编译：微科盟东方不赢，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读叶绿体保留了由核苷酸五磷酸鸟苷和四磷酸鸟苷或（p）ppGpp信号介导的细菌应激反应途径的元素。在模式开花植物拟南芥中，ppGpp充当质体基因表达的有效调节剂，影响光合作用，植物生长和发育，但是研究者们对ppGpp代谢或其在其他光合真核生物中的进化知之甚少。在本篇文章中，我们使用包含可诱导系统进行ppGpp积累的转基因品系研究了藻类P.tricornutum中ppGpp的功能，包括对生长，光合作用，脂质代谢和蛋白质表达的影响。我们证明ppGpp积累会减少光合作用能力，并促进减少增殖和衰老的静止状态。我们使用非靶向蛋白质组学，出乎意料地发现ppGpp积累还导致多个细胞区室中蛋白质保护反应的协同上调。我们的发现强调了ppGpp作为生活中不同领域叶绿体功能的基本调节剂的重要性，从而引出有关（p）ppGpp信号在光合作用真核生物中的分子机制和作用的新问题。原名：ppGpp influences protein protection, growth and photosynthesis in Phaeodactylum tricornutum译名：三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)中ppGpp对蛋白质保护，生长和光合作用的影响研究通讯作者：Ben Field，Brigitte Gontero
1. 诱导型（p）ppGpp合成酶可有效提高P.tricornutum 中ppGpp的水平我们开发了一种可调节叶绿体中（p）ppGpp水平的方法作为了解（p）ppGpp在P.tricornutum中功能的第一步。我们用一个合成的基因转化了P.tricornutum，该基因编码一个在NO3可诱导的启动子的控制下，细菌（p）ppGpp合成酶（SYN）叶绿体的靶向片段（图1a）。我们还构建了对照转基因品系，其表达相同酶SYND> G的催化失活形式。我们通过PCR鉴定了阳性转化子，并将转化子从含NH4的培养基转移至含NO3的培养基（图1b）以确认诱导后蛋白的表达，而SYN系的诱导表达还导致ppGpp水平增加至1.30±0.34 nmol mg-1的干细胞重量（图1c）；pppGpp未被检测到，表明SYN优先充当ppGpp合成酶，并且/或者pppGpp可以像细菌一样被内源酶转化为ppGpp。在诱导条件下，我们在SYND> G系或野生型中未检测到ppGpp。ppGpp基本水平的缺乏可能是诱导中营养转移的结果，因为我们能够在光照下在标准培养基中生长的野生型细胞中检测到少量的ppGpp（图S1）。有趣的是，我们还观察到细胞在黑暗中长时间孵育会导致ppGpp积累；我们同时量化了GTP水平，发现无论ppGpp水平如何，其浓度都与野生型对照相似（图1c，图S1）。图1 构建的三角褐指藻P. tricornutum NO3诱导系中的ppGpp积累（a）用于转化P.tricornutum细胞的构建的示意图。硝酸还原酶（NR）启动子和终止子（Term）来自pPha-NR载体。双向靶向序列来自叶绿体γATP合酶。这些基因编码（p）ppGpp合成酶（SYN）和SYN的无活性突变体（SYND＞ G）。（b）使用f/2-NO3诱导的来自不同转基因品系的提取物，使用anti-E. coli RelA抗体进行的蛋白质印迹分析。（c）SYN，SYND> G和WT系的ppGpp和GTP水平。2. ppGpp积累强烈抑制细胞分裂，对光合作用产生重大影响我们首先检查了ppGpp积累对生长和增殖的影响。五个独立的SYN品系在液体培养中诱导后显示出增殖的严重降低（图2a和图S2），而诱导并不影响对照SYND> G系或WT的增殖。诱导后，我们在琼脂平板上也可以清楚地看到SYN系增殖的降低（图2b）。光学显微镜观察表明，SYN细胞明显比对照细胞长（图2c）。（a）SYN，SYND> G和WT株系的生长曲线。将在f/2-NH4中生长的细胞转移（箭头）到用于诱导的f/2-NO3或作为对照的f/2-NH4中。（b）最初在液体f/2-NH4中生长的细胞（SYN，SYND> G）在NO3存在下或在NH4存在下作为对照生长在琼脂平板上生长的细胞集落。（c）诱导后SYN和SYND＞ G细胞的细胞长度（±SE，n在60至194个细胞之间）。统计显着性使用事后Dunnett检验，使用ANOVA计算。然后，我们分析了诱导后不同时间的色素含量（图3，图S3）。在野生型中，随着细胞进入静止期，诱导五天后，叶绿素a（Chla）和褐藻素的水平降低；而我们发现诱导的SYN系中没有出现色素含量的下降：SYN诱导的Chla和褐藻素诱导水平比SYND> G或WT明显更高（图3）；然而，在所有品系中Chlc水平的下降都是相似的，导致SYN品系中的Chla：Chlc比值更高（图3）。这些结果表明ppGpp积累抑制细胞分裂，同时可以稳定叶绿体中Chla和褐藻素的水平。将在f/2-NH4中生长的细胞转移到f/2-NO3中进行诱导。诱导后5天，用乙醇提取生长曲线对应的固定相的色素，并测定叶绿素a，叶绿素c和褐藻素的水平。数据是五个生物学重复的平均值±标准误差。对于WT对照，使用ANOVA进行事后Dunnett检验，计算统计学显着性，** P <0.01。在拟南芥中，ppGpp积累对光合作用活性有重要影响，因此，我们检查了光系统II（Fv/Fm）的最大效率（图4a-c）。诱导后的SYN转化系中Fv/Fm迅速降低，诱导后两天达到最小值0.12±0.004（SE）（图4a，b和图S4）。在同一时间点SYND>G系的Fv/Fm为0.6。而后我们进行了免疫印迹，以确定诱导的SYN系中Fv/Fm的降低是否是由于PSII结构的变化所致。实际上，我们发现在SYN谱系中，构成PSII反应中心核心的叶绿体编码蛋白D1的水平下降了（图4d）。相反，构成FCP探测受体主要部分的光捕获蛋白LHCf的水平则保持相对恒定（图4d）。这些结果表明，PSII的成分由于ppGpp积累产生了巨大变化。与降低的PSII效率相一致，在SYN系中，整个光合作用链的相对电子传递速率（rETR）也比WT或SYND>G对照品更低（图4e，f）。（a）在诱导后2天，对不同SYN，SYNG>D和WT系的暗适应细胞测量了光系统II的最大效率（Fv Fm）。（b）A中显示的SYN，SYND> G和WT分组品系的平均Fv Fm。（c）诱导后一天，SYN，SYND>G和WT的细胞集落的Fv/Fm假彩色图像。（d）诱导后两天，使用抗D1和LHCf1-11的一抗，从相等数量的细胞（7×104）中提取蛋白质的免疫印迹。诱导后两天，在（e）未诱导和（f）诱导的SYN，SYND>G和WT系中，不同光强度下的相对电子传递速率（rETR）。数据是SYN和SYND>G的分组品系的平均值±SE。使用ANOVA进行事后Dunnett检验相对于WT对照，计算统计学显着性，** P <0.01。3. ppGpp影响脂质和其他储备性化合物的积累和分布使用光学显微镜，我们在诱导后两天观察到所有SYN系中叶绿体附近的一个明显斑点，但与叶绿体清楚地分开（图5a）。在非诱导的SYN中不存在该斑点（图5b），无论条件如何，在SYND>G品系中均未检测到该斑点（图5c，图5d）。在光学显微镜下清晰可见的突出斑点被中性脂质特异性荧光团AC202强烈染色，表明它是脂质液滴（LD）（图5e）。此外，AC202染色还显示在对照SYND>G品系（图5f）和野生型中存在小叶绿体相关的LD。这些液滴的大小和位置与在诱导的SYN系中观察到的主要细胞质LD不同，并且在光学显微镜下不可见（图5e）。SYN细胞中的大多数脂质液滴诱导后五天消失（图5g）。大量的脂质液滴在SYND>G与WT中时位于生长曲线的稳定期（图5h），众所周知，LDs会随着培养物的老化而积累在硅藻中。（a）诱导后两天（48小时）后诱导的和（b）未诱导的SYN细胞。（c）诱导后两天诱导的和（d）未诱导的SYND>G细胞。诱导后两天用荧光团AC202标记的（e）SYN和（f）SYND>G细胞的荧光显微镜图像。（g）SYN和（h）SYND>G细胞在诱导后五天（120小时）。图像代表多个图像和至少两个独立的实验重复。比例尺对应于10μm的长度。为了进一步表征SYN细胞中的主要LD，我们使用流式细胞仪和尼罗红染色分析了生长不同阶段的中性脂质含量，然后使用TLC进行定量确认（图6a）。我们在硅藻中建立了尼罗河红色荧光与TAG含量之间的强相关性研究模式，用流式细胞仪测定的尼罗红色荧光随WT和SYND>G细胞中培养物的年龄增加而增加，但不随SYN细胞中培养物的增加而增加，与我们的显微镜观察一致（图5g，h）。然而流式细胞仪不够灵敏，无法检测诱导后两天的脂质含量差异。因此，我们先提取总脂质，再进行TLC定量，直接对TAG进行定量（图6b，c）。诱导后两天，SYN系中每个细胞的TAG量几乎是对照的两倍（P = 0.213）（图6b）。尽管无显著性差异，但这一发现倾向于支持我们在诱导后两天对SYN系中较高的中性脂质水平进行显微镜观察（图5a）。然而，诱导后五天，与流式细胞仪检测结果（图6c）和显微镜图像（图5g，h）相符，SYN品系的中性脂质含量比对照品低得多（6倍）。处于空泡中的硅藻中主要的碳氢化合物贮藏物Chrysolaminarin（β-1,3-葡聚糖）在诱导的SYN系中也比诱导后5天的对照中丰富（图S6）。（a）在生长曲线的不同天数，通过SYN，SYND>G和WT品系中的尼罗红荧光估计中性脂质。数据是三个生物学重复的平均值±SE。通过TLC（b）诱导后两天和（c）诱导后五天通过TAG测定。数据是五个生物学重复的平均值±标准误差。使用ANOVA进行事后Dunnett检验相对于WT对照，计算统计学显着性，** P <0.01。为了研究改变的ppGpp水平对膜脂质的影响，我们还分析了极性脂质含量。在硅藻叶绿体的膜中，就像其他光合生物的叶绿体一样，极性脂质基本上由单半乳糖基二酰基甘油（MGDG），双半乳糖基二酰基甘油（DGDG），磺基喹喔基二酰基甘油（SQDG）和磷脂酰甘油（PG）等组成。诱导后两天，SYN细胞中的极性脂质与WT或SYND>G对照的极性脂质无显着差异（图S5）；然而，诱导五天后，除DGDG和PG外，SYN细胞中所有其他极性脂质（MGDG，SQDG，磷脂酰胆碱，PC，磷脂酰乙醇胺，PE，磷脂酰丝氨酸，PS）的水平均高于SYND>G和WT对照（图7a）。此外，诱导五天后，SYN细胞中的FA含量和组成与对照相比有所不同，其中最丰富的FA含量（16：0和16：1）明显较低，并在18：1、18：2中降低。这些变化与SYN品系中较低的TAG水平一致，文献中报道，16：0、16：1、18：1和18：2是在三角褐指藻的养分限制条件下TAG中发现的主要FA物种。（a）诱导后五天测定极性脂质和（b）脂肪酸含量。MGDG，单半乳糖基二酰基甘油；DGDG，二半乳糖基二酰基甘油；SQDG，磺基喹喔基二酰基甘油；PG，磷脂酰甘油；PE，磷脂酰乙醇胺；PC，磷脂酰胆碱；PI，磷脂酰肌醇和PS，磷脂酰丝氨酸。数据是五个生物学重复的平均值±标准误差。使用ANOVA进行事后Dunnett检验相对于WT对照，计算统计学显着性，* P <0.05，** P <0.01。4. 蛋白质组学分析表明ppGpp积累导致蛋白质保护反应的协同上调通过SDS-PAGE分析诱导的SYN，SYND>G和WT的蛋白质谱，我们发现了SYN系中总蛋白质的主要变化，包括其他蛋白条带的出现（图S7）。为了了解这些变化的程度，我们进行了非靶向蛋白质组学分析，以比较诱导后两天诱导的SYN系和诱导的SYND>G系之间的蛋白积累。与对照品系相比，在鉴定出的1046种蛋白中，有145种蛋白在SYN中的累积表现出显着差异（表S1）。ppGpp积累不影响已知持家蛋白的表达，肌动蛋白12除外（表S1）。表I中列出了在SYN中显示差异积累的主要蛋白质组。出乎意料的是，许多分子伴侣和共分子伴侣在SYN中表达水平更高，而分子伴侣HSP20（B7G195）则表现出最大的增长。SYN中差异表达的分子伴侣由核基因编码，并预测具有不同的细胞定位；HSP40的四个伴侣分子，和HSP90的一个同工酶所包含ASAFAP六肽基序，预测可能为叶绿体定位；其他伴侣分子具有分泌途径的信号肽，而没有ASAFAP基序，表明其定位在内质网中；某些同时具有伴侣和蛋白酶功能的伴侣蛋白（如Lon蛋白酶）预计在线粒体内。我们发现，参与氨基酸代谢的许多转运蛋白和酶属于那些在SYN品系中表现出最大差异积累的蛋白质（表1）。值得注意的是，由于叶绿体谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的积累更多，且谷氨酰胺合酶水平较低，谷氨酸的合成可能被上调。谷氨酸参与氮同化，同时也是叶绿素生物合成的前体，叶绿体原卟啉IX镁螯合酶（叶绿素生物合成途径的关键酶）也更加丰富。脂质代谢的蛋白质也受到影响，参与脂肪酸降解的两种酶的水平增加：酰基辅酶A脱氢酶和烯丙基辅酶A水合酶（脂肪酸β氧化的关键酶）的同系物；噬菌体休克蛋白A（一种参与管理细菌胞外应激反应的蛋白）和谷胱甘肽S-转移酶（一种在细胞氧化还原稳态中重要的酶）也更加丰富。在SYN中，许多与光合作用和叶绿体翻译相关的叶绿体编码蛋白较少。与我们的免疫印迹实验一致，来自PSII复合物的7种蛋白质（包括PsbA/ D1蛋白）积累到较低的水平（图4d）。来自PSI和Calvin循环的一些蛋白也不太丰富，还有一个碳酸氢盐转运蛋白和两个碳酸酐酶蛋白都位于选择截止点之外（表S1），这表明光合能力在几个不同的水平上都降低了。光合作用机制需要大量的铁，并且与光合作用的下调相一致，我们还观察到了两种铁饥饿诱导的蛋白质的下调。有趣的是，两个捕光天线蛋白Lhcf15和Lhcx2也较少。因此，尽管我们的免疫印迹实验表明Lhcf1-11保持不变（图4d），但SYN诱导也似乎引起特定天线功能同工型蛋白质积累的变化。同样令人吃惊的是，SYN细胞中十二种叶绿体编码的核糖体蛋白水平降低，这表明ppGpp积累对叶绿体翻译能力有重要影响。在我们的蛋白质组学分析中，核糖1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）保持不变，这在考马斯染色的蛋白质凝胶上也可以直接看到（图S7）。我们使用含有诱导型系统表达细菌（p）ppGpp合成酶的转基因P.tricornutumSYN品系研究了（p）ppGpp的功能（图1a）。我们证明，SYN系中ppGpp含量的增加会改变光合系统结构并降低光合效率（图4）。另外，ppGpp积累会显着降低生长速率（图2），稳定叶绿素和褐藻素的水平（图4），并影响储备分子TAG和chrysolaminarin的积累（图5-7，图S6）。最后，ppGpp积累导致多个细胞区室中伴侣蛋白和其他应激相关蛋白的水平显着增加（表1，图8）。图8 ppGpp积累对P. tricornutum影响的总结
ppGpp积累会导致光合作用能力，叶绿体翻译机制，某些转运蛋白以及TAG和chrysolaminarin储存分子（以红色X表示）降低。 同时，ppGpp积累会导致参与蛋白质保护反应的蛋白质丰度大大增加（显示为紫色）。TP，磷酸三糖；PSII和PSI，光系统II和I；HSP，热激蛋白；T，运输载体。不同的独立SYN系产生不同数量的SYN，并积累了不同数量的ppGpp（图1）。如前所述，我们在SYN蛋白积累中观察到的差异很可能是由于外源DNA的拷贝数或插入位点的差异所致。在严格应答期间，诱导的SYN品系中达到的ppGpp的平均水平，与在大肠杆菌中达到的ppGpp的平均水平相似。如果我们假设物种之间的总GTP含量相似，则这些ppGpp的水平（占总GTP的600％）比在过表达类似（p）ppGpp合成酶（占总GTP的9％）的拟南芥中观察到的水平高得多。这可能是由于单细胞和多细胞生物之间的差异，或者是细胞控制ppGpp水平的能力所致。有趣的是，所有细胞系中GTP的水平非常相似，表明ppGpp积累不会影响总GTP细胞池。该结果类似于拟南芥ppGpp过度积累的情况，与革兰氏阳性细菌形成对比，其中（p）ppGpp通过减少细胞中的GTP池来调节转录。我们还检测了WT细胞中的ppGpp，并发现了导致ppGpp水平升高的条件（图S1）。在正常生长条件下，WT细胞中可检测到低ppGpp水平。这些ppGpp水平相当于总GTP的0.25％，这与拟南芥相似，在正常生长条件下ppGpp累积至总GTP的0.36％。虽然氮的剥夺不影响ppGpp水平，但延长的黑暗处理导致WT和SYN对照株系增加了4倍（图S1）。暗处理也以CRSH依赖的方式导致拟南芥中ppGpp水平增加；然而，三角褐指藻缺乏直接的CRSH直系同源物，表明在黑暗中控制（p）ppGpp合成的潜在机制存在差异。在植物中，ppGpp积累会抑制光合作用，特别是引起Rubisco丰度大幅下降，以及PSII反应中心（RC）与PSII LHC的比率大大降低，我们在本研究中获得了相似的结果（图4）。ppGpp积累也降低了光合作用的总体速率（图4），这与光合作用的各个部分中蛋白质丰度的降低相一致。PSI受到的影响不如PSII，PSI受体黄酮毒素的水平下降特别明显，而在Calvin循环中，关键的Calvin循环酶果糖二磷酸醛缩醛糖酶FBAC5的水平下降了很多。在三角褐指藻中，FBAC5与两个果糖双磷酸醛缩酶一起位于类胡萝卜素中。最后，碳酸氢盐转运蛋白的丰度降低可能会给卡尔文循环提供二氧化碳，类似于蓝细菌对ppGpp积累的反应。总而言之，这些结果表明，改变的PSII结构和降低的光合作用能力是对ppGpp积累的高度保守的反应。我们还发现ppGpp积累可能通过减缓三角藻的细胞衰老来阻止生长，防止叶绿体衰老，并阻止储备化合物的积累。ppGpp积累引起显着且持续的生长抑制（图2a），其强度明显强于植物。生长停滞伴随着单个突出LD的出现，以及TAG的轻微增加（图5-6）。突出的LD的出现可能是生长停滞后代谢超调的结果，其中CO2固定率超过要求，并且所得的碳被转移到储备化合物的合成中。在固定相中，养分变得有限，而在野生型细胞中，这会诱导存储化合物的合成和光合色素的降解。但是，我们发现ppGpp的过度积累阻止了叶绿素和类胡萝卜素的降解（图3），甚至导致叶绿素生物合成酶水平升高（表I）。存储化合物TAG和chrysolaminarin也不在过量积累ppGpp的品系中增加，我们还观察到了较高的MGDG和SQDG水平，与更稳定的叶绿体一致（图5-6）。这些结果共同表明ppGpp过度积累可防止细胞衰老并促进静止状态。ppGpp在三角褐指藻中的抗衰老作用与植物中ppGpp积累导致叶绿素水平降低，叶绿体大小减小和衰老加速的植物形成了对比。这些结果共同指出了多细胞生物体和单细胞生物体之间（p）ppGpp信号传递的根本差异（即拟南芥与三角褐指藻）。ppGpp在三角褐指藻中积累的最显着后果之一是对多种分子伴侣和蛋白酶的强诱导作用（表1）。这些蛋白质可以通过防止蛋白质聚集和错误折叠并协助变性蛋白质的重新折叠或破坏而在蛋白质保护中发挥重要作用。有趣的是，诱导的伴侣可能分布在叶绿体，细胞质和线粒体中。蛋白质量调控响应于三角藻中ppGpp积累的大量上调让人联想到绿藻和植物中的叶绿体未折叠蛋白质反应（cpUPR）。cpUPR由叶绿体中存在的错误折叠的蛋白的诱导反应，导致逆行信号和小型热休克蛋白，分子伴侣和蛋白酶的积累，因此ppGpp的积累可能会作为未折叠蛋白存在的信号，或者本身可能会导致未折叠蛋白的积累，例如通过抑制植物中的叶绿体基因表达。ppGpp积累会在多个层面上影响硅藻生理，并导致类似于细菌的严格应答静止状态，从而帮助细胞缓解应激条件（图8）。减少光合作用和生长停滞是硅藻对大多数压力的常见反应，这表明ppGpp可能在压力适应中发挥重要作用。其他对ppGpp的细胞反应，例如HSP20的急剧增加，类似于对黑暗胁迫的反应；然而，尽管有这些相似之处，但是ppGpp积累的效果与营养胁迫报告的效果明显不同，例如，在氮饥饿的情况下，叶绿素含量降低，而像TAG这样的存储分子则增加。这些比较表明，ppGpp信号传导可能是与其他适应途径协同作用的硅藻应激反应途径的重要组成部分。总之，我们的发现表明了ppGpp作为生活中不同领域叶绿体功能的基本调节剂的重要性，并引发了有关（p）ppGpp信号在光合真核生物中的分子机制和作用的新问题。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33595847/
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