编译：卡德加，编辑：十九、江舜尧。
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导读哺乳动物基因的RNA转录物的加工过程在其转录位置附近进行。该研究中，科研人员发现了一种影响成千上万个基因的现象，称之为外显子介导的转录起始激活（exon-mediated activation of transcription starts，EMATS），其中内部外显子的剪接会影响启动子选择和基因表达水平。研究者观察到：内部外显子的进化增益与附近新的转录起始位点（transcription start site，TSS）的获得和基因表达的增加有关；抑制外显子剪接减少了附近启动子的转录，新剪接外显子的产生激活了沉默启动子的转录；对位于有效剪接外显子近端和上游的弱启动子，产生的作用最强。研究者的发现支持了一个模型，其中剪接招募转录机制局部影响TSS选择，并确定外显子的获得、丢失和调控变化是哺乳动物中选择性启动子和基因表达进化的主要因素。原名：Exon-Mediated Activation of Transcription Starts
译名：外显子介导的转录起始激活
期刊：Cell
IF：36.216
发表时间：2019.12
通讯作者：Christopher B. Burge
通讯作者单位：剑桥大学麻省理工学院生物系
DOI号：10.1016/j.cell.2019.11.002
哺乳动物基因的RNA转录本在合成后几秒或几分钟内被处理，为转录和剪接之间的功能连接提供了机会。剪接和转录之间的几个联系是已知的，转录速率和染色质结构都会影响剪接的结果。然而，最近的证据表明，剪接也反馈到转录。在无内含子的基因中加入内含子通常会促进植物、动物和真菌的基因表达；虽然这些机制还没有被完全理解，但是已经报道了它们对转录、核输出、mRNA稳定性和/或翻译的影响。剪接可以影响转录延伸率，在酵母中，内含子的存在可以产生与剪接前小体形成相关的转录检查点。此外，剪接体复合物的募集可以通过增强起始前复合物装配来刺激转录起始，抑制剪接则可降低H3K4me3水平，这一与活跃转录相关的染色质标记。剪切机制的几个组成与RNA聚合酶II (RNAPII)和其他转录机制相关。U1和U2小核核糖核蛋白颗粒(snRNPs)与一般转录因子(GTFs) TFIIH/GTF2H1，TFIIF/GTF2F2和RNAPII的羧基末端域(CTD)相关。除了在剪接中的作用外，U1 snRNP还作为一种普遍的抑制因子，抑制近端下游的过早卵裂和聚腺苷酸(PCPA)位点。来自启动子反义方向上游的U1 snRNP结合位点的相对丰度有助于PCPA位点的反义转录的频繁终止，产生短而不稳定的转录本。转录起始点和终止点是人类组织间转录亚型差异的主要来源。最近对全长mRNA的分析表明转录开始和剪接可能是协调的。然而，外显子剪接是否普遍影响转录起始位点(TSS)的位置和活性仍不清楚。本研究中，研究者描述了一种现象，称之为外显子介导的转录启动(EMATS)，在这种现象中，内部外显子的剪接，尤其是那些位于基因5’末端附近的外显子，通过激活附近的TSSs来改变基因表达，从而促进成千上万个基因的表达调节。外显子剪接增加与基因表达增加和选择性TSS使用相关研究者使用了一种比较的方法来探索剪接和TSS使用之间的潜在联系，研究了因存在或不存在内显子而不同的小鼠和大鼠同源基因的转录模式。在此之前，研究者从其他哺乳动物(包括大鼠、猕猴和牛)的不同组织中发现了超过1000个未曾在RNA-seq数据中检测到的外显子，因此很可能是最近在小鼠谱系中发现的。还发现了类似数量的大鼠(rat)独有的外显子，以及几百个小鼠(mouse)独有的外显子(图1A)。这些进化上的新外显子大多位于5’非翻译区(UTRs)，并以可变和组织特异性的模式剪接。与亲缘关系较近的物种相比，研究者已经观察到，在进化上具有新的内外显子的基因往往会增加基因表达，但只在那些新的外显子包含在mRNA中的组织中。这种趋势对于有效剪接的外显子更强——通过剪接的百分比来评估(PSI或c)值为>0.95，表明该基因中95%以上的mRNA包含外显子(图1B)，表明外显子剪接的程度与基因表达水平之间存在关联。图1 新外显子的剪接与TSSs基因表达和表达量的增加有关。
B：小鼠特异性外显子基因在小鼠和大鼠9个器官中基因表达的FPKM变化，通过每个组织中新外显子的φ值进行比对。C：小鼠和大鼠相应组织间多TSSs基因表达的倍数变化。D：利用小鼠巨噬细胞Start-seq数据分析小鼠中所有表达的基因，和具有小鼠特异性新外显子的基因的每个基因的TSSs数量分布。E：小鼠TSSs获得基因比例(小鼠TSS >大鼠TSS)，小鼠TSSs缺失基因比例(小鼠TSS <大鼠TSS)，基因数量相同时两个物种(小鼠TSS =大鼠TSS)中所有基因的TSSs(灰色)和带有小鼠特异性新外显子的基因(粉红色)。F：按(C)分组的9个小鼠基因，小鼠和大鼠之间每个基因使用的TSSs数量的倍数变化。G：大鼠所用TSSs的数量与小鼠所用TSSs的数量之比，包括两种表达的所有基因(灰色)和大鼠特异性丢失外显子的基因(蓝色)。根据使用的启动子数量对基因进行分组，研究者发现包含新外显子与多个TSSs基因的基因表达之间存在正相关关系，但只包含一个TSS的基因则没有这种关系(图1C)。此外，RNA-seq数据表明，与小鼠中所有表达的基因相比，具有小鼠特异性新外显子的基因更可能具有多个TSSs。研究者使用其他方法确定TSS的位置，包括H3K4me3 ChIP-seq峰和来自高分辨率聚合酶相关测序的数据，证实了带有新的小鼠特异性外显子的基因更可能有多个TSSs(图1D)。具有大鼠特异性新外显子的基因(n = 1517)也比大鼠的整体基因更有可能有多个TSSs。此外，获得新物种特异性外显子的基因更有可能在同一物种中获得TSSs，这表明内外显子的进化增益与基因座中TSSs的进化增益有关(图1E)。为了进一步研究这种联系，研究者通过一个基因分析了在不同组织中使用的新外显子和TSSs。研究者观察到包含小鼠特异外显子的基因相比在大鼠中的直系同源基因，使用更多的TSS，显示剪接和TSS使用在哺乳动物器官之间的联系(图1F)。与单个TSSs基因相比，具有多个备选TSSs基因的新外显子具有更高的PSI值。相反，内外显子丢失与TSS丢失和基因表达水平下降有关(图1G)。总之，这些观察表明，新TSSs的使用和新内外显子的剪接往往发生在相同的基因、组织和物种中，这表明剪接、基因表达增加和新TSSs之间存在密切联系。研究者观察到，小鼠相对于大鼠的基因表达增加仅限于那些在小鼠中获得TSSs的基因(图2A)，证实了启动子、内外显子的进化与基因表达水平之间的紧密联系。只有10%的新TSSs基因获得了小鼠特异性的新外显子，与整体分析基因的比例无差异(图2B)。这种方向偏差表明，物种特异性新外显子的增益有利于新TSSs的增益，而非相反。研究者观察到一个位置效应，即每个基因TSSs数量的增加主要与位于5’UTRs的新外显子相关(图2C)。研究者检查了所有小鼠TSSs相对于小鼠特异性新外显子位置的分布，并将其与大鼠TSSs相对于小鼠特异性外显子同源位置的分布进行了比较。这一比较显示，TSSs在新外显子上游的几kb内富集(图2D)。因此，新的内外显子的进化增益与近端、上游TSSs的增益特别相关。然后研究者分析了在同一基因内剪接水平和选择性TSSs之间的关系。考虑相对TSS用法，研究者发现，使用最多的近端上游TSS(指定TSS -1)与新外显子包含(new exon inclusion)，尤其是对TSS位于上游1 kb的新外显子(图2E)表现为正相关。此外，在含有中等或高水平新外显子的组织中，附近TSSs转录本的绝对表达量明显增加(图2F)。这些观察提示剪接对邻近转录有积极的影响。A：小鼠获得TSSs的基因(小鼠TSS >大鼠TSS)和小鼠失去TSSs的基因(小鼠TSS<大鼠TSS)在小鼠和大鼠间的基因表达发生了倍数变化。B：从小鼠和大鼠表达的所有基因中获得小鼠特异性新外显子的基因比例以及获得新TSSs的基因比例。C：根据外显子在基因中的位置，小鼠和大鼠的新外显子基因中使用的TSSs数量之比。D：小鼠(粉红色)和大鼠(灰色)9个组织中含有小鼠特异性新外显子的基因的TSS位置的直方图，集中在小鼠新外显子的起点或大鼠的同源基因组位置。E：TSS相对使用和新外显子PSI值在小鼠组织间的斯皮尔曼相关性。F：转录本(包括TSSs)在小鼠组织中的FPKM表达差异(PSI > 0.2)，与排除新外显子的组织(PSI < 0.05)，按TSS相对于新外显子的位置分组。为了直接检测剪接是否影响附近的转录，研究者选择了两个候选的小鼠基因：Gper1 (G蛋白偶联雌激素受体1)和Tsku (Tsukushi，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖)。这些基因均分布广泛、中等表达，并包含一个小鼠特异性的5’UTR内外显子，其剪接与该基因在小鼠组织中的表达呈正相关(图3A和图3B)。用吗啉反义寡核苷酸处理培养的小鼠成纤维细胞(MO)，以针对这些基因中的新外显子的剪接位点，两个Gper1(图3A)和Tsku(图3B)的外显子插入(exon inclusion)减少了约4倍。此外，这两个基因的基因表达水平也受到了类似程度的抑制，与外显子插入对基因表达的积极影响一致。在分析代谢标记的新生RNA(nascent RNA)(图3A和图3B)和总mRNA时，研究者观察到类似的抑制水平，这表明该效应主要在转录水平，而不是mRNA的稳定性。接下来，研究者试图确认这种效应的方向性，并探讨新外显子的拼接如何影响不同TSS的使用。研究者选择小鼠的Stoml1 (Stomatin Like 1)基因进行分析，该基因有三个活跃的TSSs替代序列和一个新的外显子。利用CRISPR/Cas9诱变技术产生具有突变的细胞系，消除了新外显子的插入，研究者观察到，该基因的三个备选TSSs对新外显子的剪接抑制有不同的反应。突变株上游TSS -1下调4倍，下游+1和+2 TSSs上调幅度相似(图3C)。这些突变细胞系对反义转录的影响与同义转录的影响一致(图3C)，表明新外显子的加入可以从两个方向提高上游启动子的转录。这种模式不同于内含子介导的增强，在这种增强中，感觉定向的内含子特异性地抑制反义转录，但这与报告基因中内含子位置的改变对转录起始的影响是一致的。突变体细胞系中，H3K4me3和RNAPII的表达水平在上游TSSs中减少，在下游的TSSs中增加，这与观察到的对新生转录产物的影响一致。为了在全基因组范围内评估剪接和邻近转录起始之间的关系，研究者分析了小鼠和大鼠CD4+ T细胞的精密运行测序(precision run-on sequencing, PRO-seq)数据。与所有表达的基因相比，具有小鼠特异性新内外显子的基因相对于大鼠有更高的新生RNA表达(图3D)。此外，新生RNA的相对增加是由启动新外显子位置上游的转录本驱动的，特别是来自新外显子上游2 kb以内的TSSs。PCPA可以产生截断的、不稳定的转录本，但可以通过在PCPA位点附近结合U1 snRNP来抑制。使用来自5个小鼠组织的polyA-seq数据，研究者只观察到8.6%带有新外显子的基因有nePCPA位点的证据，不高于对照基因(图3E)。对于包含nePCPA位点的基因子集，研究者没有观察到新外显子被剪接的组织与被剪接的组织在该位点的使用上的差异(图3E)。研究者也没有发现nePCPA位点的数量与小鼠和大鼠之间基因表达变化之间的关系，因此，研究者的结果表明，影响PCPA对EMATS没有显著的作用，而EMATS影响转录起始而不是随后的步骤。A：(左)Gper1基因在8个组织中基因表达的变化与新外显子PSI值的关系。(右)使用5-乙基尿苷对NIH 3T3细胞进行处理后，新外显子PSI值(中)和新生RNA代谢标记10分钟后的基因表达(右)。C：利用qRT-PCR检测5-乙基尿苷代谢标记10 min的RNA，并使用管家基因Gapdh、Hprt和Hspcb归一化，检测CAD细胞中Stoml1初生正义(上)和反义(下)RNA水平的变化。E：每个基因使用的聚腺苷酸位点的数量分布，位于具有外显子跳跃的一组小鼠基因的上游或下游2 kb处(灰色，sePCPA)和带有小鼠特异性新外显子的基因(粉红色，nePCPA)。接下来研究者探索剪接如何影响不同上游TSSs的使用。在Tsku基因中，老鼠特有的-1位置的TSS位于小鼠特异性外显子上游1kb以内，保守的TSS -2位置位于更上游。5’RACE的分析表明，这两种TSSs在小鼠成纤维细胞中使用的水平相似，而MO对新外显子剪接的抑制作用则优先被TSS -1抑制(图4A)。这种变化伴随着MO treated cells中TSS -1附近的H3K4me3水平而3倍程度下降(图4B)。然而，接近TSS -2的H3K4me3水平未发生改变，证实来自TSS -2的转录不受影响(图4B)。在MOs处理的细胞中，TFIIF和RNAPII的水平下降了近3倍，TSS -1在TSS -2附近没有变化(图4C)。这些观察表明，新外显子的剪接可能有助于核心转录机制募集到邻近的TSS -1。此外，MO处理后，新外显子附近的TFIIF和RNAPII信号的丢失表明，新外显子的包含与转录因子的募集有关，这与GTFs和剪接机制两者之间的功能相互作用一致。这些观察结果证实，新外显子的剪接可以调节替代TSSs的使用，并对近端上游启动子产生显著影响。为了分析单个剪接位点和剪接水平的影响，研究者创建了一个与大鼠Tsku基因中小鼠特异性新外显子相对应的外显子，并评估了其对转录的影响。在大鼠Tsku基因座中，转录本主要从远端TSS -2转录。然而，与TSS -1和小鼠特异性新外显子同源的区域与小鼠基因组具有较高的序列一致性：在大鼠中均存在5’剪接位点，但没有一致的3’剪接位点(YAG，其中Y = C或T)存在于大鼠3’剪接位点附近，可能阻止了剪接。在3’和5’剪接位点同时存在的情况下，通过荧光素酶活性测定，相比没有剪接位点的情况下，总基因表达水平升高(图4D)。通过5’RACE分析，TSS -1在微小基因(minigene)中处于基础水平。然而，在大鼠环境中，特定于老鼠的外显子激活了在5’剪接位点存在时，TSS -1增加了3倍，这表明对TSS使用的影响取决于特定于小鼠的外显子的剪接，而不仅仅是3’剪切位点序列(图4E)。上述发现暗示了与TSS使用协调的剪接机制的存在。为了探索可能参与这种协调的因素，研究者分析了小鼠新外显子中剪接因子结合基序的富集。结果显示剪接因子RBM22的结合基序，HNRNPU和ELAVL1的新外显子含量至少增加了2倍，其含量的增加与TSS邻近外显子的使用有关。这一观察结果提出了这样一种可能性，即某些剪接因子可能有助于TSSs的剪接依赖调控，如可能是通过在RNA剪接位点附近招募GTFs来实现的(图4C)。为了探索这种可能性，研究者分析了HNRNPU耗竭后TFIIF招募到Tsku位点的情况，已知HNRNPU通过其N末端与TFIIF相互作用。HNRNPU基序在Tsku中小鼠特异性外显子的下游富集，该外显子的剪接在HNRNPU耗尽后减少了约3倍。HNRNPU耗竭后，TSS -1和新外显子附近的TFIIF水平降低，而TSS -2和组成型外显子附近的TFIIF水平未受影响(图4G)。HNRNPU缺失对近端启动子外显子剪接、TSS -1转录和TFIIF水平的影响通过全长HNRNPU过表达得以挽救。但是，含有C末端的HNRNPU的截短版RNA结合和剪接的调控域，缺乏与TFIIF相互作用的N端域，部分维持了拼接，但未能稳定TFIIF水平和TSS -1表达(图4G)。综上所述，这些观察结果(图4C)表明HNRNPU可能是通过募集TFIIF到近端启动子，既能激活新外显子的剪接，又能介导转录的剪接依赖激活。在之前研究的一些例子中，物种特异性的选择性剪接改变了蛋白质的功能。研究者的结果支持了一种独特的进化途径的存在，在该途径中，随着产生一个新的内外显子的突变，来自远端上游启动子的新外显子剪接激活来自近端上游启动子的转录。一种可能的机制说明新的外显子会招募剪接体，或许也会招募剪接因子，如HNRNPU，它的作用是招募附近的GTFs。来自新启动子的转录本也将包括外显子，进一步激活新启动子，形成一种正反馈回路。新激活的TSS还将产生新的转录亚型，并在上游启动子活跃且包含外显子的组织中产生更高的基因表达(图4H)。图4 一个新的剪接位点的创建激活了附近一个隐秘启动子的使用。
A：5’RACE结果显示TSS使用由克隆比例决定(fraction of clones)，与对照组的每个TSS相对应的是NIH 3T3细胞，以及以MO转染Tsku中新外显子的3’和5’剪接位点为目标的细胞，来自2个生物复制的每个样本至少有25个克隆。B和C：NIH 3T3细胞中Tsku基因H3K4me3 (B)和TFIIF(亚基TFIIF-alpha) (C)的ChIP-PCR分析结果。D：转染Tsku微量报告基因的HeLa细胞中的荧光素酶活性(右图)。E：类似(A)中的5’RACE结果。NIH 3T3小鼠细胞被转染表达相应大鼠Tsku突变体的质粒。F：(上)HNRNPU结构示意图，(下)qRT-PCR分析新的外显子PSI值在使用对照siRNA或以HNRNPU (siHNRNPU)为靶点的siRNA和NIH 3T3细胞中治疗后的倍数变化。G：(A)区域中NIH 3T3细胞Tsku基因中TFIIF(TFIIF-alpha亚基)的ChIP-PCR分析。H：在该模型的进化过程中，剪接位点的创建会触发包含一个新的内外显子，该内外显子激活上游加密TSS的使用。在该模型中，HNRNPU在远端启动子转录本中的外显子识别招募TFIIF，激活位于外显子近端和上游的TSS。来自近端启动子的转录产物也包括外显子，进一步增强了该启动子的活性。为了研究剪接和上面观察到的选择性TSS使用之间的关联，研究者提出了这样一个问题：一般情况下，可变外显子跳跃(SE)是否会影响TSS选择，而不仅仅是那些近期进化的外显子。研究者使用保守标准在小鼠RNA-seq数据13,491个基因中鉴定了49,488个SEs。通过分析与新外显子的TSS-外显子距离匹配的独特的SEs，研究者发现SE的包含与近端上游TSSs的使用之间没有显著的相关性(图5A)。此外，研究者还观察到TSSs在SEs位置附近的对称分布，与相对于新外显子的上游偏置分布不同(图5B)。这些差异表明，带有新外显子的基因具有明显的特性，有利于剪接和转录的连锁。通过检查带有新外显子的基因位点的其他特征，研究者发现，尽管新外显子的PSI值往往低于SEs整体，但那些带有近端上游TSSs的新外显子往往具有更高的PSI值和更强的5’剪接位点。此外，虽然在有新外显子的基因和一般有SEs的基因中，相对TSS使用值的分布是相似的，位于新外显子近端和上游的TSSs在组织间的相对使用率低于其他位置的TSSs(图5C)。因此，当启动子本身较弱而剪接活性较高时，剪接与TSS使用之间的联系最为明显。值得注意的是，研究者观察到TSS使用与外显子包含的相关性最高的是相对TSS使用值的最低四分位数(图5D)和SE PSI的最高四分位数(图5E)。这一观察结果为以下现象提供了证据：所观察到的新外显子的EMATS可能普遍出现在SEs的一个子集中。A：TSS相对使用(n = 49,911)与外显子跳跃在小鼠组织中的外显子(SE, n = 13,491)之间的斯皮尔曼相关性。B：小鼠特异性新外显子基因(蓝色)和小鼠SEs基因(灰色)在9个组织中TSS位置分布的比较。C：所有TSSs的AFE可变剪接事件在包含新外显子的小鼠特异性新外显子的组织中的表达(PSI > 0.05)。F：热图显示了TSS相对使用和SE之间的斯皮尔曼相关性。剪接和邻近转录起始之间的机制联系可能由剪接过程中形成的核心剪接机制、剪接因子或外显子连接复合体(EJC)组件介导，特别是那些与转录机制、转录因子或染色质相互作用的因子。为了探索RNA结合蛋白(RBPs)与TSS使用之间的功能联系，研究者利用ENCODE数据分析了TSS可变使用的转录组水平的变化。与之前在果蝇细胞中观察到的结果一致，56个RBPs敲除后，多达30%的选择性剪接事件涉及启动子使用的变化，研究者的分析检测到大量的TSS变化。与其他RBP相比，EJC组分和参与RNA剪接的因素的缺失对TSSs的影响更大(图6A)。先前的研究已经将EJC与基因表达调控以及RNAPII暂停的控制联系起来。根据研究结果，剪接因子可以调节可选外显子附近转录机制的招募，研究者重点关注与TSS使用中最大数量变化相关的10个剪接因子(图6B)，其中包括上文研究的HNRNPU因子。使用来自STRING数据库的蛋白-蛋白相互作用(PPI)数据，研究者观察到这10个剪接因子与其他65个蛋白质相互作用，包括RNAPII和GTFs的亚基，如TFIIF(图6C)。这些剪接因子可能广泛影响启动子的选择，并确定这些因素与核心转录机制之间的广泛相互作用。为了探讨EMATS对基因表达调控的潜在生物学作用，研究者分析了EMATS结构对基因功能的影响。在人类和小鼠中，这些基因在大脑发育、神经元投射、突触组织和相关功能方面得到了富集(图6D)。图6 剪接因子的一个子集对TSS的使用有广泛的影响，并与转录机制相互作用。
A：启动子使用显著变化的基因数量分布与250个RBPs的耗损相关，由GO中Biological Process划分RBPs的类别。B：去除67个剪接因子后，TSS使用发生显著变化的基因数量的直方图。D：1777个EMATS潜力最强的小鼠基因GO分析。E：(左)维恩图显示了基因表达(GE)、选择性剪接(SEs)和TSS相对使用的基因之间的重叠；(右)显示具有EMATS组织的人类基因PTBP1敲低后，GE、SE和TSSs变化基因之间的重叠。为了研究SEs的剪接是否通过调节全基因组范围内的转录而影响基因表达，研究者分析了瞬态转录组测序(TT-seq)数据，这些数据敏感地监测了人类T细胞受到刺激后转录的快速变化受到刺激后转录的快速变化。研究者观察到，激活15分钟后，SEs插入减少的基因，其转录水平也随之降低(图7A)。这种趋势在EMATS结构的基因中更为明显(图7A)，这表明EMATS通过调节转录参与基因调控。通过改变TSS选择在5’UTR亚型之间进行切换，最近被认为是调节酵母翻译效率的重要因素。为了回答TSS选择的剪接依赖调节(splicing-dependent regulation)是否通过EMATS影响翻译，研究者分析了人类HEK293T细胞多聚体测序(TrIP-seq)数据中的转录亚型，以评估EMATS亚型的核糖体占用情况。研究者发现第一个外显子与缺乏EMATS结构的基因标记对照相比，EMATS相关的TSSs中位折叠变化约1.3倍，明显更多地与核糖体相关(图7B)。这些观察结果表明，由EMATS转录激活的亚型往往具有增强的翻译活性，从而放大了EMATS对蛋白质生产的影响。A：在T细胞刺激15分钟后，所有表达基因的新生RNA水平(TT-seq read count)的变化，增加一个外显子跳跃(SE)事件的基因，具有EMATS结构的基因和SE事件增加的基因。B：EMATS TSS isoform(粉红)相对于来自同一基因的对照isoform(灰色)具有更高的翻译效率(TE)。C：EMATS在动态基因表达程序中的作用模型。生长因子或其他刺激可激活转录因子(TF)和剪接因子(SF)。TFs通过直接影响转录(tx)和间接调节SFs水平来影响基因表达。本文中，研究者已经证明在基因中包含一个新的内外显子可以激活来自上游TSS的转录，从而增加基因表达水平，研究者称之为EMATS现象。研究突出了这种关系的几个特征：(1)它需要外显子剪接，而不仅仅是5’或3’剪接位点的存在；(2)外显子被高度包含时更强；(3)启动子本身较弱时更强；(4)对基因组距离敏感，当外显子和启动子在1-2 kb范围内时最明显；(5)上述特征存在于成千上万的哺乳动物基因中。解释上述特性的最直接的模型是，共转录募集的剪接元件对转录机制向邻近的上游启动子募集起直接的积极作用(图7D)，剪接机制能招募GTF或调节转录活性，而RBPs的缺失会对启动子的选择产生较大的影响。与剪接相关的剪接机制或沉积在转录本上的蛋白质的参与可以解释特征(1)，而剪接机制更高效地招募到更高效的剪接外显子则可以解释特征(2)。招募RNAPII或GTFs可能有望在较弱的启动子上更有效地激活转录，RNAPII的招募比那些拥有更高的RNAPII固有占有率的强势启动子受到限制，这可以解释特性(3)。剪接机制和RNAPII或GTFs之间的直接物理连接的需求可能会限制两者的物理距离，这可解释特性(4)。进化路径的频繁出现(图4I)和5’UTRs可能解释了哺乳动物基因组中EMATS组织的广泛发生，解释了特征(5)。最近的研究拓宽了转录增强子的定义，发现一些启动子也具有增强子的功能；研究者的发现进一步扩展这一定义，包括一些外显子，5’UTR内含子剪接过程中的调控变化可能也会影响上游启动子的使用。研究者提出新的内外显子和新TSSs的出现是关联的(图4I)。一旦激活，新的TSS产生新的转录亚型和更高的基因在特定组织的整体表达，为基因的调控进化提供了一个底物。EMATS最明显的调控作用是作为一种剪接因子的手段，参与分化或细胞对刺激的反应的基因表达程序(图7C)。具体地说，研究者认为诸如生长因子等外部刺激不仅通过对TF活性的直接影响来触发基因表达变化，还受TFs下游剪接因子水平的变化或剪接因子活性的影响，通过EMATS触发额外的基因表达变化。研究者发现的另一个意义是，研究或治疗目的的基因表达的靶向激活，可以通过使用反义寡核苷酸或小分子等化合物增强或隐蔽启动子近端外显子的剪接实现。
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