蛋白质组学中蛋白样品的酶解方法——超滤管内酶解

接下来，我们开始正式详细地介绍蛋白质样品进行超滤管内酶解的方法！目前蛋白质酶解的过程主要分为以下几个步骤：

蛋白样品的酶解——超滤管内酶解（Filter-aided sample preparation，FASP）

1、一般取500 μg蛋白进行酶解，超滤管柱子的最大上样量为1 mg蛋白。当涉及所研究蛋白类的含量较低或者某些定量方法（例如DIA）时，应取蛋白样品1 mg（1 mg比较保险）。

2、然后加入适量8 M Urea，使其终浓度大于4 M，即1：1，以最低浓度的样品（所取体积最大）为准，其余较高浓度样品用8 M Urea 补齐至相同体积。

3、先配制1 M的二硫苏糖醇（DTT），取适量加入上述溶液中，使其工作浓度为50 mM（即1：20），37℃水浴1 h。

4、先配制1 M的吲哚-3-乙酸（IAA），取适量加入上述溶液中，使其工作浓度在120-150 mM，室温避光放置30 min。

5、先配制50 mM的NH4HCO3或者1:20稀释TEAB，用50 mM的NH4HCO3或TEAB润洗新的平底超滤管，12000 g离心10 min至液体全部滤下。注意：超滤管每次离心时间不要超过15 min（一般超滤管可以承受每次离心20 min）。

6、将样品加入超滤管，每次体积不要超过400 μL，12000 g离心15 min，注意离心时间。若样品体积过多则分几次离心，若样品越来越难以离心，则离心次数增加（下同）。（每次离心都需转换离心管角度）。

7、用8 M Urea 100 μL润洗2次，12000 g离心15 min，第二次离心若发现尿素没有离心下去，则应增加离心次数。

8、用100 μL 50 mM的NH4HCO3或200 μL TEAB润洗2-5次，根据前面离心难易程度调整离心次数，越难离心的应该次数越多。

9、更换新的收集管。

10、配制0.6 μg/μL胰酶：1 mL金标水+2.86 μL乙酸，从中取167 μL去溶解100 μg胰酶干粉，充分混匀。然后依次加入50 mM的NH4HCO3（或TEAB）和0.6 μg/μL胰酶溶液，胰酶加入体积按照1:30-1:50（胰酶与所取蛋白量之比），加入的NH4HCO3（或TEAB）的体积依据所加胰酶的体积定，使两者体积之和为120-130 μL。

11、保鲜膜包住整个试管架，放入37℃培养箱过夜。

12、酶解时间一般为16-18 h。

13、次日12000 g离心15 min，加70 μL金标水涡旋离心，滤液收集至新的EP管中。测浓度，计算酶解效率（酶解效率一般为50%-70%）。

14、冻干机冻干。

注意： 

1、所有试剂现配现用

2、所有试剂均用金标水配制

3、每步加完溶液后都要充分涡旋，每次润洗需充分涡旋

以上就是超滤管内酶解蛋白样品的基本过程，希望对大家能有所帮助，如果大家对此方法有任何疑问或建议，欢迎大家在推文下方留言，同时小编会根据大家的反馈，进行更进一步的说明和补充。最后，祝愿科研道路上的大伙们都能数据多多，文章多多，如果您觉得资源对您有所帮助，请多多转发，以帮助更多需要帮助的人!

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