编译：大师球，编辑：十九、江舜尧。

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导读

乳脂含量是评估乳品质的重要标准，是奶牛育种的主要目标特征之一。褪黑激素在调节脂质代谢中有重要作用，但褪黑激素对牛乳腺上皮细胞（BMECs）中乳脂合成的潜在影响尚不清楚。本研究表明，以10μmol/ L的褪黑激素可显著下调脂质代谢相关基因的mRNA表达，导致脂滴形成减少和甘油三酸酯积聚。褪黑素还显著上调了褪黑素受体亚型1a（MT1）的基因表达，非选择性MT1/褪黑素受体亚型1b（MT2）拮抗剂可以中和褪黑素对乳脂合成的负向调控，但选择性MT2拮抗剂不会改变褪黑激素对乳脂合成的负向调控。KEGG分析显示褪黑激素可能通过mTOR信号通路抑制乳脂合成。进一步的分析表明，褪黑素通过限制mTOR、4E-BP1和p70S6K的磷酸化来显着抑制mTOR途径的激活，而mTOR激活剂MHY1485逆转了BMECs中褪黑素对乳脂合成的抑制作用。此外，奶牛体内实验表明，外源性褪黑激素能显著降低乳脂浓度。本研究从体内、体外试验证实褪黑激素通过抑制BMEC中MT1受体抑制mTOR信号通路来抑制乳脂合成，为褪黑素调节奶牛原料乳中的脂肪含量奠定了基础。

论文ID

原名：Melatonin suppresses milk fat synthesis by inhibiting the mTOR signaling pathway via the MT1 receptor in bovine mammary epithelial cells

译名：褪黑素通过MT1受体抑制mTOR信号转导抑制奶牛乳腺细胞乳脂合成

期刊：JOURNAL OF PINEAL RESEARCH

IF: 15.221

发表时间：2019年

通讯作者：杨武才教授

通讯作者单位：西北农林科技大学动物科技学院

结果

1. 褪黑素抑制BMECs细胞乳脂合成

作者首先在BMECs细胞中进行试验，探究了不同浓度褪黑素对细胞脂滴生成的影响（图1A），油红O染色发现1 nmol/L、100 nmol/L、10 μmol/L和1 mmol/L褪黑素能显著降低BMECs脂滴生产，并导致三酰甘油（TAG）聚积减少（图1 B）。从结果看出10μM对细胞乳脂合成最明显，因此作者选择了这个浓度进行了进一步研究。结果发现，10μmol/L褪黑激素显著降低乳腺细胞PPARγ的mRNA和蛋白质表达（图1C，D）。另外，褪黑素还显著下调EBPα，FASN，C/EBPβ，FABP4，SCD1和SREBP1的mRNA水平（图1C）。

图1 不同浓度褪黑素对BMECs脂质积累及脂质合成相关基因影响。

（A）油红O染色3天后细胞图；

（B）褪黑素对TAG的影响；

（C）褪黑素对脂质合成相关基因mRNA的影响；

（D）褪黑素对脂质合成基因PPARγ蛋白的影响。

2. MT1/MT2受体对乳脂合成的调控作用

接下来作者又对褪黑素受体两个亚型进行了检测，结果发现褪黑素处理能显著下调MT1受体的基因和蛋白表达水平（图2）。BMECs细胞中加入褪黑素非选择性受体拮抗剂Luzindole可以中和褪黑素引起的EBPα，FASN，C/EBPβ，FABP4，SCD1和SREBP1 mRNA下降，同时TAG含量也发生了逆转（图3）。但是MT2特异性受体拮抗剂4P-PDOT不能起到逆转的作用（图4）。

图2 10μM褪黑激素对BMEC MT1和MT2受体mRNA和蛋白质的影响。

图3 MT1/MT2非选择性拮抗剂Luzindole逆转褪黑素对乳脂合成相关基因的抑制作用。

图4 MT2特异性受体拮抗剂4P‐PDOT不能逆转褪黑素对乳脂合成相关基因的抑制作用。

3. 褪黑素降低乳脂合成相关通路基因的表达

为了进一步揭示褪黑素对乳脂合成的机制，作者对褪黑素处理的BMEC的正常组BMEC进行了转录组学分析。结果显示褪黑素处理使6370多个基因差异表达（图5A），qRT-PCR验证发现PCK1、CAV1、DBI、ACSL6、PYURF、ABO、LDLR、ACP6、PLPP3、GC、IMPA2、ACLY和PDK1等基因显著下调，PCK1、CAV1、DBI、ACSL6、PYURF、ABO、LDLR、ACP6、PLPP3、GC、IMPA2、ACLY和PDK1等基因显著上调（图5 B、C）。

图5 差异表达基因火山图和RT-PCR验证结果

对差异基因进行GO分析，发现差异表达基因主要集中在内质网上，这是乳脂肪合成的主要部位（图6A），这些差异基因的主要生物学过程与脂质代谢有关（图7 A）。KEGG通路分析表明，PI3K-Akt信号通路，mTOR信号通路和AMPK信号通路均高度富集（图6 B）。qTR-PCR验证结果显示乳脂代谢相关基因PCK1、PYURF、LDLR、ACLY、HSD17B13、DGAT1、PYGES2和ZP3的mRNA表达显著下调（图7 B）。

图6 差异基因GO和KEGG富集分析

图7 GO富集分析结果。

(A) 47%差异基因富集在脂质代谢，20%富集在脂质合成。

(B) 脂质合成相关基因RT-PCR验证结果。

4. 褪黑素通过mTOR信号通路调节BMECs的乳脂合成

通过转录组筛选并结合已有研究，作者认为mTOR通路显著下调。通过实时验证发现褪黑激素显著下调mTOR、4E-BP1和p70S6K基因mRNA表达（图8 A）。蛋白验证发现，褪黑素能显著降低mTOR、4E-BP1和P70S6K蛋白及其磷酸化蛋白水平（图8 B）。说明了褪黑素可能通过抑制mTOR信号通路，进而影响乳脂合成。而加入mTOR特异性受体颉颃剂后能中和褪黑素对脂滴生成（图9 A）、三酰甘油（图9 B）和乳脂合成相关基因（图9 C）表达的抑制作用。

图8 褪黑素对mTOR通路相关基因和蛋白的影响

图9 MHY1485对褪黑素处理BMECs乳脂合成抑制作用的影响

5. 褪黑素对泌乳中期奶牛乳脂合成的影响

为了进一步研究褪黑素对奶牛乳脂合成的影响，作者又选取泌乳中期荷斯坦奶牛进行了体内实验，试验步骤如图10A所示。结果发现每天注射4.64 mg褪黑素能显著升高血清褪黑素含量（图10 B）。其中峰值是在注射后1h，且在注射后96 h仍高于对照组水平。同时，注射褪黑素还显著升高了血清催乳素的含量（图10C），奶牛泌乳量也稍微增加（图10 D）。研究发现褪黑素显著降低了乳脂含量（图10 E），并且与褪黑素的含量趋势相反，但对牛奶中乳糖和奶蛋白含量无影响（图10 F，G）。

图10 奶牛体内验证实验。

（A）体内试验方法；

（B）注射褪黑素后血清褪黑素浓度；

（C）血清催乳素含量；

（D）奶牛泌乳量；

（E-G）分别表示奶牛乳品中脂肪、蛋白和乳糖含量。

图11 褪黑激素在乳腺上皮细胞中作用的路径汇总图。

褪黑激素首先与MT1受体结合，然后降低mTOR的磷酸化水平。在mTOR的磷酸化水平被抑制后，4E-BP1和p70S6K的磷酸化水平也被下调。最后，褪黑激素治疗BMEC后牛奶脂肪合成减少。

总结

在本研究中，作者先在体外发现了褪黑素对乳脂合成有抑制作用，进一步通过转录组学分析发现并探讨了褪黑素对乳脂合成抑制作用的机制。然后再用体内实验进一步证实褪黑激素通过抑制BMEC中MT1受体抑制mTOR信号通路来抑制乳脂合成，为褪黑素调节奶牛原料乳中的脂肪含量奠定了基础。

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