糖基化终产物形成和蛋白激酶C，其中，周围神经病变是引起DFU的最常见原因。神经病变导致足部畸形、关节活动受限，引起足部压力升高形成暂时性骨痂，进一步增加局部压力，引起局部组织损伤，炎症，组织坏死并最终形成溃疡。
2.2 伤口愈合和DFU
伤口愈合通常分为四个阶段：凝血，炎症，迁移扩散和重塑。在急性损伤中，这些阶段会平稳而有序的发展并最终愈合，而在慢性损伤中无法进行有序发展，会在炎症期停滞，最终无法愈合。在持续的炎症期中，巨噬细胞是促炎细胞因子的主要产生者，在从炎症阶段向增殖阶段的过渡中起关键作用；但是，糖尿病通过损害单核细胞向伤口聚集，抑制吞噬作用，防止炎性巨噬细胞转变为抗炎状态，从而破坏巨噬细胞功能。在晚期，糖尿病还会阻碍角质形成细胞和成纤维细胞的功能，从而引起上皮细胞的受损。目前，有超过100种已知的生理因素，延长了伤口愈合，包括：生长因子降低或受损，血管生成反应，巨噬细胞功能，胶原蛋白积累，白细胞募集，细胞外基质沉积，肉芽组织的数量，成纤维细胞和角质形成细胞的迁移和增殖，表皮神经的数量，骨骼愈合，细胞外基质（ECM）组分积累与基质金属蛋白酶（MMP）重塑平衡
2.3 DFU的护理
由于病因和病理机制复杂，通常治疗方法不止一种。目前DFU护理标准包括四个基本原则：感染管理，清创，缓解压力和必要时的血运重建，但治疗效果仍然不理想。目前，采用多学科方法进行DFU护理成为主流的方式，包括非手术清创剂，敷料和局部用药，高压氧疗法，负压伤口疗法，生物工程皮肤替代品，生长因子，干细胞，能量疗法、全身疗法等。Borys等人证明负压治疗对于二型糖尿病DFU患者是安全的，此外，这些新疗法仍缺乏足够的证据来证明其临床疗效。
3.DFU的生物标志物
3.1炎性生物标志物
3.1.1降钙素原
降钙素原(PCT)是甲状腺C细胞肝肺和肾实质细胞释放的多肽，在细菌感染的诊断中起着重要的作用。Umapathy等人对无DFU(WDFU)、传染性DFU(IDFU)和无传染性DFU(NIDFU)的血液分析发现，PCT可能是诊断IDFU患者的关键指标。在IDFU患者的ROC曲线中，PCT的ROC面积最大，高于C反应蛋白、白细胞计数和红细胞沉降率。当临界值为0.5ng / mL时，其敏感性为54％，特异性为100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为12％；此外，PCT的循环水平与T细胞因子正相关，暗示其用作IDFU诊断生物标志物的可能性。Massara的结果发现IDFU组的PCT和CRP水平显着高于NIDFU组，Park等人发现PCT和CRP与DFU感染程度显着相关，而只有PCT水平才能区分IDFU患者是否被感染。但是，Korkmaz等人发现，NIDFU患者的WBC、CRP、白介素-6、，ESR和纤维蛋白原水平更高，但PCT没有意义，此外，还有一些研究表明，PCT对轻度感染患者的预测效果较差，重度患者效果更好。
3.1.2 PTX-3
PTX-3蛋白是一种可溶性模式识别受体，是由单核吞噬细胞，成纤维细胞，髓样树突状细胞，颗粒细胞，肾小球系膜细胞，内皮细胞，平滑肌细胞和脂肪细胞在炎性部位合成，因此其水平可能与血管炎症密切相关。在炎症过程中，大量的PTX-3在血管壁中产生，在血栓形成和缺血性血管疾病中发挥内皮调节剂作用，抑制血管生成和狭窄。Ozer等人发现，PTX-3是诊断IDFU的有效标志物，在不同临床程度的IDFU亚组中均具有统计学意义。Takashi等人证明PTX-3与糖尿病和糖基化血红蛋白正相关，慢性高血糖会增加其血清水平，但其作为血管炎症的生物标志物证据仍然不足，需要进一步研究。
3.1.3 C反应蛋白
C反应蛋白(CRP)是起源于肝脏的血浆蛋白，是炎症反应的关键元素。当发生组织损伤和感染，其水平可迅速增加至正常值的1000倍以上，因此作为急性期检测标志物广泛使用。Weigelt等人发现急性DFU及其严重程度与蛋白质，细胞因子和趋化因子的显着增加有关，但与感染无关，且相比于WDFU患者，急性DFU患者的CRP，纤维蛋白原，IL-6水平明显升高。Metineren等人对56名DFU和坏疽患者手术前后的CRP水平，进行研究发现手术前后CRP值小于1.5、年龄为73岁与死亡风险增加显着相关；Jeandrot等人发现，CRP是区分一级和二级足溃疡的最有效指标，且CRP和PCT的升高很可能与TNF-α，IL-6和IL-1介导的免疫反应有关；Tecilazich等人发现，对DFU患者进行为期12周的前瞻性实验，发现CRP和IL-1α水平与伤口愈合有关。
3.1.4 白介素
白介素(IL)是由单核细胞和巨噬细胞产生了一组细胞因子，对免疫功能至关重要。当机体被感染时，IL会分泌到靶细胞上，并与激活靶细胞的表面信号结合，从而改变细胞行为。该水平的增高与胰岛素抵抗的发展，以及非正常愈合有关，并随着溃疡愈合而降低。Sabuncu等人发现DFU患者的IL-18水平显着增高；Weigelt发现急性DFU患者的IL-6水平高于无糖尿病足的糖尿病患者；Kolumam等人发现，IL-20亚家族在伤口正常愈合过程中被上调，且IL-20，IL-22和IL-24都可以促进糖尿病小鼠的伤口愈合。
3.1.5 肿瘤坏死因子-α
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为细胞信号蛋白，是主要的炎症调节剂之一，在细胞因子网络中发挥重要作用，其作为TNF家族的一员，主要由单核细胞，巨噬细胞和T细胞产生，并影响细胞/分子粘附，迁移，血管生成和凋亡过程。其通过激活T细胞，B细胞和巨噬细胞来调节免疫系统，从而诱导其他细胞因子和细胞粘附分子的表达，TNF-α在血管内皮细胞中显着表达，暗示其可能伤口愈合中发挥重要作用。Dhamodharan等人发现，在慢性伤口愈合过程中，BAFF的ROC面积高于CRP，并与CRP水平，干扰素（IFN）家族细胞因子、IL-10家族细胞因子正相关，与IL-6受体家族负相关。
3.2基因生物标志物
3.2.1 MicroRNA
MicroRNA是18至22个核苷酸长的非编码RNA，在转录后水平上调节着约三分之一的人类基因组。MicroRNA在增殖，分化，凋亡和发育等生物过程以及疾病的发病机理中起着重要作用。大多数MicroRNA独立表达，并在外泌体等细胞的各种转运下，在血液，唾液，脑脊髓液，尿液和其他体液中稳定表达，具有生物标志物和治疗靶点的潜力。
Lin等人发现，DFU患者的血清中miR-217水平升高，而HIF-1α和VEGF水平降低。HIF-1α作为miR-217的直接靶基因，在使用miR-217抑制剂的DFU大鼠，其足部溃疡面积减小，溃疡愈合速度加快，IL-1β，TNF-α和IL-6等炎性因子均显着降低；同时，足背伤口组织中的微血管密度，以及HIF-1α、VEGF、VEGFR2、eNOS、MMP-2和MMP-9的蛋白表达增高，暗示抑制miR-217可以通过HIF-1α/ VEGF通路，促进DFU大鼠的血管生成和炎症状态，从而有效促进溃疡创面的愈合，这些在血管生成和修饰中起着重要作用的miRNA，称为“angiomiRs”。miR-23家族属于血管生成因子相关angiomiRs，Amin等人发现，在IDFU患者的血液和组织中，血管生成因子SDF-1α显着降低，且在患有IDFU的T2DM患者中，miR-23a和miR-23b的组织特异性表达降低，而miR-23c升高，相关分析表明SDF-1α与miR-23c呈显着负相关，提示miR-23c是SDF-1α的候选血管生成抑制剂。Gao等人研究发现，miR-155在DFU患者的内皮祖细胞和高糖诱导的对照细胞中显著增高，miR-155的过表达可以增强高葡萄糖水平引起的乳酸氢化酶，细胞凋亡，活性氧类型事件增加，降低细胞活力和迁移；此外，miR-155可以靶向PTCH1的3'非翻译区，下调其mRNA表达，暗示miR-155可能是DFU的潜在治疗靶标。Zhang等人发现，DM患者外周血中的miR-126表达显着降低，并在DFU患者中下降更明显；Zhao等人通过对DF和DM患者的血清circRNA和mRNA测序发现，发现TLR6、RUNX1、ST2与DM和DF的进展有关，且溶酶体途径在DF的发生和发展中起关键作用，在circRNA和mRNA水平上为DF分子机制提供了线索。
3.2.2 基因多态性
基因多态性的发现可以反映疾病的发生与发展轨迹，并有助于了解人群的遗传易感性，DFU患者在基因多态性方面具有广泛的基因变异。Mir等人发现HSP70基因多态性、HSPA1B基因型与DFU的严重性和治疗结局相关。Zubair等人在一项前瞻性队列研究中，探究了DFU患者HSP70的C2437T单核苷酸多态性(SNP)的潜在作用，发现hspHSP70基因多态性与t等位基因呈显著正相关。Soroush等人发现，在伊朗人群中Vok基因FokI功能变异与DFU存在显着关联，与糖尿病患者的氧化应激有关；Amoli等人发现，DFU患者中VEGF基因较低的A等位基因频率具有保护作用，可能与血管生成增加相关。
最近的研究表明，缺氧及其引起的细胞异常反应影响DFU的伤口愈合。HIF-1是氧稳态的主要调节剂，通过调节与代谢改变，血管生成，增殖，迁移和细胞存活相关基因表达，提高细胞对缺氧的适应性应答，高血糖会抑制HIF-1信号传导，从而影响伤口愈合，因此，与HIF-1α调控有关的途径，可能在糖尿病伤口愈合机制中起重要作用。Pichu等人分析了H1F-1α基因多态性，发现DFU患者HIF-1α基因的表达与发病相关，且DFU患者存在HIF-1α基因多态性。
赖氨酰氧化酶家族LOX由赖氨酰氧化酶（LO）和赖氨酰氧化酶类似物（LOXL1-LOXL4）组成，具有稳定细胞外基质的功能，并通过调节细胞增殖，转移和血管生成促进伤口愈合。Pichu等人发现，2型糖尿病和DFU病人LOX基因(G473A)的a等位基因频率更高，并在转录水平得到证实，暗示T2DM和DFU患者与LOX基因多态性（G473A）有关。
3.3 蛋白生物标志物
蛋白质组学在疾病的早期诊断和准确预后方面取得了实质性进展。尽管存在方法的不统一和组织的异质性问题，但能帮助我们扩大对疾病的认识、发现新的生物标记物，以及更有效地进行早期诊断和疾病监测，打开新的方向。
中性粒细胞是人体中最丰富的白细胞种类，它可以吞噬和杀死入侵的微生物，构成了先天免疫反应的第一道防线。由传染因素和其他炎症因素引起细胞活化后释放的颗粒蛋白和染色质构成了细胞外纤维，称为中性粒细胞胞外陷阱(NETs)。高葡萄糖水平可诱发NETs介导的细胞死亡，且NETs是尿病损伤和糖尿病视网膜病变的驱动因素，NETs介导的细胞死亡是自然防御过程，但过度死亡会促进血栓形成，炎症和内皮功能障碍。Fadini等人通过蛋白组学发现，NETs成分在未愈合的DFU中增加，并且伤口中的中性粒细胞蛋白酶水平随感染水平增加和愈合延迟而升高。蛋白质精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)促进嗜中性粒细胞向组蛋白瓜氨酸化。在糖尿病小鼠的皮肤中，PAD4活性增加促进NET诱导的细胞死亡，PAD4活性的抑制减少了中性粒细胞的形成，并促进伤口愈合。此外，通过蛋白质组学分析，未与快速愈合的患者，发现差异蛋白主要与上皮分化、蛋白酶抑制、细胞凋亡、丝氨酸内肽酶活化，凝血和防御反应调节有关。Wang等人发现，巨噬细胞衍生趋化因子，Th2型CC趋化因子、Clusterin、Syndecan 4可能是DFU愈合的标志物。
在伤口愈合的复杂过程中，释放出的蛋白酶可用于胶原蛋白的降解，从而从受损部位去除死亡细胞和坏死组织。Krisp等通过质谱分析慢性糖尿病足渗出液的蛋白质组成，发现炎症反应刺激蛋白S100、MMP-1，MMP-2和MMP-8的含量升高，并伴随抗血管生成蛋白的升高；Jones等人发现，MMP-9不利于糖尿病伤口的愈合中，而MMP-8相反。
3.4 代谢生物标志物
随着代谢组学的发展，其应用与疾病的发病和病理生理机制研究越来越广泛。血清，血浆和尿液是代谢组学分析最常用的样品，血清或血浆可评估循环代谢物，而尿液可以检测经肾脏排泄的代谢终产物。有研究发现，一型糖尿病和二型糖尿病的患者通常会改变体内葡萄糖、果糖、氨基酸、和脂质的代谢，因此代谢助学技术可以帮助识别这些体内代谢物的变化。
由于DFU和糖尿病性肾脏疾病(DKD)都是由微血管功能障碍引起，Harrison等人对接受6周高压氧治疗(HBOT)患者的进行尿液代谢组学研究，发现HBOT可以减少治疗患者的肾脏损伤、氧化应激和线粒体功能障碍。为了确定与DFU患者伤口愈合相关氨基酸，Hung等人使用LC-MS靶向代谢组学方法分析DFU患者的血样，发现治疗后精氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和苏氨酸的血清水平显着升高，其中精氨酸是一种碱性氨基酸，可以改善伤口愈合；异亮氨酸和亮氨酸是支链氨基酸，可加速肌肉蛋白质合成。但是，通过代谢组学鉴定出的与伤口愈合相关的氨基酸，与传统创伤相关氨基酸不同，提示有必要对这些氨基酸进行后续研究。
3.5 微生物标志物
人体内存在大量的细菌病毒和单细胞真核生物，它们与宿主共存，统称为微生物群，该群落可以调节宿主的早期发展，以及宿主各阶段的营养及免疫情况。除了体表存在微生物群落环境，肠道菌群也与宿主之间存在复杂的相互作用，在有关糖尿病的肠道菌群研究中，Ralston等人发现，饮食、炎症信号和肠道微生物组之间存在显著相关性，并通过动物实验证明，肠道菌群与2型糖尿病的发展、胰岛素抵抗以及肥胖有关，产生短链脂肪酸的细菌会增强葡萄糖刺激的胰岛素反应，且这种反应在2型糖尿病中显著减少。
有关DFU的研究主要集中在伤口部位，目前已经鉴定出大量与DFU和糖尿病足感染(DFI)相关的细菌群落，对感染的预后有重要的作用。研究发现，病程较短的DFU的微生物构成更简单，主要有革兰氏阳性菌定值，而疾病进程较长的DFU，则具有更复杂的微生物组。脆弱拟杆菌是DFIs中最多的厌氧菌，但是厌氧菌的数量有限，对感染的进程影响很小。
除了伤口部位外，这些微生物还通过影响糖尿病的进程与DFU建立联系，通常包括：能量代谢、免疫反应，炎症、肠道屏障功能。这些结果表明肠道菌群的变化，可以限制如艰难梭菌等抗生素抗性相关细菌的过度生长。
结论
由于全世界糖尿病人的数量不断上升，且具有复杂性，因此，整合多组学方法，去探究糖尿病相关的生物标志物是十分必要的。近年来，对糖尿病足的发病机理和治疗方面的研究，已经取得巨大进展。这些生物标志物的发现，有助于进一步优化早期临床诊断，促进疾病预防和预测，以及治疗评估，从而防止溃疡引起的截肢事件发生。疾病生物标志物的研究在许多领域都迅速发展。
如果将新型标志物与临床观察结果相结合，并将这些结果与临床基准进行比较，那么将更有意义。就DFU而言，应考虑将这些标志物与潜在的临床相关性、以及临床证据相结合，但就目前而言，该标志物的研究仍处于早期阶段，需要更多的努力去揭示治疗的新见解，并提高预防和治疗水平。
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