编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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近年来，随着技术和方法学的进步以及人们对生物系统中个体重要性的认识日益增加，对单细胞进行转录组分析的需求日益增长。但是，目前大多数研究仅在哺乳动物细胞中进行，由于哺乳动物细胞易于裂解且RNA含量高。尽管已知在单个孢子之间存在表型水平的异质性，但尚未对微生物孢子进行单细胞转录组分析，部分原因是由于孢子壁的物理坚固性，使通常用于哺乳动物细胞的方法无法使用。本文描述了一种从单个真菌分生孢子（无性孢子）中提取和扩增转录本的简单方法，并将其应用于单细胞转录组学研究中。该方法还可以用于少量真菌分生孢子的研究，在样品少、转录本含量低或对分生孢子的小亚群感兴趣的情况下可以使用。
论文ID
原名：Method for RNA extraction and transcriptomicanalysis of single fungal spores
译名：单个真菌孢子的RNA提取和转录组分析方法
期刊：MethodsX.
IF：3.782
发表时间：2019.12.2
通讯作者：Simon V. Avery
通讯作者单位：诺丁汉大学生命科学学院
DOI号：doi.org/10.1016/j.mex.2019.12.002
结果
1方法细节
必须在无RNase污染的环境中进行试验，以防止样品降解。在整个方法中，为了最大程度地从单个分生孢子中成功回收RNA，需要做到：使用无核酸酶的试剂和移液器吸头；在干净的实验室环境中工作；尽可能将样品放在冰上；使用RNase抑制剂。不含RNase的材料（例如此方法中使用的玻璃珠）可以180-200℃过夜以破坏RNase。使用黑曲霉N402的分生孢子进行试验，但本方法应该可以适用于其他分生孢子及其他孢子类型。
示意流程图
1.1分生孢子的获取
[1] 黑曲霉在斜面上或在Petri培养皿上生长，产生大量分生孢子。加入5 mL的0.1％Tween 80并用棉签轻轻刮擦菌落表面来收获菌落。Tween 80的存在有助于防止分生孢子结块。
[2] 通过40μm的细胞滤网过滤除去菌丝和较大的细胞碎片。
[3] 500 g离心10 min，弃去上清液，重悬于5 mL 0.1％Tween 80溶液中。孢子浓度可以通过在血球计数来确定。
1.2分生孢子的裂解和裂解物的浓度
真菌分生孢子对通常用于裂解哺乳动物细胞的缓冲液具有很高的抗性。黑曲霉的分生孢子也对酶解具有抗性，应用于酵母细胞的原生质体方案的使用不能使用。因此，本方法采用机械裂解法从分生孢子中释放RNA。但是机械裂解需要大量（250μl）进行，因此有必要在cDNA合成和扩增之前先浓缩样品，且只能在仅含有RNase抑制剂的水中进行裂解。
[1] 将单个分生孢子分装在0.5 mL的螺旋顶微管，其中装有30–50 mg的玻璃珠（直径150–212 µm；其他尺寸效果不佳）和249 µL H2O + 1 µL（40U）RNaseOUT重组RNase抑制剂。使用细胞分选仪应确保提取管中存在单个分生孢子。或者，如果需要也可以将大量孢子等分到每个试管中。如果没有细胞分选仪，也可以通过稀释和显微镜观察选择单个分生孢子。在这种情况下，将分生孢子的悬浮液稀释至1000分生孢子/mL，将1μL等分到平底96孔板的孔中。使用倒置显微镜观察分生孢子，并用100μL H2O将含有单个分生孢子的孔中的分生孢子转移到裂解管中。如果可能的话，最好使用细胞分选仪。
[2] 在快速核酸提取仪中以6.5 m/s的速度裂解40 s（其他速度效果较差）。未测试使用其他方法进行的裂解，应该可以使用其他方法，例如基于涡旋的方法。
[3] 以16,000 g离心5-10 s。
[4] 除去上清液（约220μL），并放入无核酸酶的1.5 mLEppendorf管中。
[5] 将样品放在真空浓缩器中，在环境温度下离心浓缩系统浓缩。最好将样品浓缩至最终体积约为5μL，不要至完全干燥，因为干燥的RNA可能无法完全重悬。
1.3cDNA合成与扩增
裂解物应立即用于cDNA合成，不建议短期或长期储存分生孢子裂解物。该方案使用Superscript®IV逆转录酶，已发现它是单细胞研究中表现最好的逆转录酶之一。
[1] 向5 μL细胞裂解物中加入1 μLOligo d(T)20引物、1 μL dNTP混合物和6 μL无核酸酶的H2O，混合并短暂离心。
[2] 在热循环仪中，将细胞裂解物-引物混合物在65°C加热5分钟，然后在冰上孵育至少1分钟。
[3] 在单独的试管中混合逆转录酶反应的其余成分。对于每个样品：4 μl 5 x SSIVbuffer、1 μl 100 mM DTT、1 μl SuperScript® IV逆转录酶、1 μl 无核酸酶的H2O，混合并短暂离心。
[4] 将步骤3中的混合组分（7μl）添加到步骤2中的细胞裂解物-引物混合物中，并在热循环仪中于50-55°C孵育10分钟，然后通过在80°C加热10分钟使反应失活。
整个cDNA反应（20μl）用于PCR反应中以检测目标转录物。DNA聚合酶的选择不是最重要的。该方法使用NEB Taq聚合酶，但也可以使用其他DNA聚合酶。应设计引物以扩增长度小于200 bp的区域，因为较长的靶序列扩增效率可能较低。设计引物以跨内含子扩增可以有效的将基因组DNA的扩增与cDNA的扩增区分开。
[1] 在cDNA混合物（20μl）中，添加引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶达到制造商的规定，使总反应体积为50μl。
[2] 将反应混合物放入热循环仪中，并按照制造商的说明运行。可能需要增加循环数（例如至40个循环）以检测转录本。
2方法验证
2.1黑曲霉分生孢子中转录本的检测
利用上述方法检测少量未萌发的黑曲霉分生孢子，包括单个分生孢子中的转录本。在优化此方法的过程中，通过将1ul分生孢子悬浮液移入96孔板中来确定所使用的少量分生孢子。使用倒置显微镜对每个孔中的分生孢子计数，并选择包含所需单个分生孢子数的孔。随后用100μl无核酸酶的水冲洗孔，将分生孢子转移到裂解管中。图1为3种不同基因：bgtA、actA和catA的扩增转录本的凝胶电泳。actA和catA基因组DNA（gDNA）和cDNA都发生了扩增，在每个样品中都有2个条带。由于扩增存在内含子，因此较大的片段对应gDNA扩增。bgtA cDNA的扩增导致条带大小为190 bp，而gDNA为260 bp。除了gDNA和cDNA扩增之间的大小差异外，还包括-RT（逆转录酶）对照，可以简单区分gDNA或cDNA扩增（对照不包含cDNA）。
图1.来自少量黑曲霉分生孢子的扩增cDNA的凝胶电泳（3％凝胶）。分析了3个基因（bgtA、actA和catA）。在每个泳道下方标出了提取的分生孢子数。对于-RT对照，分别提取了bgtA和actA的22个和26个分生孢子。标尺为100 bp，谱带大小在图片右侧指示。对于actA和catA，较大片段对应gDNA。对于bgtA，预期扩增cDNA条带为190 bp，而扩增gDNA条带为260 bp（在-RT对照中微弱可见）。
不出所料，高丰度转录本的检测比低丰度转录本的检测更为成功。先前对大量黑曲霉分生孢子进行的转录组学分析表明，bgtA（编码1,3-β-葡糖基糖基转移酶）和catA（过氧化氢酶A）具有高的转录本丰度。这反映在图1中单个分生孢子中的这些转录物的检测中。相反，actA（肌动蛋白）的转录物丰度较低，在具有1个或2个分生孢子的样品中未成功检测到转录物。样品降解也可能导致转录本检测的丢失；极少量的RNA或DNA非常容易被内源或外源核酸酶降解。
分生孢子数量少时，转录本比gDNA更为常见。说明在单个分生孢子核中目的基因以单拷贝存在，而转录本可以以数十或数百个拷贝存在。另外，该方法没有保护gDNA免于降解。
2.2单个黑曲霉分生孢子的全转录组分析
尝试分析单个黑曲霉分生孢子的整个转录组。已经采用了许多不同的方法来分析单细胞转录组。但是，本方法中分生孢子的机械裂解与Drop-seq中使用的基于微流体液滴的方法不兼容，只适用于基于板的单细胞转录组学方法（例如SCRBseq）。在该实验中使用BD™精确全转录组分析方法来分析单个未萌发的黑曲霉分生孢子的转录组。将黑曲霉的单个未萌发分生孢子的裂解物转移到BD™ Precise WholeTranscriptome Assay的96孔板的孔中。该测定法能够从单个细胞进行逆转录，条形码编码和扩增整个转录组，然后进行下一代测序。使用特异标签（UMI）可在扩增后识别和定量转录本，并控制扩增偏差。使用BD™ Precise WholeTranscriptome Assay Analysis pipeline v2.0（包括FastQC、STAR和HTseq-count）以及Recursive Substitution Error Correction™ (RSEC) andDistribution-Based Error Correction™ (DBEC)，在Seven Bridges Genomics平台上进行了测序数据分析。
在每个分生孢子中检测到平均属于140个不同基因的转录本，检出的最高数量为446个，最低的为14个（图2A）。检测到的转录本是较高丰度的转录本。例如2个基因的转录本丰度如图2B所示。在超过50％的分生孢子中可检测到以下转录本：在88个分生孢子中检出了ConJ的转录本（An01g10790），在88个分生孢子中检出了假定热激蛋白（An06g01610）的转录本。这些数据表明，该方法可以在单个黑曲霉分生孢子中检测数百种不同基因的转录本。以前使用基于平板的方法研究单个酵母细胞的研究已经检测出超过一千种不同基因的转录本。然而，与休眠孢子相比这可能只是反映了这些研究中营养细胞中更高的mRNA丰度/多样性。
据研究者所知，这是首次报道单孢子转录组学，目前尚无法与其他方法直接比较。
图2.使用BD™Precise Whole Transcriptome Assay法对88个黑曲霉分生孢子进行全转录组分析。（A）每个分生孢子（每个点代表1个分生孢子）检测到的转录本数量（属于不同的基因）。蓝线表示平均值。（B）88个单一分生孢子中两个基因（ConJ和假定热休克蛋白）的转录本丰度，表示为在每个分生孢子中检测到的总特异标签（UMI）的比例。
评论
丝状真菌菌丝体及孢子具有高度的异质性，这与空间、时间等差异直接相关，同时部分真菌还存在有性繁殖等生活史。因此有必要在单孢子水平上检查转录组，帮助解释单个孢子之间异质的表型，对于真菌生物学有重要影响。本研究首次建立单个孢子的转录组研究方法，虽然检测得到的转录本较少，但是该方法的建立为进一步研究提供了重要的技术支持。
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