编译：小鹿同学，编辑：十九、江舜尧。
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孕期孕妇滥用药物是一个迅速升级的社会问题。精神兴奋剂，包括苯丙胺、可卡因和甲基苯丙胺（冰毒），是孕妇最常用的违法药物。目前这些药物对周身器官可能产生的不良影响知之甚少，如果在子宫内暴露更是会导致终生病态。本文中，研究者通过将人类RNA测序数据与神经内分泌发育细胞系和小鼠模型相结合，探究了子宫内精神兴奋剂的暴露对后代产生的不良影响。研究发现，孕妇在怀孕期间对精神兴奋剂的间断性暴露会永久地损害后代胰腺β细胞产生胰岛素的能力，且以性别偏好的方式导致成年雌性后代出现葡萄糖不耐症。
论文ID
原名：Life-long impairment of glucose homeostasisupon prenatal exposure to psychostimulants
译名：产前暴露于精神刺激药后终生葡萄糖稳态的损害
期刊：The EMBO Journal
IF：11.227
发表时间：2019年11月21日
通讯作者：Tibor Harkany
通讯作者单位：奥地利维也纳医科大学脑研究中心分子神经科学系
DOI号：doi.org/10.15252/embj.2018100882
实验设计
本研究基于人类胎儿胰腺的RNA测序数据及α和β细胞的单细胞RNA测序数据分析，确定了5-HT为产前精神兴奋剂作用的关键分子底物。接着，研究者利用小鼠模型探究了内分泌胰腺中5-HT信号传导的组织结构，同时在体外通过Ca2+成像的方式检测INS-1E细胞系对5-HT和精神兴奋剂（苯丙胺、甲基苯丙胺和可卡因）处理的响应，从而确定5-HT与血清素再摄取转运蛋白（SERT）及精神兴奋剂之间的关系。随后，研究者利用胰腺外植体模型及不同时期的小鼠模型，结合了统计学分析及分子生物学手段探究了精神兴奋剂对早期胎儿胰腺内5-HT和胰岛素含量的影响，以及精神兴奋剂对后代成年时葡萄糖稳态的影响。最后，研究者将小鼠模型和葡萄糖不耐症患者胰岛内的mRNA数据结合起来，建立了体外染色质亲和性分析模型，从而探讨了精神兴奋剂发挥作用的可能机制。
结果
人类胎儿胰腺中的单胺信号
考虑到精神兴奋剂的作用机制广泛受到细胞内囊泡运输和细胞表面再摄取系统（它们会调节胞外单胺的水平）的干扰，研究者首先描述了胎儿胰腺中血清素（5-HT）、多巴胺（DA）和肾上腺素（NE）信号的分子成分（图1）。这些数据中展示了5-HT受体（HTR1B、HTR2A/B/C、HTR3E）、5-HT的再摄取转运蛋白SLC6A4（SERT）以及色氨酸羟化酶（尤其是TPH1；图1A）的mRNA表达水平。在妊娠前三个月的中下期，胎儿胰腺中还表达了肾上腺素受体（ADRA2A/2B、ADRA3B）、多巴胺羟化酶（DBH）以及少量的SLC6A2（NET），从而介导NE的再摄取（图1C）。值得注意的是，即使检测到了不同水平的酪氨酸羟化酶（TH），无论是多巴胺受体还是SLC6A3（DAT）均未表达（图1D）。SLC18A2（编码囊泡内单胺转运蛋白（VMAT2））的表达支持了单胺的有效释放（图1B）。这些数据表明胎儿胰腺内可以产生并释放单胺，顺序为5-HT~ NE> DA，其中考虑到SLC6A3未表达，DA信号不太可能成为精神兴奋剂的靶标。但是，该分析结果缺乏外分泌和内分泌成分之间差异的解决方案。
因此，研究者对分离的人类α和β细胞进行了单细胞RNA测序的矩阵处理，结果显示β细胞可以表达5-HT受体HTR1F和HTR2B、SLC6A4以及TPH2。同时在人类α细胞中也观察到了相似的5-HT信号表达模式。人类β细胞还表达多种肾上腺素受体（ADRA1B、ADRA2A、ADRB1、ADRB2），表达很少DBH，但不表达SLC6A2。人类α细胞大量表达ADRB1和ADRB2受体，表达很少DBH，也不表达SLC6A2。对于DA信号传导，β细胞表达了生物合成酶酪氨酸羟化酶（TH），但缺乏SLC6A3及其受体。相反，α细胞表达了DRD1和DRD4受体，但不表达TH或SLC6A3。SLC18A2（VMAT2）的表达支持β和α细胞有效释放单胺。这些数据与研究者得到的胎儿组织图谱结果一致，表明胰腺β和α细胞具有细胞自主和双向旁分泌5-HT信号传导的能力。另外，这两种细胞类型都可以感知细胞外的NE，并且通过DA进行β到α细胞的单向通信。考虑到β细胞表达了一个功能性的5-HT信号传导盒，且先前有报道5-HT信号传导与β细胞的增殖以及胰岛素和胰高血糖素的分泌有关，作者研究了发育中小鼠内分泌胰腺中5-HT信号传导的组织。考虑到β细胞中存在SLC6A4，但不存在SLC6A2/3，接下来主要研究精神兴奋剂对5-HT信号传导的修饰。
发育中小鼠胰腺内的5-HT信号传导
为了深入了解内分泌胰腺中5-HT信号传导的组织结构，研究者分别在胚胎（E）第14.5天（胚胎天数从产生内分泌细胞系的次级转变开始算起）、出生时（P0）和成年时期通过化学组织法进行小鼠组织采样。在E14.5天未检测到5-HT的表达，其它标志物的表达量也很低。因此，研究者主要关注新生儿（P0）和6周龄这两个时间点。5-HT信号的所有分子决定因素均倾向于在胰岛素-阳性（+）β细胞中表达（图2A-J1），包括TPH2 (Fig 2A和B1)、5-HT (Fig 2C和D2)、SERT (Fig 2E和F1)、5-HT 受体1F (5-HTR1F；Fig 2G和H1)以及5-HTR1A (Fig 2I和J1)。β细胞中可以稳定地观察到TPH2和SERT的表达，这也通过qPCR进行了验证。尽管研究者测试了多种抗- VMAT2抗体，但这些抗体均未产生可信的免疫组织化学信号，这证实了先前报道的实验室小鼠中缺乏VMAT2的表达。这些数据与5-HT信号是胰腺发育关键因素的观点相符，并表明5-HTR1F和5-HTR1A可以在小鼠中支持5-HT的信号传导。
接着，研究者使用INS-1E细胞（一种胰岛素分泌的体外模型）通过Ca2+成像的方式来检测其对5-HT的响应，尤其是Ca2+峰被认为是葡萄糖诱导的β细胞兴奋性的可靠指标。在11mM的葡萄糖中，INS-1E细胞具有自发活性（即它们通过调节型的胞吐途径释放胰岛素；图2K）。100nM到1μM范围内的5-HT引起的Ca2+波动的剂量依赖性降低（图2K1）。同时，Ca2+波动的振幅明显增加（图2K1）。这些数据表明INS-1E细胞对5-HT的浴洗处理产生了剧烈响应，同时表明亚阈值和快速的Ca2+事件以Fura2-AM为荧光指示剂基于Ca2+成像时表现为高振幅的波动。
研究者接着研究INS-1E细胞是否也可以对DA和NE做出响应。通过使用3H标记的单胺，研究者发现细胞系大量吸收5-HT，但不吸收DA和NE（图2L）。[3H]5-HT的吸收被依他普仑明显抑制，从而证实了SERT的参与（图2L）。值得注意的是，INS-1E细胞中SERT的活性水平比大脑内血清胺神经元中观察到的水平低。随后，研究者表明5-HT的摄取缺乏一个利血平敏感成分，从而证实VMAT2不太可能在这种摄取机制中发挥作用（图2M）。因此，这些数据强调β细胞类似的细胞优先利用5-HT，并证实了本研究及其他人关于啮齿动物β细胞中不存在VMAT2的数据。因此，研究者提出：5-HT在SERT介导的摄取中作为细胞内前体发挥作用，而不是作为直接与胰岛素共分割释放颗粒的递质（图2N）。
精神兴奋剂在SERT参与时诱导内向电流并抑制Ca2+的信号传导
β细胞中分子完整的5-HT信号回路的存在以及其对5-HT的敏感性表明，β细胞可能对违法的精神兴奋剂同样敏感，其作用机理主要是通过磷酸化和螯合作用使SERT失活，甚至逆转其电流迁移。精神兴奋剂在先前被证明可以诱导神经元和细胞培养系的内向电流，这可以通过SERT共转运细胞内Na+的增加来解释。为了验证这一假设，研究者在稳定表达人类SERT的HEK293细胞系（HEK293-SERT；该水平固定在-70mV稳定电位）中记录了精神药物的作用（图3A）。苯丙胺（25μM）、可卡因（10μM）和甲基苯丙胺（俗称冰毒）（5μM）诱导了显著的内向电流，其中苯丙胺出现相当长的时滞时间，可卡因对依他普仑（10μM）敏感（图3A）。单独使用依他普仑并不会影响HEK293-SERT细胞系的膜电位（图3A1）。
图3. INS-1E细胞系中精神兴奋剂诱导的电型趋势及其调节的Ca2+信号传导。
A 精神兴奋剂（A）而不是依他普仑（A1）在人血清转运蛋白（HEK293-SERT）转染的HEK293细胞系中诱导内向电流的产生。值得注意的是，依他普仑与精神兴奋剂共同施用会阻塞精神兴奋剂的作用。对于每种药物，左侧均显示了具有代表性的记录轨迹线，右侧则是定量数据（平均值±SEM；每组n>6）。注意可卡因的效应是短暂向下的偏移，而甲基苯丙胺通常会引起冲刷过程中也持续存在的延长型内向电流。HEK293细胞系始终固定在-70mV。
B 苯丙胺和甲基苯丙胺降低了装载Fura2-AM的INS-1E细胞系中Ca2+波动的振幅和频率。高浓度的可卡因增加了所检测的两个参数。根据基线对数据进行标准化，并表示为平均值±SEM。红色符号表示生物学重复。（B1）单独使用依他普仑降低了INS-1E细胞系中Ca2+波动的振幅和频率。在11mM葡萄糖存在的情况下进行实验。乙酰胆碱（ACh，5μM）作为阳性对照。
数据信息：***P<0.001，** P<0.01，* P<0.05（单向方差分析后的成对比较）。
随后，研究者通过灌流法将INS-1E细胞系剧烈地暴露于浓度越来越高的精神兴奋药物中，并记录了它们的细胞内Ca2+响应。在低浓度葡萄糖（3mM）存在时，INS-1E细胞不会产生自发的Ca2+波动。所使用的药物（苯丙胺、可卡因或甲基苯丙胺）也均未发挥任何作用。相比之下，苯丙胺在大于10μM的剂量时，使用11mM葡萄糖灌流法诱导INS-1E细胞系产生的Ca2+波动（包括其频率和振幅）都减弱了（图3B）。可卡因可引起两相效应：浓度高于10μM时，其降低Ca2+波动的频率，但不改变振幅。但是在100μM的剂量下，它会增加Ca2+波动的频率和振幅（P<0.01；图3B）。甲基苯丙胺的作用让人联想到苯丙胺的作用（在较低的浓度范围内），其以剂量依赖性的方式降低了Ca2+波动的频率。
精神兴奋剂的作用可以通过5-HT受体的变构调节或胞外5-HT的积累及其在SERT闭塞后的溢出效应来间接地介导调节。本文中，研究者测试了依他普仑剂量的增加是否会引起与药物处理相似的响应。确实，使用10μM或更高浓度的依他普仑对INS-1E细胞系进行剧烈灌洗也能降低Ca2+波动的振幅和频率（P<0.05；图3B1）。
接着，研究者单独使用依他普仑（1μM）或结合精神兴奋剂进行灌洗处理。因为依他普仑与SERT的正构位点结合，其结合位点仅部分（如果有的话）与苯丙胺、可卡因和甲基苯丙胺的结合位点重叠，因此研究者预期亚阈值的依他普仑剂量可以使INS-1E细胞系对精神兴奋剂敏感。的确，依他普仑显著增大了精神兴奋剂引起的Ca2+波动。虽然50μM苯丙胺存在的情况下，Ca2+瞬间波动的振幅仍具有反弹效果。但是，对于可卡因和甲基苯丙胺，Ca2+波动的幅度以剂量依赖性的方式降低。这些数据累积表明，精神兴奋剂结合了SERT，并且可以与依他普仑合作在体外的INS-1E细胞系中调节细胞内的Ca2+信号传导。
苯丙胺可降低体外蛋白的血清素化
调节单胺再摄取（NET、DAT和SERT）的细胞表面转运蛋白的阻滞甚至逆转是精神兴奋剂提高胞外单胺水平的机制之一。因此，胎儿胰腺中SERT是否运转具有机制性意义。为了解决这一问题，研究者在E13.5时制备胰腺外植体并将其培养6天。为了将实验条件与体内环境最大程度的匹配，外植体在培养1-3天后每日用5-HT（500nM）处理，相当于E14.5-16.5的发育时间。在最后一次处理后的24小时内，将胰腺转移至新鲜培养基中，再培养2天。胰腺外植体内积累的5-HT通过免疫荧光细胞化学技术（图4A）和HPLC（对5-HT（5μM）处理45分钟的INS-1E细胞匀浆进行检测；图4B）进行展示。这些数据证明5-HT的摄取机制可能在胎儿发育期间发挥作用，因为细胞内5-HT在这相当长的时间内都可以获取到。更广泛地说，这些结果表明胎儿胰腺对胎盘产生的（来自母体的色氨酸前体细胞）或其他母体来源的血源性5-HT敏感。
图4. 精神兴奋剂可降低体外蛋白质的磷酸化及出生时胰腺细胞内的胰岛素和血清素水平。
A 5-HT被E13.5时期制备的小鼠胰腺外植体吸收。数据用平均值±SEM表示。实验进行两次重复。比例尺=20μm。
B 同样，5-HT（5μM）处理45分钟的INS-1E细胞系内积累的单胺通过HPLC检测（平均值±SEM；数据来自两次重复实验）。
C （左）体外检测苯丙胺诱导的血清素化的实验概要。（中）全长Western blots显示在Cy5标记和含5-HT蛋白基础上的总蛋白量。箭头指向的蛋白条带用于定量分析（右）。值得注意的是苯丙胺（10μM）与5-HT（1μM）结合使用时会消除后者单独使用时的作用。实验进行四次生物学重复。数据用平均值±SEM。
D E14.5和16.5之间注射甲基苯丙胺（10 mg/kg）、苯丙胺（10 mg/kg）或可卡因（20 mg/kg）的示意图。（D1）新生儿组织被胰岛素、胰高血糖素和5-HT三重标记后的代表性图像。Hoechst 33342用于细胞核的复染（颜色为灰色）。比例尺=15μm及6μm（插入图像）。（D2）产前暴露于精神兴奋剂并不会影响P0时期小鼠胰腺中α或β细胞数目。来自每组小鼠n≥3（即n=3个怀孕母鼠）的定量数据表示为平均值±SEM。
E,F 子宫内精神兴奋剂的暴露会显著减低5-HT的免疫反应性（E）。（F）同样，胰岛素免疫反应性也降低了。来自每组小鼠n≥3（即n=3个怀孕母鼠）的定量数据表示为平均值±SEM。
G 对照组和产前药物暴露后每个β细胞内胰岛素和5-HT的免疫信号之间呈现正相关。皮尔森相关系数是从n≥60个细胞/药物的数据中得到的。
数据信息：数据通过单向方差分析后进行成对比较分析。***P<0.001，** P<0.01，* P<0.05。
接着，研究者提出疑问：长时间保留的细胞内5-HT是否具有功能性意义。在INS-1E细胞系中，5-HT暴露处理4小时能够显著增加结合5-HT的蛋白水平（图4C），表明蛋白发生了血清素化。值得注意的是，无论目标蛋白的分子鉴定如何（备注：Rabs早期被指定为β细胞的首选分子靶标），苯丙胺与5-HT共同使用时会阻碍蛋白质的血清素化（图4C）。这些数据揭示了在胎儿胰腺中长期存在的5-HT信号可能预示着在β细胞发育过程中共价结合5-HT的转酰胺基蛋白的积累。此外，有研究证实了Tph1-/-小鼠的最新数据，这些数据显示作为糖尿病病理一部分的胰腺内蛋白质的血清素化被破坏。
宫腔内精神兴奋剂的暴露可降低胎儿胰腺中5-HT和胰岛素的含量
在E14.5到16.5期间，研究者每日通过对怀孕母鼠注射通常能破坏大脑发育剂量的苯丙胺（10mg/kg 体重）、可卡因（20 mg/kg）、甲基苯丙胺（10 mg/kg）或生理盐水（作为对照）来测试精神兴奋剂对生物体内内分泌胰腺发育的影响。结果发现怀孕的母鼠并未出现流产现象，且产仔数也没有受到药物处理的影响（产仔数：与对照组6±1（生理盐水）相比，其它处理为7±2（甲基苯丙胺），7±1（苯丙胺），7±1（可卡因））。在P0时期将每窝幼崽数控制在6只，用于分析产前药物对产后幼崽葡萄糖代谢的影响。
苯丙胺、可卡因和甲基苯丙胺在大脑中发挥细胞毒性的作用。因此，研究者首先确定P0时期胰腺中β或α细胞的数目。这些药物均未减少β或α细胞数目（图4D1和D2），这表明通常所用精神兴奋剂的剂量本质上并不会破坏胰腺的发育。然而，通过免疫组织化学法检测发现，使用精神兴奋剂后β细胞内的5-HT含量显著降低（与对照组（生理盐水）相比，P<0.01（苯丙胺），P<0.05（可卡因），P<0.01（甲基苯丙胺））。与对照组（生理盐水）相比，其它处理的胰岛素水平也降低了（P<0.05（苯丙胺），P<0.01（可卡因），P<0.001（甲基苯丙胺）（图4F））。由于5-HT与胰岛素一样储存在β细胞内的相同颗粒中，并且蛋白质的血清素化可能是产生胰岛素的一个先兆，因此研究者绘制了5-HT对每个β细胞内胰岛素产生免疫反应性的图：所有的处理均反馈呈现显著正相关性（图4G），表明5-HT与胰岛素水平同步调节。没有一种精神兴奋剂会影响新生儿胰腺中胰高血糖素的含量，这准确指出β细胞是不利于发育的药物发挥作用的场所。
上述观察结果结合研究者的胰腺外植体研究数据表明，β细胞中胰岛素水平的降低表明它们出现了发育延迟（或永久性不能产生胰岛素）。P0时期胰腺内pancreaticand duodenal homeobox 1 (Pdx1)+ 细胞的数量保持不变，这个发现表明它们保留了产生β细胞的能力。然而，成对的neurogenic differentiation 1（NeuroD1）和NK6 homeobox 1（Nkx6.1）的神经源素3依赖性表达水平降低，表明苯丙胺（及更广泛的精神兴奋剂）作用后胰腺的成熟出现延迟。
大多数毒品表现出性别偏好：发育毒理学研究表明男性对大麻敏感。相比之下，苯丙胺似乎对女性特别有害。因此，研究者测试苯丙胺是否对β细胞的发育具有性别偏好影响。研究者发现产前暴露苯丙胺的雌性新生小鼠胰腺内胰岛素的免疫反应性显著降低（图5A和A1）。尽管产前暴露苯丙胺的后代中胰高血糖素水平出现降低，但并未达到统计学显著性。当通过光片照明显微镜重现新生儿胰腺时，研究者发现不是胰岛本身的数量（55.3±11.9（生理盐水）与72.3±17.2（苯丙胺））而是其大小和胰岛素免疫反应性在产前暴露苯丙胺的雌性小鼠内似乎出现了减少情况（图5B和B1）。值得注意的是，依他普仑（图5A和A1）和Slc6a4的基因缺失都会使雌性后代产生苯丙胺效应的表型。这些数据累积表明胰腺的发育以性别偏好的方式对精神兴奋剂的作用敏感，其通过SERT破坏β细胞产生的胰岛素。
图5. 苯丙胺和依他普仑均会降低雌性后代出生时的胰岛素免疫反应性。
A 新生儿的胰腺组织化学实例，同时检测胰岛素和胰高血糖素。Hoechst 33342用于细胞核的复染。比例尺=80μm。（A1）来自独立妊娠母鼠的n≥6个小鼠/性别的定量数据。值得注意的是雌性而不是雄性后代的胰腺中胰岛素免疫反应性显著降低。数据表示为平均值±SEM。** P<0.01（单向方差分析后的成对比较）。
B 新生小鼠躯干的纵向横截面图，从而通过光片照明显微镜可视化小鼠胰腺。图B1中显示了红色半透明区域。（B1）分别来自成对的对照组和苯丙胺处理的新生小鼠中使用胰岛素标记的胰腺（以虚线包围）。值得注意的是子宫内苯丙胺暴露后，胰岛样结构（箭头）中胰岛素的比例和标记密度降低了。插图显示胰岛的核-壳细胞结构在光学透明的完整组织中得以保留，同时对该组织处理从而检测胰岛素和胰高血糖素。许多周围组织表现出明显的自发荧光。比例尺=1.5 mm。
产前暴露于精神兴奋剂会损害成年后代胰岛素的表达并导致葡萄糖不耐症
如果将精神兴奋剂的作用视为发育延迟，那么胎儿胰岛素分泌和信号传导则可能在以后的成长中得到补偿。此外，精神兴奋剂的作用可以持续出生后的整个成长时期，并使后代在发育中对葡萄糖不耐症/糖尿病敏感。分析6周龄的小鼠后代时，研究者发现β和α细胞数并不受产前药物暴露的影响。这些数据与研究者对体外实验结果的观察以及出生后胰腺中持续的β细胞增殖相符合。然而，对6周龄后代的性别偏好影响进行检查显示，雌鼠的胰岛素免疫反应性显著降低（所有药物处理与生理盐水相比，P<0.05）（图6A和A1），但雄鼠没有出现这种现象（图6A）。同时，胰高血糖素的免疫反应性在性别中不受影响。这些数据也受到Ins2mRNA水平降低的支持。
图6. 产前精神兴奋剂暴露会损害成年后代的葡萄糖稳态。
A，B 药物暴露母体产下的6周龄后代胰岛内胰岛素和胰高血糖素的免疫组织化学检验（A）。性别分配图显示产前药物暴露的雌性后代出现永久性降低胰岛素水平的响应。（A1）来自雌性的代表性图像展示出来，且Hoechst 33342用于细胞核的复染（颜色为灰色）。比例尺=40μm。（B）子宫内暴露于精神兴奋剂的成年后代中Ins2 mRNA的表达持续降低（汇总数据）。（A,B）中的定量数据来自每组小鼠n≥3，且表示为平均值±SD。
C，D 6周龄的雌鼠（C）和雄鼠（D）进行糖耐量测试时的血糖分布。
E，F “曲线面积”（AUC）的定量分析表明，产前暴露于精神兴奋剂的雌鼠出现了葡萄糖不耐症，而仅在苯丙胺处理的雄鼠中表现出显著增加的AUC。
G 1岁的苯丙胺暴露和对照组小鼠在不考虑性别问题时其胰岛素的免疫反应性不再具有差异。（G1）代表性图像；比例尺=65μm。
H 与对照组相比，产前暴露于苯丙胺的1岁雌鼠体重显著减少。
I，J 1岁的雌鼠（I）和雄鼠（J）进行糖耐量测试时的血糖分布。
K AUC表明产前暴露于苯丙胺的雌鼠存在葡萄糖不耐症，而雄鼠不存在这种现象。
数据信息：定量数据根据对照组进行标准化，并表示为平均值±SD（为了清晰起见图C、D、I和J中的SD省略）；分析的n≥3动物/组/性别（每个来自3~4个怀孕母鼠）。***P<0.001，** P<0.01，* P<0.05（单向方差分析后的成对比较）。
研究者接着提出疑问：胰岛素含量的损失是否会影响暴露于精神兴奋剂的后代中葡萄糖的代谢。产前暴露于精神兴奋剂的6周龄的小鼠体重与对照组并无差异。然而，暴露于精神兴奋剂的后代出现葡萄糖不耐症：雌鼠（与生理盐水相比，苯丙胺或可卡因在处理后0、30、60及120分钟时P<0.05；甲基苯丙胺在处理后30分钟时 P<0.05）（图6C）和雄鼠（与生理盐水相比，苯丙胺在处理后0、30—120分钟时P<0.05；甲基苯丙胺在处理后0、30、60、90及120分钟时P<0.05）（图6D）在葡萄糖筛查之前和期间的血糖水平都显著较高。接着，研究者绘制“曲线面积（AUC）”来测试葡萄糖不耐症的相对严重程度，结果发现雌性的表型（所有药物处理，P<0.05）（图6E）比雄性的更为严重（苯丙胺处理，P<0.05）（图6F）。
因此，作者研究了一个1岁大的小鼠队列，该小鼠队列在产前暴露苯丙胺，其中苯丙胺在小鼠6周龄时似乎是最有害的药物。苯丙胺暴露的小鼠胰腺相对于它们在任何一种性别下各自的对照组来说，无论是大小（包括β和α细胞数）还是胰岛素的含量均未降低，然而苯丙胺暴露的雌性小鼠倾向于表现出较低的胰岛素免疫反应性（图6G1和G2）。产前苯丙胺暴露的雌鼠而非雄鼠出现体重降低现象（P<0.01）（图6H）。值得注意的是，有苯丙胺暴露史的所有性别小鼠在休息时均表现为低血糖（图6I和J）。在苯丙胺暴露的雌鼠中，胰岛素释放的第一阶段是正常的。然而，其第二阶段明显变得迟缓（图6I）（对于AUC计算参看图6K）。苯丙胺暴露的雄鼠血糖水平与对照组相当（图6J和K）。总而言之，这些数据证明了拥有产前精神兴奋剂暴露史的成年后代存在永久性的葡萄糖稳态失调。
Pet1/Fev依赖的胰岛素表达失调作为精神兴奋剂作用的候选机制
产妇间歇性摄入违法的精神兴奋剂可能会损害后代一生的葡萄糖代谢，这一事实促使研究者检验药物不良反应的细胞决定因素。刺激β细胞上的5-HT受体显示可以激活Pet1/Fev（一种原型的5-HT能转录因子），从而促进Ins1/2的表达。研究者假设精神兴奋剂引起的5-HT信号转导失调可能会降低Pet1/Fev的表达，从而使其不足以维持胰岛素的表达。在胰腺外植体中，相对于对照组来说苯丙胺（P<0.01）、可卡因（P<0.001）和甲基苯丙胺（P<0.001）显著降低了Pet1/Fev的mRNA水平。相反，5-HT自身并不影响Pet1/Fev的表达。同时，精神兴奋剂和5-HT（所有P<0.01）均降低了Ins2 mRNA的表达，表明精神兴奋剂（SERT参与）与5-HT（受体参与）的作用机制不同。接着，研究者以R=0.83, P<0.001使用相关分析将Pet1/Fev和Ins2的表达联系起来。同时，精神兴奋剂和5-HT均未显著影响胰高血糖素的表达，说明其与Pet1/Fev的表达没有关联。
接下来，研究者探讨了在生物体内基于子宫内精神兴奋剂的暴露是否会发生类似的变化。在6周龄的雌鼠内，产前苯丙胺和可卡因暴露后Pet1/Fev的表达水平降低，并且与Ins1/2的mRNA水平密切相关。这些数据支持了研究者的观点，即精神兴奋剂会损害β细胞中胰岛素产生所必需的转录关卡。
尚不清楚人体内PET/FEV是否与胰岛素（INS）的表达相关（除本文及先前研究的动物模型以外）。因此，研究者使用根据葡萄糖不耐症分级的人类胰岛内的大量mRNA进行分析，显示PET/FEV的表达确实与INS相关（R=0.41，P=4.7e-9），并且其在非糖尿病和2型糖尿病患者贡献的胰岛之间存在差异表达。与此相反，PET/FEV与胰高血糖素（GCG）表达之间的相关性并未达到统计学显著性（R=0.14，P=0.064），表明人体内PET/FEV也参与了生理胰岛素有效性的检验。有趣的是，人体胰岛中SLC18A2的表达与INS而不是GCG呈现负相关性。这些数据并不意外，因为研究者使用单细胞RNA-测序分析重现了人体内α细胞中SLC6A4的优势表达。因此，研究者的结果证实了人类胰岛中单胺在细胞类型上的特定用途。
子宫内苯丙胺暴露后的表观遗传变化
产前暴露于心理药物的后代出现葡萄糖不耐症，这一发现表明苯丙胺处理后的胰腺中出现了表观遗传环境的显著变化。考虑到Pet1/Fev和Ins2表达之间的紧密相关性，一个可能的假设是Pet1/Fev的抑制作用会直接导致严重的胰岛素产生。或者，上游调节基因网络或感受器（比如在调节胞吐作用的水平上）的损害可能是导致终生葡萄糖不耐症的原因。为了通过实验的方法检验这些假设，研究者首先建立一个体外的染色质亲和性分析模型：将INS-1E细胞暴露于苯丙胺3天，然后冲洗3天（以减少药物的急性作用），接着进行样品制备和ATAC-测序分析（图7A）。该实验设计降低了Ins1 mRNA的表达（图7A1）。研究者的数据显示在体外苯丙胺处理后Ins1、Ins2及Pet1/Fev不会出现染色质亲和性的变化（图7A2），因此提出了更间接的调节机制。
图7. 体内及体外苯丙胺处理的表观遗传学变化。
A 苯丙胺处理的INS-1E细胞系的实验设计和（A1）表达质量控制（注意降低的Ins1 mRNA水平）。数据表示为平均值±SD；n=3; * P<0.05（t-检验）。（A2）基因组全览图展示了对照组和苯丙胺处理的INS-1E细胞系之间Ins1、Ins2及Pet1/Fev的ATAC测序平均信号强度。
B UpSet图展示了通过Q截止值为0.01的x2-检验独立获得的基因组的交集。蓝色三角形表示最接近转录起始位点（TSSs）的事件，而红色三角形强调了B（和B1）图中处理相关的差异。（B1）图中展示了基因座（BP）与相关变量（从左到右：基因的基因本体论（GO）术语的数量、离最近TSS的距离、与基因座相关的GO术语的平均存在）之间DNA甲基化分布规律的差异。
C 新生小鼠中（对照组n=6；苯丙胺处理组n=5）Ins1,Ins2和Pet1/Fev（C）以及Lmx1b,Htr1a,Insm1（5-HT信号传导的核心（C1））的DNA甲基化差异。（C2）Gria1和Homer2（谷氨酸信号传导的原型）在DNA甲基化中的性别差异。检测的所有基因的交互式基因组浏览记录可以在UCSC网站（http://bit.ly/AMPHpanDifMeth）上找到。
D 根据RnBeads2.0流程来看，与对照组相比，苯丙胺处理小鼠中最丰富的GO术语与前500的高甲基化（上部）及低甲基化（下部）的启动子相关。红色表示与5-HT信号传导相关的途径。
接下来，作者研究了来自苯丙胺处理后和对照组的所有性别小鼠P0时期胰腺的DNA甲基化情况（图7B和B1）。通过使用methylKit，研究者以性别和苯丙胺处理为变量分别进行了独立检测。研究者提取了六个基因组进行比较，并通过UpSetR可视化发现它们之间没有任何交集的情况。该分析在合并样品的碱基对、启动子水平以及协变量的过度分散校正后重现了相似的结果。有趣的是，苯丙胺处理的雌鼠和苯丙胺处理的雄鼠之间以及苯丙胺处理的雌鼠与对照组雄鼠之间发现了最显著的差异。这些数据表明胰腺细胞特征和功能的表观遗传调控至关重要，并且具有性别依赖性，而产前苯丙胺暴露可以显著改变胰腺的DNA甲基化。研究者的结果还证实Ins1、Ins2及Pet1/Fev不受高甲基化或低甲基化的影响（图7C）。值得注意的是，研究者发现具体胰腺发育基因（Lmx1b,Ism1）的关键调节区域（接近转录起始位点或启动子）的低甲基化状态与Pet1/Fev上游有关，且参与了5-HT相关的通路（Htr1a）（图7C1）。此外，研究者定义了DNA甲基化的性别和苯丙胺处理的依赖性变化，例如Gria1（谷氨酸受体亚基）和Homer2（突触后的支架蛋白）调节对谷氨酸盐的敏感性（图7C2）。尽管研究者分析的样本量构成一个潜在的混淆，但以苯丙胺处理作为变量，“前500名”最受干扰的启动子基因的本体论（GO）富集分析显示了出乎意料的大量途径之间的差异，包括与5-HT相关的基因网络和受影响最严重的调节基因组。这些数据累积表明苯丙胺永久性地解除了5-HT的信号传导，并且影响位于Pet1/Fev和Ins等基因上游分等级的调节基因网络，从而导致终生的胰腺功能障碍。
讨论
葡萄糖的稳态通过内分泌胰腺的激素释放来维持。如果此功能受损，那么人体将失去调节血糖水平的能力，这是形成糖尿病（包括1型和2型）的原因。本文中，研究者展示了产前暴露于通常滥用的精神兴奋剂（苯丙胺、可卡因以及甲基苯丙胺）导致后代的葡萄糖稳态永久性受损，从而产生葡萄糖不耐症。早前报道精神兴奋剂在大脑中具有细胞毒性的作用。然而，研究者展示了精神兴奋剂以已知剂量可引起小鼠的行为影响，但不改变子宫内小鼠胰岛的细胞结构。相反，这些药物会影响后代在成年时的能力。研究者关于5-HT信号传导和Pet1/Fev表达的发现与产前暴露于可卡因的小鼠大脑中5-HT水平的永久性降低这一现象一致。然而，研究者发现Pet1/Fev自身的表达并不受精神兴奋剂的直接影响。相反，许多驱动胰腺发育规律（尤其是β细胞分化）的调节基因和原型转录因子在DNA甲基化水平上经历了长期且具有性别特异性的表观遗传修饰，因此将会对胰岛素的生产施加终生表达失调的影响。
目前精神兴奋剂的药理学进行了深入的研究，主要是因为许多“合法兴奋剂”和合成化合物进入了娱乐市场。尽管苯丙胺、甲基苯丙胺（5~30h）和可卡因（0.7~1.5h）的生理学半衰期显著不同，但它们通过单胺影响细胞间通讯，并且对VMAT2和细胞表面再摄取转运蛋白（NET、DAT和SERT）的亲和力不同。这些药物具有强大的影响心理状态的作用，因此应该主要关注神经系统。同样地，考虑到胰腺是另一个由5-HT-、DA-和NE-介导的合法目标，包括α和β细胞之间的旁分泌细胞交流、激素释放的自动调节反馈以及激素输出的交感神经控制。同时精神兴奋剂还存在更间接的作用，即精神兴奋剂的食欲抑制作用也表明神经和内分泌中心之间的关系决定了食物的摄取，而胰腺是神经末梢区域控制能量稳态的中枢。
通过使用RNA测序，研究者发现人类胰腺β细胞中表达的是SERT（SLC6A4），而不是NET（SLC6A2）或DAT（SLC6A3），这一点也在原始小鼠的β细胞和INS-1E细胞系中得到了验证。[3H]5-HT摄取实验在功能上证实了这一发现。尽管人类和小鼠的表达谱在很多水平上都一致，但研究者也要警惕龋齿动物的直接翻译数据，因为物种之间存在关键差异，比如VMAT2的表达。当研究者对5-HT信号传导的发育生物学结果进行合理解释时，应该考虑到：首先，发育过程中和新生儿的β细胞内都存在“5-HT信号传导盒”（即代谢酶（VMAT2、5-HT受体和SERT）的同时表达）。这使人联想到5-HT信号传导的早期神经组织，包括大脑中甚至在血清素神经元出现之前就存在的SERT（SERT和血清素神经元分别在妊娠第8周和15周出现）。此外，怀孕期间β细胞中色氨酸羟化酶（TPH）表达的逐渐增加对于促进细胞增殖至关重要。其次，研究者展示了5-HT信号可以使用多种5-HT受体，在其次级转化过程中的胰腺原基体产生细胞谱系中发挥作用。研究者的人类胎儿分析演示了在妊娠前三个月中HTR1B/1F、HTR2A/2B/2C和HTR3E mRNA的表达。这些受体可以通过单细胞RNA测序精确地分配给α和β细胞，从而区分在人类β细胞中占主导地位的HTFR1F（也许是HTFR2B）。这种受体的多样性已经通过组织化学法得到证实，也与先前的小鼠研究发现一致，并且证实了人体中HTR1F介导的β到α细胞传导，以及Ca2+依赖的基于HTR2B或HTR3激活的胰岛素释放的自动调节。第三，循环的5-HT有效性受到来源于胎儿和母体5-HT的调节，后者包括来自色氨酸前体在胎盘5-HT的瞬时产生。因此，研究者认为本文中看到的精神兴奋剂效果可能在体内依赖于间接作用（由于抑制母体的食物摄取，随后葡萄糖耗竭并且胎盘失调）和直接成分作用（胰岛发育的重编程）。由于精神兴奋剂穿过胎盘，抑制SERT的表达和活性，并且仅在β细胞中引起对Pet1/Fev和Ins表达的永久性修饰（值得注意的是α细胞中没有任何参数出现明显偏离），研究者提出了（甲基）苯丙胺和可卡因可以直接重新编程胎儿胰腺的概念。
即使将SERT作为精神兴奋剂的单独分子靶标，Ca2+成像显示出它们的急性施用迅速且显著地降低了β细胞内葡萄糖响应性。每种药物都以很广泛地浓度范围进行了测试，并且显示出Ca2+波动频率与剂量响应之间的关系。尤其是对于5-HT自身，Ca2+波动频率的降低与其振幅的增加相吻合，研究者将其解释为亚阈值Ca2+瞬时的动态复位和整合从而产生更大的响应。鉴于β细胞中的Ca2+峰值被认为是引发胞吐作用的指标，研究者认为调节β细胞中的SERT，可以强有力地改变胰岛素释放的时间动态性。更广泛地说，孕期苯丙胺、甲基苯丙胺和可卡因作用的病理生理迹象是一致的，都是减少β细胞中的胰岛素含量。小鼠中依他普仑（一种选择性的SERT抑制剂）和遗传性Slc6a4基因的消融减轻了苯丙胺的作用，这一事实说明SERT的直接参与而不是类似5-HTR1A或5-HTR1B的变构调节。在本研究的体外研究中，这也是可以想象的，在该研究中，药物的浴洗灌流法可能会限制细胞外5-HT的积累，并使5-HT自身受体机制的参与不那么突出。
在子宫内，精神兴奋剂的暴露会使影响后代中内分泌胰腺的激素释放。研究者对于最常见非法药物的表观遗传修饰的实验证据并不意外。特别是对于孕期产妇滥用（甲基）苯丙胺而言，雌性而非雄性后代在人类和动物模型中均表现出严重缺陷。组蛋白血清素化作为一种新的表观遗传机制出现，表明它限制了细胞分化。因此，精神兴奋剂使胎儿对细胞内5-HT可用性的失调可能造成了β细胞的发育延迟，这一现象受到研究者的动物模型内NeuroD1和 Nkx6.1转录因子减少的支持。确实，研究者发现在胰腺外植体和INS-1E细胞系中5-HT加载后，长期存在于细胞内5-HT出现积累，因为其被苯丙胺堵塞了。这种现象的合理解释是，在转谷氨酰胺酶催化的反应中5-HT与蛋白质的谷氨酰胺残基属于共价结合。SERT介导5-HT加载的终生变化可能具有病理学意义，因为残留的5-HT通过诸如Rab3a和Rab27a尿苷三磷酸酶的血清素化来实现胰岛素分泌的限速反馈，这对于SNARE的装配和引发囊泡对接至关重要。考虑到DNA高甲基化是通过GO途径分析基因中分配给5-HT的释放过程中最为常见的，且5-HE与胰岛素从成熟的β细胞中共同释放，研究者赞成了这样的假说，即减少的蛋白质血清素化将不良的精神兴奋剂作用与受影响后代中β细胞内终生且持续存在的表观遗传修饰联系起来了。
总而言之，研究者通过将孕期产妇滥用精神兴奋剂与后代一生中葡萄糖稳态的受损联系起来，从而确定了一种病理学原理。考虑到年轻人（包括育龄期妇女）对毒品消费的持续增长，研究者告诫妊娠期妇女不要接触苯丙胺和可卡因等“5-HT修饰药物”，以最大程度地减少对胎儿的伤害。
评论
滥用精神兴奋剂是一个主要的社会经济负担，影响着全世界多达5000万人。人口学分析显示，育龄期的怀孕妇女中有5.4%滥用了违法药物，这突出说明了孕期精神兴奋剂暴露是引起公众广泛关注的问题。本文针对产前精神兴奋剂暴露对后代产生的不良影响进行了一个深入探究，发现在子宫内暴露于精神兴奋剂的后代胰腺内β细胞产生胰岛素的能力受损，且即使在成年时期也存在葡萄糖稳态失调现象。同时，研究者结合小鼠模型、分子生物学等手段也探究了精神兴奋剂产生不良影响的可能作用机制。本研究将孕期产妇滥用精神兴奋剂与后代终生的葡萄糖稳态受损联系起来，这极大地警醒了妊娠期妇女远离苯丙胺、可卡因等精神兴奋剂药物，以保护后代的健康！
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