科研 | 中国药科大学：转录组学和代谢组学揭示了Dictamnine诱导小鼠肝中毒的代谢途径

编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。

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导读

白鲜皮（Dictamni Cortex，DC）是一种常用的中草药。最近，人们对DC及其制剂的肝毒性风险认识提高，中国食品药品监督管理局发布了有关含DC制剂的几项药物不良反应报告。白藜芦碱（DTN）是DC中的一种主要的呋喹啉生物碱，被怀疑与DC相关的肝损伤有关。以往的研究主要集中在遗传毒性、药代动力学和DTN的代谢，但对其潜在的肝毒性的关注较少。以往研究发现，急性暴露于640 mg/kg DTN引起肝毒性，伴有肝细胞变性（水肿和脂肪变性）甚至肝细胞坏死的症状。此外，DTN可通过细胞膜和线粒体膜损伤机制而发生细胞毒作用。然而，这一假设机制仍然缺乏足够的证据。因此，迫切需要更好地了解DTN诱导的肝毒性的分子机制，并进一步分析相关的关键途径。

生物标志物和潜在的毒性关键基因的发现在代谢产物和基因分析中有越来越广泛的兴趣，这是目前与疾病筛查、毒理学和安全性评估相关的一个活跃的研究领域。同时，系统生物学方法，包括转录组学，代谢组学，和蛋白质组学，正越来越多地应用于预测药物诱导的肝毒性的发展，发现新的生物标志物的疾病，并获得对生物过程和毒性机制的更深入的理解。此外，基因表达谱与代谢谱的整合被证明是揭示代谢途径复杂调控网络的一种创新方法。例如，转录组学和代谢组学的整合已经应用于脂肪肝疾病的研究，肝脏再生，肝毒性机制，癌症生物标记，糖尿病。重要的是，这种组合分析有助于了解药物毒性的剂量相关生化后果。

在本研究中，研究者评估了不同给药情况对小鼠肝组织的生化分析和组织病理学变化，以及完整的转录组学和代谢组学特征。这项发现提供了深入了解DTN诱导的急性肝毒性研究，并强调使用系统生物学的方法揭示潜在的代谢途径和毒理机制的好处。

白藜芦碱（DTN）可引起肝毒性。然而，其潜在机制尚不清楚。本研究首次利用整合转录组学和代谢组学结合一般毒性评价来描述DTN诱导的小鼠肝毒性的潜在分子机制。研究发现，急性暴露于高剂量DTN可引起肝细胞损伤，其生化指标、基因和代谢产物的变化更大。基因表达和代谢物谱比一般毒性研究更敏感，用于检测早期肝毒性。综合分析表明，氧化损伤、ABC转运蛋白和脂质代谢与DTN引起的肝毒性密切相关。总的来说，研究结果提供了导致DTN诱导的肝毒性的机制的见解。

论文ID

原名：Integration of transcriptomics and metabolomics profifiling reveals the metabolic pathways affffected in dictamnine-induced hepatotoxicity in mice

译名：转录组学和代谢组学揭示了Dictamnine诱导小鼠肝中毒的代谢途径

期刊：Journal of Proteomics

IF：3.537

发表时间：2019.12.5

通讯作者：李会军教授

通讯作者单位：中国药科大学

DOI号：10.1016/j.jprot.2019.103603

实验设计

在本研究中，采用体重18-22g雄性成年小鼠，让小鼠在自然光/暗循环和控制温度和湿度（分别为22±2°C和55±5%）的环境中自由获得食物和水。实验前禁食12h，自由饮水。1周后，将小鼠随机分为3组（n=10），每组小鼠分别灌胃给予4或640 mg/kg DTN（溶于0.5%CMC-n a）和溶媒。给药后24小时经眼后静脉采血。在室温下凝固后，样品在4°C、1000×g下离心10分钟。分析前，将获得的血清储存在-80°C下。左侧肝叶用于组织病理学评估，剩余肝组织在液氮中快速淬火，然后在分析前储存在-80°C。随后采用罗氏Cobas 8000型全自动生化分析仪（ISE/701/701/502）对丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）和血尿素氮（BUN）进行分析。提取制备肝组织提取物进行基于液相色谱-串联质谱（LC-MS）的代谢组学分析。最后进行综合分析和验证。

结果

1 生化和组织病理学评价

在小鼠口服单剂量4或640mg/kg DTN后，测定肝脏疾病常用的生物标志物（ALT、AST、ALP、TBIL、TBA和BUN活性）。如图1A所示，与对照组相比，640mg/kg DTN显著升高ALT和AST活性（ALT分别为166.9和40.9u/L；AST分别为270.5和190.7u/L）。但低、高剂量组的ALP活性、TBA、TBIL和BUN浓度与对照组相比无明显变化。同时，4mg/kg组的这些参数没有明显的生理意义。此外，典型的组织病理学评价如图1B所示。与对照组相比，4mg/kg和640mg/kg组分别观察到轻度肝细胞变性（水肿和脂肪变性）和中度肝细胞变性。640mg/kg组大鼠肝脏出现点状坏死和肝窦充血，伴有炎性细胞浸润。总的来说，结果表明，DTN诱导的肝损伤可能发生在较高剂量的小鼠在一般毒性评价的基础上。

图1 DTN对小鼠血清生化指标（A）的影响及不同组小鼠肝组织组织学检查的显微照片

2 DEG识别与选择

通过对实验小鼠肝组织的RNA序列分析，对差异表达基因（DEGs）的转录本进行了鉴定。用A | fold change |>2和p值<.01筛选DEGs。结果显示，DTN处理组和对照组之间存在明显差异，这些差异在火山图和热图（图2）中显示。DEGs的总体分布可以在火山图中看到（图2A、B和C）。与对照组相比，4mg/kg DTN可显著改变207个基因集。此外，640mg/kg组中1596个基因与对照组相比差异表达，602个基因上调，994个基因下调（表S2、S3）。此外，层次聚类分析表明，4mg/kg组的基因表达模式与640mg/kg组不同，后者与对照组的基因表达模式相似且更接近。结果符合一般毒性评价结果（图2D）。

图2 不同组小鼠肝组织中不同表达基因（DEGs）的分析

绘制Venn图以显示不同比较中的DEGs数量（图3）。两个处理组共有114个基因重叠，代表了可能导致DTN治疗的不良反应的基因。然而，因为只有高剂量的DTN才导致肝损伤，研究者认为只有在高剂量组与对照组、高剂量组与低剂量组中差异表达的基因，以及在所有组比较中消除的DEGs（总共263 DEGs）才可能是DTN肝毒性发生的潜在原因。

图3不同组间比较中显著富集DEGs的Venn图代表了DEGs的唯一性和重叠性

3 DEGs基因注释与功能分类

GO和KEGG数据库用于对DEG函数进行注释和分类。GO通路分析的重点是DTN处理组与对照组相比受显著影响的基因。与对照组相比，640mg/kg组的DEGs显著改变，在与小分子分解代谢过程、有机酸分解代谢过程和脂肪酸代谢过程相关的几个主要代谢途径中进行了功能注释。此外，与4mg/kg组相比，采用GO分析的640mg/kg组的DEGs变化主要与类固醇代谢过程有关，可能最与DTN高剂量如何诱发肝损伤的机制有关。

KEGG数据库被用来获得更多关于DEGs生物学功能和途径的知识。用640 mg/kg DTN处理的小鼠DEGS被映射到PPAR信号通路、外源性细胞色素P450代谢、药物代谢其他酶、脂肪酸代谢、脂肪酸降解、类固醇激素生物合成和原发性胆汁酸生物合成。这些通路与低剂量组鉴定的通路不同，提示这些途径可能在DTN诱导的肝毒性的发展中起主导作用。

4 肝组织代谢谱

肝脏样品的典型总离子色谱图（TICs）如图S1所示。QC样本用于评估分析方法的稳定性，并首先通过相关分析和无监督统计（PCA得分图）对QC样本进行聚类评估。高相关系数（图4A）和主要QC样本组（图4B）相对紧密的聚类表明数据是有意义的。根据离子的峰值强度和保留时间进行更详细的评估。可接受<30%的变异系数（图4C）。用PCA评分图评估不同组的代谢组学特征，显示640 mg/kg DTN组和对照组之间以及4 mg/kg DTN组和对照组之间的良好分离（图4B）。根据主成分分析，可以清楚地识别肝脏中DTN的不同剂量。类似地，640 mg/kg、4 mg/kg和对照组之间的差异是明显的，低剂量组的差异代谢物分布相对离散（图4D）。

图4 口服DTN后对不同组肝组织代谢影响的LC-MS光谱数据

此外，还构建了一个三分量PLS-DA模型（图5A、B）。模型的质量由参数Q2和R2进行评估，其中Q2表示模型的可预测性，R2表示模型的拟合优度。大于0.5和0.9的Q2分别被认为是好的和优秀的，相对相似的R2和Q2值被认为是好的。R2Y（0.99高剂量组与对照组；0.98低剂量组与对照组）和Q2（0.95高剂量组与对照组；0.71低剂量组与对照组）的值在每次比较中都是可接受的，这表明模型具有良好的预测性。通过7倍交叉验证和排列试验对模型的预测性能进行了评估，低、高剂量组与对照组均明显分离。

图5 肝组织的代谢曲线由口服DTN后不同代谢物的PLS-D A评分图（A和B）和聚类热图（C和D）描述

根据PLS-DA模型中VIP>1和Student t检验中p<0.05的标准，分别在4mg/kg组和640mg/kg组中鉴定出41种和90种差异代谢物。其中，低剂量组和高剂量组有20种和33种代谢产物上调，低剂量组和高剂量组分别有21种和57种代谢产物下调（图5C、D和S3）。这些化合物包括氨基酸（谷胱甘肽、胱氨酰甘氨酸）、甾体（磺胆碱基甘氨酸、钙化酸、牛磺胆酸）、脂质[半乳糖甘油、溶菌剂（0:0/22:6（4Z、7Z、10Z、13Z、16Z、19Z））]和脂肪酸（十八酸）。这些化合物在肝脏受到强烈影响。

5 肝脏GSH、SOD、MDA、GSH-Px和ROS水平的测定

由于GSH水平在代谢组学分析中的显著上调，以及GSH在维持细胞氧化还原平衡和保护氧化应激损伤中的重要作用，测量了肝脏GSH浓度和与抗氧化（SOD、MDA和GSH-Px）相关的指标。肝组织正常化至相同蛋白浓度后，DTN组肝组织GSH、GSH-Px活性、SOD和MDA含量显著升高，4mg/kg组无明显变化。GSH浓度（高剂量组为1.29±0.36，对照组为0.32±0.11μmol/mg蛋白质）高出3倍（图6A），这与代谢组学数据一致，显示640mg/kg组GSH水平较高。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）活性是互补的，分别反映了清除氧自由基的活性和氧自由基损伤细胞膜的程度。如图6B和C所示，GSH-Px（高剂量组和对照组分别为324.00±14.99和292.49±13.74u/mg）和SOD（高剂量组和对照组分别为286.38±17.76和248.68±18.76u/mg）的增加表明了DTN诱导的损伤的潜在保护作用。此外，640 mg/kg组MDA活性显著高于对照组（0.49±0.052 vs 0.35±0.057）（图6D），揭示DTN暴露后氧化应激损伤。此外，与对照组相比，高剂量组的ROS水平显著降低，但在低剂量组中没有变化，表明在640 mg/kg DTN暴露下，氧化应激的不平衡（图6E）。同时，生化指标显示DTN诱导的损伤中氧化损伤的作用。

图6 对照组、低剂量组和高剂量组肝脏GSH浓度（A）、GSH-Px活性（B）、SOD活性（C）、MDA浓度（D）和ROS水平。

6 mRNA和蛋白质表达变化的验证

在整合分析的基础上，随机选取11个与药物代谢有关的基因，即胆汁分泌、ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢和脂肪酸代谢为代表，进行Q-PCR验证。总的来说，Q-PCR分析的大多数基因的表达与RNA-Seq的结果有很高的一致性。与对照组（图7）相比，640 mg/kg DTN暴露后，各种基因发生了显著变化，包括MRP3（多药耐药蛋白3，也称为ABCC3，属于ATP结合盒ABC转运蛋白亚家族，增加了12倍）、MRP4（ABCC4，增加了6倍）、Slc10a1（NTCP，Na/牛磺胆酸共转运多肽，增加1.7倍，Slc1a4（溶质载体家族1（谷氨酸/中性氨基酸转运体），成员4，增加22倍），Mup12（主要尿蛋白12，减少5倍），Lipc（编码肝脂肪酶，增加1.2倍），Idh2（异柠檬酸脱氢酶2，增加1.2倍），UGT1A9（UDP葡萄糖醛酸转移酶1个家族，多肽A9，＜1.7倍），CYP2D9（细胞色素P450，家族2，亚科d，多肽9，＞2.8倍），CYP2E1（细胞色素P450，家族2，亚科d，多肽9，＞1.1倍）。一个与细胞迁移和侵袭有关的基因Nedd9上调了5倍。

图7 Q-PCR法检测640mg/kg DTN处理后相关基因mRNA表达水平

综合分析表明，肝内胆汁酸代谢、脂质代谢紊乱和药物代谢酶紊乱与肝毒性有关。如图8所示，通过western blot分析评估关键基因在小鼠肝脏中的蛋白表达。结果显示，与对照组相比，640mg/kg DTN组小鼠肝脏中重要胆汁酸转运蛋白NTCP和MRP4的表达显著上调，而4mg/kg组小鼠肝脏中这些基因的表达显著下调。此外，高剂量组Lipc和UGT1A9蛋白表达显著上调。Western blot分析显示Slc2A9、UGT3A2和CYP2E1水平无明显变化。

图8 不同表达基因的Western blot分析

结论

综上所述，急性暴露于大剂量DTN诱导的小鼠肝细胞型肝损伤。对DTN治疗后的生化指标、组织病理学、基因表达和代谢物的变化进行综合分析，以了解毒性机制。结果表明，ABC转运蛋白、氧化损伤和脂质代谢紊乱是640 mg/kg DTN诱导的肝损伤的关键过程。具体而言，与胆汁酸转运相关的MRP3、MRP4和NTCP基因的表达改变；与氧化损伤相关的IDH2和NEDD9；以及与脂质代谢相关的MUP12和LIPC基因。此外，CYP2E1和UGT1A9可能与损伤有关。基因表达和代谢物谱比一般毒性研究更敏感，以检测由DTN诱导的早期肝毒性。然而，这些途径中的关键基因是如何影响新陈代谢的还没有被深入研究。进一步的研究应集中在探索线粒体诱导的氧化损伤和胆汁分泌和运输途径的详细机制。

本研究报道了白鲜皮中主要的呋喃喹啉类生物碱白藜芦碱（DTN）引起的肝毒性的机制。采用小鼠肝脏转录组学和代谢组学的综合分析，结合血清生化和组织病理学评价，探讨其可能的机制。结果表明，640mg/kg DTN能显著提高血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平，诱导细胞严重变性，4mg/kg DTN无明显变化。综合分析表明，外源性细胞色素P450代谢、药物代谢、其他酶、胆汁分泌和谷胱甘肽代谢是DTN诱导肝毒性的主要代谢途径。值得注意的是，640 mg/kg DTN暴露增加了肝脏GSH、GSH peroxidase、超氧化物歧化酶和丙二醛，并降低了ROS，同时改变了IDH2和NEDD9的表达。通过PCR和Western blot方法，验证了Mup12、Lipc、NTCP、MRP3、MRP4、CYP2E1、CYP2D9和UGT1A9等具有代表性的基因。总的来说，转录组学和代谢组学分析的组合策略有助于更好地理解代谢途径的发现，氧化损伤、ABC转运蛋白和脂质代谢可能是DTN诱导的小鼠肝毒性的机制。

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