编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：MicroRNAs in Asthma and Respiratory Infections: Identifying Common Pathways
译名：哮喘和呼吸道感染中的MicroRNA：确定常见途径
期刊：Allergy Asthma & Immunology Research
IF：5.026
发表时间：2019.9（提前在线发布）
通讯作者：Nikolaos G. Papadopoulos
通讯作者单位：希腊雅典国立和卡波德斯第安大学第二儿科诊所过敏和临床免疫学部门；英国曼彻斯特大学感染、炎症和呼吸内科。
DOI号：doi.org/10.4168/aair.2020.12.1.4
综述内容
MicroRNA（miR）是一类由18-25个核苷酸组成的非编码RNA，在转录后水平上动态调控基因网络的表达，在各种生物过程（例如细胞信号传导、生化途径、组织和器官发育等）中发挥关键作用，免疫细胞的固有功能及其对病原性刺激的增殖也受miRs的调节。根据位置可以将miR分为细胞内和细胞外两种。细胞内miRs的表达具有组织和疾病特异性模式，因此已作为预后和诊断的生物标志物被广泛的研究。细胞外miRs（ex-miRs，循环miR）存在于细胞外囊泡中（外泌体、微泡和凋亡小体），可以稳定存在于多种细胞外体液，并且可以在多种细胞之间转移。
随着人们对miR靶标及其调控机制的深入研究，发现miR在调节正常细胞功能中的重要作用。其中在上皮细胞中miR发挥关键的调控作用，例如调节细胞分化、细胞周期、免疫应答、炎症反应、信号通路的激活。许多综述对miR在正常肺发育和呼吸系统疾病中的作用进行了总结，包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、特发性肺纤维化和肺癌。
正常肺组织和哮喘患者的组织中miR谱存在显著差异，表明miR在哮喘的发病起到了调控作用。哮喘是一种异质性疾病，涉及许多细胞类型，例如肺泡巨噬细胞、平滑肌细胞、先天性淋巴样细胞、上皮细胞和肥大细胞，因此难以辨别其潜在的分子机制。在哮喘表型中观察到相似的异质性，因此有时哮喘与正常上皮细胞中miR的研究结果有时是矛盾的。
病毒性急性呼吸道感染（ARIs）是急性呼吸道症状的最常见原因，其中许多感染与哮喘发作有关，其miR的表达差异调控机体免疫反应。因此上皮细胞miRs的差异表达谱可能有助于进一步了解急性和慢性呼吸系统疾病的发病机制，同时也可以作为病毒性ARI的治疗靶标及生物标志物。
本文总结了有关miR在哮喘中的表达和功能，及其在病毒性ARIs中的调节作用的最新发现。根据细胞组织特异性，进一步分为上皮细胞（细胞系、鼻或支气管上皮细胞、鼻腔洗出液、支气管灌洗液和痰液）和外周血单核细胞（PBMC）等不同部分进行综述。同时根据哮喘的严重程度（轻度、中度和重度）区分miR谱，突出了该疾病的异质性。在此基础上鉴定了可能与呼吸道主要病毒（RV，RSV和IFV）诱发的哮喘急性发作有关的miR。最后，文章将哮喘患者的miR图谱与ARIs诱导的miR图谱关联，尝试发现哮喘患者是否可能缺乏特定的miR，使他们对ARIs更易感和/或更具反应性。
2 轻度哮喘患者上皮细胞miR表达谱
与健康对照相比，轻度哮喘患者的支气管上皮已显示出miR的表达差异，这与炎症途径、上皮形成和上皮稳态有关（表1）。
与健康人相比，轻度哮喘患者的原代支气管上皮细胞中miR-let-7f、miR-181c和miR-487b的表达增加，但miR-203的表达下降，预测这些miR的靶标主要参与调节炎症途径相关基因的表达。miR-let-7抑制IL-13表达，在动物模型中miR-let-7抑制细胞因子的产生并使哮喘症状减轻。在哮喘患者的鼻腔活检样本中发现该家族的miRs（miR-let-7和miR-let-7e）下调。miR-181家族成员在哮喘患者中表达存在差异：miR-181b-5p与嗜酸性粒细胞性哮喘负相关，而miR-181b靶向SPP1，后者又调节IL-13诱导的促炎细胞因子IL1B和CCL11的表达。此外，哮喘细胞中miR-203显著下调，预测靶标是水通道蛋白基因AQP4，但是在轻度和中度哮喘患者的支气管活检样本中miR-203a上调，通过抑制转录因子MEF2C导致细胞增殖减少。此外miR-3065-3p上调可能会抑制细胞膜锚定蛋白MDGA1，从而抑制细胞粘附。miR与靶位点基因的异常在哮喘的支气管上皮稳态中发挥重要作用。
对哮喘患者气道上皮细胞的全基因组分析研究发现，miR-34/449家族的4个成员（miR-34b-5p，miR-34c-5p，miR-449a和miR-449b-5p）与上皮细胞增殖和分化的调节密切相关，在哮喘患者中表达明显受到抑制。具体而言，miR-449通过靶向Notch信号通路的NOTCH1，miR-449水平降低导致产生更多的粘液。
miR-155与哮喘反复发生相关，并参与过敏性炎症调节。与健康对照相比，哮喘患者的鼻腔活检样本miR-155的表达下调。miR-155在宿主防御和免疫反应中起着重要作用，重度哮喘患者及过敏引发的哮喘患者血浆中miR-155水平升高。
3 重度哮喘患者上皮细胞miR表达谱
轻度哮喘患者支气管上皮细胞受损，无法增殖和修复，而重度哮喘患者表现为上皮细胞高度增殖且较厚，与哮喘严重程度有关的miRs表达谱也存在差异。
与轻度哮喘患者和健康对照组的细胞相比，重度哮喘患者的上皮细胞中miR-19a的表达水平更高，而且糖皮质激素不能恢复其表达水平。miR-19a通过靶向TGF-β受体2的mRNA来增强重度哮喘中支气管上皮细胞的细胞增殖。抑制miR-19a的表达导致SMAD3磷酸化程度增加，抑制细胞增殖。
与健康对照相比，重度哮喘患者的支气管上皮细胞中miR-221表达水平显著增加，通过靶向SIRT1的mRNA，参与支气管上皮损伤。此外，嗜酸性粒细胞性哮喘患者miR-221-3p增加，通过p38 MAPK途径抑制抗炎细胞因子（C-X-C基序）配体17（CXCL17）的表达并增强CCL24、CCL26和POSTN的表达。
中度和重度哮喘患者的支气管肺泡灌洗显示，与健康对照组相比，哮喘患者的miR-200b和miR-200c水平显著降低，其靶位点是IL-33 mRNA 3'UTR，miR-200b和miR-200c通过调节IL-33的表达在哮喘中发挥作用。
轻度哮喘中表达水平增加的miR-let-7a，在重度哮喘患者的支气管活检样本中显示表达水平的下降。差异表达的miR涉及的相关途径是JAK-STAT信号传导、细胞因子/趋化因子信号传导途径、纤毛细胞分化、细胞增殖、CD4 +Th2细胞活化和细胞粘附分子途径（表1）。值得一提的是哮喘上皮细胞中许多上述差异表达的miRs直接或间接与IL-13通路有关。IL-13通路是一种多效性Th2细胞因子，是哮喘发病的关键。总之，miRs在不同严重程度哮喘中表达模式不同，可能是支气管上皮慢性炎症的标志物，用于表型诊断。
4 哮喘病人外周血单核细胞（PBMC）的miR表达谱
来源于外周血的细胞包括过敏性炎症和哮喘中的关键细胞成分。哮喘患者和健康对照之间PBMC的miRs的表达模式（表2）发现支气管哮喘患者中中间型单核细胞CD14 +和CD16+增加，同时miR-124表达水平增加。miR-124调节M2极化，当在哮喘巨噬细胞中的过表达miR-124导致许多M1标志物下调（如MHC II和CD86）和M2标志物上调（如MHC）。在另一项研究中，与健康对照组相比，哮喘患者CD4+T细胞的miR-145被上调，RUNX3表达受到抑制。与健康对照组相比，哮喘儿童中miR-221和miR-485-3p的上调并导致Spred-2表达下调。未使用类固醇和使用类固醇的哮喘患者支气管肺泡灌洗液PBMC的CD4+T细胞的miR-19a均上调，通过靶向肌醇磷酸酶PTEN、信号抑制因子SOCS1和去泛素化酶A20，miR-19a促进了TH2细胞因子的产生及放大。
支气管哮喘患者PBMC的IL-22和IL-17阳性的T细胞与健康对照相比，检测到miR-323-3p表达水平增加，miR-93、miR-181a、miR-26a和miR-874的表达水平降低。表明miRs可能在T细胞的增殖、分化和效应子功能中起作用。小儿特应性哮喘患者CD4+ T细胞的miR-15a、miR-15b、miR-20a下调，这些miR可以结合在VEGFA的3'UTR，下调导致其靶基因表达水平有所升高。来自轻度哮喘患者的支气管活检样本中的T细胞miR-125b、miR-19a、miR-19b和miR-106b表达水平降低。
此外，发现尘螨引起的哮喘患儿与对照组相比，有3种新的miR：miR-22-3p、miR-513a-5p和miR-625-5p明显下调，从而导致调控调控靶点的转录水平有所增加，包括Cbl原癌基因、E3泛素蛋白连接酶（CBL）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ，共激活因子1 beta（PPARGC1B）和雌激素受体1（ESR1）。在另一项研究中，尘螨-过敏性哮喘患者的CD4+T细胞中miR-155上调，与TH2细胞因子（IL-5和IL-13）的表达呈正相关，并被糖皮质激素抑制。已经表明，miR-21-5p在对尘螨敏感的哮喘患者（HDM）的PBMC中上调。
5 急性和重度哮喘患者PBMC的miR表达谱
在急性哮喘患儿的PBMC中，循环miR-126、白介素IL-4和Th17细胞百分比明显高于对照组，而iIFN-γ水平和CD4+CD25+调节性T细胞则明显降低。在另一项急性哮喘研究中，miR-192被下调，并且通过靶向CXCR5阻断滤泡辅助性T细胞的激活途径。miR-28-5p、miR-146a、miR-146b已被证明在与循环CD8 +T细胞活化相关的严重哮喘中被下调，但与CD4 +T细胞活化无关。
在最近的研究中发现哮喘患者被下调的miR-29c与上调的血浆B7-H3分子相关。miR-29c调节Th2/Th17细胞分化，并且巨噬细胞抑制miR-29c表达可以导致共培养的CD4+T细胞中ROR-γt和GATA-3的表达增加，同时IL-4和IL-17的水平增加。
总体而言，miR在哮喘患者PBMC中差异表达，并且似乎参与了基本的过敏性炎症和免疫反应途径（表2），可以促进Th2细胞因子产生和调节单核细胞各个亚群中M2极化中的作用。
表2：哮喘患者PBMC中miRs上调和下调与健康对照比较
6 由病毒导致的支气管上皮细胞miR
ARIs是急性呼吸道症状的最常见原因，这些感染与慢性呼吸道疾病（尤其是哮喘）的症状加重有关。宿主固有的免疫应答是针对所有病原体的第一道防线，包括上皮细胞、树突状细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，在控制感染中起着不同的作用。在病毒感染期间会诱导miR调节各种细胞的功能（表3），这方面的研究可以用于抗病毒治疗。
6.1人鼻病毒RV
RV是儿童和成人上呼吸道感染的主要原因，主要感染呼吸道的上皮细胞。RV是带有二十面体衣壳的单链RNA病毒，属于Picornaviridae家族。生物信息学预测miR-128和miR-155靶向RV基因组，可能调节RV1B的先天免疫应答。这些miR的沉默可使RV复制增加50％。来自RV感染儿童洗鼻液的分泌性miRs中的miR-630、miR-302d-3p、miR-320e和miR-612差异表达。miR-23b间接通过下调LPR5和VLDLR跨膜受体表达来参与RV的免疫应答。
6.2呼吸道合胞病毒RSV
RSV属于副粘病毒科病毒，是一种常见的人类病原体，其症状与感冒的症状相似。RSV感染导致人气管上皮细胞（HBEC）培养物和HEp2细胞系中的miR-221表达下调。RSV通过沉默miR-221的表达来上调NGF-TrKA轴，并促进病毒复制。
其他研究已确定RSV至少以2种不同方式诱导miR表达。首先，在人单核细胞来源的树突状细胞（MDDC）和HBEC中，IFN-β诱导miR-let-7b和miR-let-7i的表达。其次，在HBEC感染RSV 48小时后，miR-30b和miR-let-7i的表达依赖于NF-κB的表达。在另一项研究中，有证据表明RSV的组成蛋白G蛋白导致miR-let-7f表达增加。
在RSV感染期间miR-27a、miR-339-5p、miR-453和miR-574也出现表达水平增加的现象。miR-29a可以直接靶向IFNAR1 3'UTR，并抑制IFNAR1的表达，而RSV的组成蛋白NS1在人肺腺癌细胞系A549中抑制IFNAR1的表达，这表明，在RSV感染期间miR-29a上调负调控IFNAR1，对于NS1诱导的病毒复制至关重要。而且NS1与KLF6相互作用并调节miR-24的表达和TGF-β，从而促进RSV复制。miR-124a、miR-542-5p、miR-744、miR-155、miR-346、miR-452、miR-128a和miR-28表现为RSV中表达量降低。其中，miR-155参与了调节先天免疫力，增强IFN诱导型基因表达的。
尽管miR具有抗病毒特性，但还有其他miR可以抑制病毒感染但不刺激干扰素反应。在RSV感染中p38 MAPK抑制剂导致RSV复制显着减少，有研究针对RSV感染中MK2的潜在抗病毒特性进行了分析，以确定是否该途径可能是miR-744、miR-124a和miR-24的抗病毒作用的原因。
6.3流感病毒IFV
IFV是属于正粘病毒科的单链RNA病毒，其中A型病毒（甲型流感病毒/IFV-A）根据其表面上存在的2种蛋白质血凝素（H）和神经氨酸酶（N）进行分类。目前已知有16种不同类型的血凝素和9种神经氨酸酶，流行程度最高的亚型是甲型流感（H1N1或H3N2）和乙型流感。
IFV-A感染后miR的表达谱由于菌株、细胞系类型、感染时间点或实验程序的不同而有所差异（表3）。一项有趣的研究比较了暴露后4个时间点（3、6、8和24小时）感染2种不同的IFV-A株（H1N1和H5N1）后的miR谱，发现H1N1感染的诱导程度远低于H5N1感染，此外时间点之间也存在许多差异。感染后3小时，感染H5亚型与未感染相比miR-141、miR-181c、miR-210、miR29b、miR-324-5p和miR-663上调；而H1亚型只有miR-141被轻微诱导。显然，H5N1诱导的miR-141比H1N1诱导的抑制细胞因子转化生长因子（TGF-β2）表达的能力更强。可以推测，不同的流感亚型通过miR-141调节TGF-β2表达可能是确定炎症进展的关键。
两项独立研究发现miR-146a在流感感染中的功能。第一项研究在被H1N1或H3N2感染的A549细胞中发现唯一上调miR是miR-146a，相关的生物学过程包括：Toll样受体（TLR）途径、先天免疫应答、细胞因子产生和凋亡。抑制miR-146a可以显著增加病毒的繁殖。第二项研究发现miR-146a可以通过抑制IFNB和IFN刺激基因（ISG）的表达来降低I型干扰素反应。另一个重要发现是miR-146a直接靶向肿瘤坏死因子受体缔合因子6（TRAF6）。体内抑制miR-146a可通过促进I型抗病毒活性减轻IFV诱导的小鼠肺损伤并提高存活率。总之，miR-146a通过抑制其靶基因TRAF6增强I型IFN的应答来抑制IFV复制，可能是潜在的治疗靶标。
综上所述，miR可以直接结合病毒，也可以通过调节抗炎途径（NF-κB、干扰素、TGF-β和TLR途径）间接发挥作用。而且不同的呼吸道病毒（RV、RSV和IFV）在上皮细胞中诱导了不同的miR谱。
7 由病毒导致的PBMCS的miR表达谱
RSV感染患儿的PBMC显示miR-26b表达增加和TLR4 mRNA水平降低。进一步体外试验证实，RSV感染通过上调miR-26b抑制TLR4信号传导，这为预防和治疗RSV感染提供了潜在的治疗靶点。RSV感染患儿的全血样本中发现miR-106b-5p、miR-20b-5p和miR-342-3p上调，而miR-320e、miR-320d、miR-877-5p、miR-122-5p和miR-92b-5p下调。通路分析表明miR失调参与了炎症和免疫反应，包括Wnt、TGF-β、胰岛素以及T细胞和B细胞受体信号传导。
miR-650作为一种新型模式识别受体反应性miR，在刺激初级MDDC时被下调，与IFV相关。通过生物信息、转录谱和报告基因分析发现miR-650调节包括IFIT2和MXA在内的典型干扰素刺激基因。
miR-451a在人血清细胞外囊泡中富集，影响巨噬细胞和树突状细胞对灭活流感全病毒疫苗的先天免疫反应。另一项研究证明，在感染H1N1和H5N1 1、3和6小时后，在人类巨噬细胞中miR-26b下调。感染6小时后，H1N1感染导致miR-3123上调而H5N1感染导致miR-3123下调。人类巨噬细胞中miR-342-5p与抗病毒IFN偶联，通过IFN诱导的转录因子IRF1产生应答。研究表明miR-342-5p通过多种机制实现对甲羟戊酸-甾醇生物合成的抑制，包括SREBF2的转录水平、miR-33的转录后水平、IDI1和SC4MOL酶促水平。同时证明miR-342-5p对多种病毒（例如巨细胞病毒和H1N1）具有广泛的抗病毒作用。
迄今为止，由PBMC（或不同亚群）诱导的miR的研究还很有限，已证明的PBMC由RSV和IFV感染诱导的miR涉及炎症和免疫反应途径的调节（表4）。需要进一步的研究来阐明miR在这些细胞群体中的作用。
结论
迄今为止，只有两篇报道研究了病毒感染后哮喘患者中miR的差异表达模式。其中证实单链RNA病毒通过模式识别受体TLR7降低重度哮喘的肺泡巨噬细胞中miR-150、miR-152和miR-375的表达。许多研究表明miR-20a、132和22表达模式不受哮喘的影响，但是有研究证实H1N1感染24小时后，哮喘患者miR-22表达发生变化。本文总结了可能与病毒诱发的哮喘有关的几种miR，发现病毒感染后许多miR升高或积极参与先天免疫，而且在哮喘患者中表达显著降低（表5）。
本文对不同程度的哮喘及与病毒感染相关的miR差异表达谱进行了综述，而对其深入的研究不仅可以揭示易感性的生物标志物，还可以表征哮喘先天性免疫应答不足的机制。此外，miR相关功能性实验分析可以在临床试验开始之前评估合适的候选药物，用于临床前毒性和药代动力学研究。深入研究可以为不同哮喘患者选择合适的靶向治疗方法提供依据，从而为针对慢性疾病（例如哮喘）的个性化或精密医学的发展奠定基础。
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