编译：凉风月，编辑：十九、江舜尧。
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茶是世界上消费最多的非酒精性饮料，而虫害大大影响了茶叶的产量和质量。研究者认为，前人对茶绿叶蝉与茶树的相互作用关系的研究多是采摘下的茶叶，而茶叶对虫害的反应与活体植物不同。为了探究茶树活体上茶叶对虫害的反应以及新陈代谢和防御反应背后的分子机制，研究者以温室培养的茶树(Camellia sinensis cv. “Jinxuan”)为材料，分别作了茶绿叶蝉采食（LD）、机械损伤处理（MD）和无损伤对照（CK）三组，利用两两相互作用研究茶树对茶绿叶蝉攻击的响应。研究者首先对茶树做了代谢组和转录组的联合分析，以确定可能对赋予昆虫抗性很重要的特殊代谢物、基因和代谢途径，然后测定了茶绿叶蝉取食对茶树叶蜡成分和激素水平的影响，最后讨论了可能与调节防御反应相关的激素信号和转录因子家族。结果显示，茶绿叶蝉取食在被侵染的茶树中引发了剧烈的转录组和代谢组重编程，苯丙烷类和类黄酮生物合成相关基因的上调，黄酮类化合物积累到显着水平。编码角质蜡烷烃生物合成的基因被大量诱导，茶叶蜡质中C29烷烃含量增加，并有两种防御植物激素SA和JA产生，其中SA介导的途径似乎在防御反应中起着更主要的作用。该研究对后续利用多重组学方法比较抗病和感病茶树基因型对茶绿叶蝉采食后的反应，进一步理解茶树抗病机制有重要参考意义。
论文ID
原文：Defensive Responses of Tea Plants(Camellia sinensis) Against Tea Green LeafhopperAttack: A Multi-Omics Study
译名：茶树对茶绿叶蝉攻击的防御反应：多组学研究
期刊：Frontiers in Plant Science
IF: 4.106
发表时间：2020.1.17
通讯作者：俞晓敏
通讯作者单位：福建农林大学FAFU-UCR园艺生物学与代谢组学联合中心，福建省海峡应用植物系统生物学福建省重点实验室
DOI号：doi.org/10.3389/fpls.2019.01705
实验设计
本研究以福建农林大学温室内培育的26株两年生“jinxuan”茶树为研究对象，分别取16株用约100只茶绿叶蝉进行持续三周的虫害处理，获取受叶蝉损害的茶叶样本（LD）；用50um的微毛细管针模拟上颌骨处理5株植物的芽和叶片，两天一次，处理三周，记为机械损坏样品（MD）；其余5株为对照组（CK），所有样株均用尼龙网覆盖，防止其他昆虫干扰。从每种处理中收集1个芽2片叶，每个样品3个重复，共27个样本，首先基于UPLC-QTOF MS的代谢组学分析，获得各种代谢组分的种类和量，接着利用UPLC-XEVO TQ-S MS对植物激素进行测量，然后进行RNA-Seq，并挑选与代谢和激素相关的位点进行DEGS的qRT-PCR验证，最后再从LD组和CK组分别取3个样本，解刨、混合并进行蜡质成分分析。
结果
1 茶绿叶蝉侵染提高了受侵染植物中防御性专门代谢产物的产量
以机械损伤茶树叶片(MD组)和未受侵染茶树叶片(CK组)为对照,了解不同处理引起的代谢组变化。利用UPLC-QTOFMS对茶叶样品进行了ESI+和ESI-模式下的非靶向代谢组学分析，分别检测到2381和906个质量/保留时间特征(补充表S2)。与其他茶树品种一样，“jinxuan”茶树品种含有丰富的黄烷醇、原花青素、黄酮苷和嘌呤生物碱等常见成分(补充表S2)。对结果代谢物数据的PCA分析表明，在两种模式下，茶绿叶蝉受害组(LD组)与MD组和CK组都有明显的分离，而后两组没有很好地分开(图1A，B)。PLS-DA模型的计分图显示不同处理之间有明显的分离(数据表1中的补充图S2)。模型参数为：拟合优度R2Y=0.883(esi+)和0.864(esi-)，预测能力Q2=0.569(esi+)和0.562(esi-)。
以VIP>1和p<0.05进行过滤，发现205和50个分子特征在各自的模式下不同地累积(补充表S2)。利用UPLC-QqQ MS(补充表S3)测定了茶树中3种重要代谢物-儿茶素、咖啡因和氨基酸的绝对含量，并进行了非靶向性分析。去除了在碰撞诱导解离产生的模式和子离子中检测到的重复信号后，结合非靶向和靶向分析检测了123个DEM，其中25个DEM根据准确的质量和MS/MS碎片模式与真实的标准和参考文献进行了比较，从中鉴定了25个DEM(表1)，划分为8个代谢物类，包括氨基酸和肽、可水解单宁、黄烷醇、黄酮苷、原花青素和糖苷结合挥发物，这些代谢物包括氨基酸和多肽、水解单宁、黄烷醇、黄酮苷、黄酮苷、原花青素和糖苷结合挥发物。
所鉴定的DEM用热图来展示，可以看到茶绿叶蝉取食明显增加了茶叶中苯丙酮和类黄酮途径的代谢物的产生(图2)。例如，主要黄烷醇(EGCG，EGC，ECG，EC，EGCG3“Me，ECG3”Me，ECG3“Me，和表阿福豆素-3-O-没食子酸酯)在LD组明显增加。三种原花青素(EGC-ECG二聚体、EC-ECG二聚体和前啡肽A2 3'-没食子酸酯)、一种黄酮(三氯乙酸)、一种黄酮苷(山奈酚3-O-葡萄糖基芦丁苷)和一种可水解单宁(甲基6-月桂酰基-b-D-葡萄糖)的积累规律相似。除黄酮组成的变化外，还诱导了4种糖苷结合的挥发物，包括氧化芳樟醇的2个异构体、苄基报春花糖苷和芳樟醇报春花糖苷，它们都是由叶食草引起的。这四种糖苷结合的挥发物包括两个芳樟醇氧化物报春花苷异构体、苄基报春花苷和芳樟醇报春花糖苷。
相反，LD组大大降低了谷胱甘肽的产量，几乎低于检测下限，并导致总氨基酸含量减少了59%。茶叶中的主要氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的水平都有所下降(图2；补充表S3)。咖啡因对茶绿叶蝉采食或机械损伤的反应没有显著增加(补充表S3)。MD组除5种黄酮类化合物(山茶素B、异牡荆素葡萄糖苷、红花酰胺6，7-二葡萄糖苷、山奈酚脱氧己糖-己糖脱氧己糖和柚皮素二葡萄糖苷)积累水平最高外，其余DEM含量在CK和LD组间普遍存在差异。
2 茶绿叶蝉侵染植株中SA和JA含量的增加
利用UPLC-QqQ MS技术研究了茶树绿叶蝉为害对茶树体内JA、SA和ABA含量变化的影响。受叶片食草性影响最大的植物激素是SA，与MD和CK相比，LD样品的SA水平显著升高(图3A)。LD组的JA水平与对照组相比呈上升趋势，但在统计学上并不显著(图3B)。不同处理组之间ABA水平保持相对稳定(图3C)。
3 茶绿叶蝉在受侵染植物中引起剧烈的转录重编程
对上述样品进行了比较转录组学分析，使用归一化基因计数数据进行的PCA分析表明，LD组与MD组和CK组分别聚在一起，而后两组没有很好地分开，第一主成分和第二主成分分别解释了总方差的46%和19%(图4A)。这一结果与利用代谢物数据进行的主成分分析相一致，揭示了叶片食草性诱导的基因表达发生了剧烈的重新编程。不同组之间的DEGS(p<0.05和|log2FC|>0.5)的比较，如维恩图所示，反映了由不同压力引发的基因表达的共同和特异性变化(图4B)。与未损伤对照组相比，LD组和MD组分别有2876个(1826个上调，1050个下调)和588个(384个上调，204个下调)基因表达差异。与MD组相比，LD组有2019个DEG，其中上调1395个，下调624个。在三对比较中，只有86个基因受共同调控，而45.5%(1309/2876)和26.0%(153/588)的DEGS分别受茶绿叶蝉取食和机械损伤的专一性调控。总体而言，这表明茶绿叶蝉取食不仅诱导了比机械伤害更强烈的转录水平的变化，而且导致了更多的上调而不是下调的基因。研究者选择与黄酮、茶氨酸、萜类、茉莉酸和蜡类生物合成有关的13种化合物进行qRT-PCR。结果表明，所有测试基因的表达模式与RNA-Seq结果一致，表明RNA-Seq结果是可靠的(补充图1中的S3)。
4 茶绿叶蝉侵染诱导被侵染植物的防御反应
对DEGS进行KEGG和GO分类富集，探索机械损伤和昆虫取食对茶叶中过度表达的途径和生物学功能的影响。当MD与CK比较时，最丰富的途径是“类黄酮生物合成”、“苯丙烷类生物合成”、“硫胺素代谢”、“氮代谢”、“氨基糖和核苷酸糖代谢”以及“戊糖和葡萄糖醛酸相互转化”(图4C)。GO差异分析表明，与碳、氮代谢、硫化物和离子的运输以及对氧化应激反应有关的基因上调，而参与细胞分解代谢过程的基因下调(补充表S5和S6)。
在“LD与CK”比较中，与取食诱导防御相关的过度表达途径包括“类黄酮生物合成”、“苯丙氨酸代谢”、“苯丙氨酸生物合成”、“植物-病原菌相互作用”和“苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成”(图4D)。此外，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在虫害茶叶中相当活跃。“苯丙氨酸代谢”、“苯丙素生物合成”、“类黄酮生物合成”、“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”途径与儿茶素、原花青素、黄酮和黄酮醇的生物合成密切相关。因此，昆虫侵袭时黄酮类化合物产量的增加很可能是这些途径诱导基因表达的结果。GO分析表明，上调的DEGS主要与碳氮代谢、芳香族氨基酸、脂质、类固醇和硫化物的生物合成、蛋白质修饰以及氨基酸、有机酸和阴离子的运输有关(补充表S7)。另一方面，富集的GO类包括主要与光合作用、细胞动态平衡、二元酸代谢过程、RNA聚腺苷化、胺生物合成过程和小分子生物合成过程相关的基因(补充表S8)。LD和MD之间的进一步比较表明，LD中过多的KEGG术语主要涉及植物与病原菌的相互作用、角质、软木脂和蜡的生物合成、类黄酮的生物合成、生物碱的生物合成、植物激素信号转导、MAPK信号通路以及氨基酸、甘油脂和甘油磷脂的代谢(图4e)。这些途径可能在茶树对绿叶蝉侵染的抗性中起着关键作用。通过GO富集分析，鉴定出81个上调的GO类别和17个下调的GO类别，LD中上调的GO类别主要包括与几丁质、多糖、脂类和脂肪酸的生物合成、蛋白质修饰和有机酸运输有关的基因(补充表S9)，下调的GO类别包含与胺代谢过程、三羧酸代谢过程和离子转运有关的基因(补充表S10)。
5 DEGS分析揭示了参与茶绿叶蝉防御反应的重要基因
对可能对茶树对叶片食草病的防御反应具有重要意义的DEG进行了详细的分析(表2)。植物激素信号网络通常在昆虫取食后被激活，进而激活一系列下游反应。研究者发现参与植物激素生物合成和感知的基因受到茶绿叶蝉取食的显著影响。生长素反应GH3基因家族、生长素反应蛋白IAA、茉莉酸ZIM结构域蛋白、细胞周期素D3、双组分反应调节因子ARR-A家族和Della蛋白在“LD与CK”和“LD与MD”比较中均上调。
在LD中上调的基因中，数目最多的是与植物-病原菌相互作用有关的基因。Ca2+在介导细胞对生物或非生物刺激的反应中发挥着重要作用。作为胁迫信号网络的重要组成部分，编码钙结合蛋白、钙依赖蛋白激酶和钙调蛋白等常见钙感受器蛋白的基因在本研究中表现出显著的诱导作用，对茶绿叶蝉取食的抗性或伤害防御起到了积极的作用(表2)。这一类的其他相关蛋白包括MAPK、抗病蛋白RPM1、RPM1相互作用蛋白、几丁质激发子受体激酶、增强的疾病敏感性蛋白、呼吸胸腺氧化酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PBS1。此外，LD组角质、软木脂和蜡生物合成途径中的基因，如醛脱羧酶、脂肪酸ω-羟化酶和ω-羟基帕米酸O-阿魏酰基转移酶的上调程度较高(表2)。编码乙醛脱羧酶的转录本TEA008365的变化最大，超过20倍，这是CER1的同源物，并通过qRT-PCR(数据表1中的补充图S3)验证了结果。这种酶催化脂肪醛的脱羰反应，产生有助于角质蜡形成的长链碳氢化合物，角质蜡是植物适应生物和非生物胁迫的活性成分，被认为与植物-昆虫和植物-病原体的相互作用有关。因此，在昆虫取食后该转录本的大量诱导可能表明它在防御草食昆虫方面具有重要作用。
最后，在儿茶素生物合成途径中，编码关键代谢酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)、查尔酮异构酶(CHI)、类黄酮3'-羟化酶(F3’H)、黄酮3-羟化酶(F3H)、黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)和亮蒽等基因的表达。Pearson相关分析表明，上述基因的转录本水平与主要黄烷醇和其他几种黄酮类化合物的含量之间存在很高的相关系数(补充表S11)。例如，PAL(TEA014166)的表达模式与ECG、EC-ECG二聚体、EGC-ECG二聚体和山奈酚3-O-葡萄糖基芦丁苷的含量显著相关(p<0.05)。4CL(TEA034012)的表达模式与EGCG3“Me、ECG3”Me、EC、表没食子儿茶素没食子酸酯和曲西汀的含量呈显著正相关(p<0.05)。此外，苯丙烷途径中的肉桂醇脱氢酶、过氧化物酶、莽草酸O-羟基肉桂酰基转移酶和咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶基因在LD中也有较高的诱导。
通过 GC-MS和GC-FID 分析了叶蝉受损叶片（LD）和未受损对照（CK）的表皮蜡成分来进一步评估CER1诱导对蜡生物合成的影响。数据表1的补充图S4中显示了茶样品和C 10 -C 40烷烃标准混合物的代表性色谱图。总共从CK样品的蜡混合物中检出354-393种化合物（n=3），从LD样品的蜡混合物中检测出397-414种化合物（n=3）（补充表S12）。两组茶叶样品中的蜡混合物主要由脂肪酸，烷烃，烯烃，醛和伯醇组成（表3）。与CK相比，LD叶片每单位叶面积的蜡载量无明显变化。由于CER1主要参与超长链（VLC）烷烃的生物合成，因此研究者特别关注LD和CK叶蜡之间VLC烷烃水平的差异。对烷烃馏分中链长分布的进一步分析表明，它们的特征是奇数同系物，范围从C25至C37。C29烷烃显着增加（pLD中的<0.05），与CK相比增加了43.6％。有趣的是，伯醇（C28，C30和C32）也大量增加，而C28醛减少了。其他烷烃和蜡组分的影响很小（图5）。
7 与胁迫反应相关的主要转录因子家族在茶绿叶蝉侵染植株中的过度表达
转录因子(TF)是主要的调节因子，协调植物发育和反应的许多不同方面的调控。由于转录重编程主要由转录因子控制，因此研究者试图确定不同处理组之间差异表达的因子。如表4所示，LD与CK的比较发现了228个差异表达的TF，其中153个上调，75个下调。LD和MD比较发现213个差异表达的TF，其中138个上调，75个下调。相反，只有31种TF在机械损伤方面表现出不同的丰度。主要的TF家族，如AP2/ERF、bHLH、MYB、NAC、WRKY和bZIP被证明与防御信号密切相关。研究者发现在LD中高表达成员最多的TF家族是WRKY(24个)、AR2/ERF(24个)、bHLH(18个)、NAC(10个)以及GRAS(10个)。WRKY可能作为SA途径的调节因子，是最大和最显著的过度表达的TF组，这一组中所有已鉴定的DEG都被完全上调(表4)。同样被过度表达的是AP2/ERF家族，它是JA途径的ERF分支的调节因子。该家系中有24个基因表达上调，10个基因表达下调。MYC2 TF属于bHLH家族，是JA信号通路的主要调节者。4个MYC2编码转录本，即TEA009193、TEA012449、TEA016380和TEA019380，对昆虫取食的反应比对机械伤害的反应更强烈。同样，NAC和GRAS TF家族成员NAC90、NAC2、SCL21和SCL33在LD中表达显著上调至更高水平。这些因子可能潜在地增强了茶树对茶绿叶蝉的抗性。
讨论
为了剖析茶树与茶绿叶蝉之间的相互作用，本研究描述了茶树品种“jinxuan” 遭茶绿叶蝉取食过程中的综合反应。进行了代谢组和转录组图谱的全面比较，并辅以叶蜡成分和植物激素的变化分析。重点讨论了昆虫食草性诱导的植物防卫反应基因和代谢产物，以及激素信号串扰对诱导昆虫反应的潜在影响。
结果表明，茶绿叶蝉在茶树上的取食明显地触发了茶树的直接防御反应，包括诱导苯丙素和类黄酮途径的基因表达，促进类黄酮的产生，促进蜡质的生物合成和防御相关蛋白的积累。丙氨酸代谢、苯丙烷类生物合成和类黄酮生物合成是茶绿叶蝉取食后茶树中最丰富的途径(图4)。昆虫取食提高了与苯丙烷/类黄酮生物合成有关的关键代谢酶PAL、4CL、CHI、F3`H、F3H、FLS、DFR和LAR的表达(表2)。因此，无论取食方式如何，普遍上调苯丙烷类和类黄酮途径似乎是茶树面对虫害时常用的策略。与基因表达分析相关联的是，儿茶素、原花青素二聚体、黄酮苷、黄酮苷和水解单宁等特征黄酮类化合物在茶绿叶蝉侵染过程中的丰度显著增加(图2)，进一步验证了黄酮类化合物在防御茶绿叶蝉取食中的关键作用。昆虫长时间取食可能会引发更强烈的防御基因表达变化，从而导致更多防御化合物的积累。黄酮类化合物由于其显著的结构和功能多样性，在植物-昆虫相互作用中发挥着广泛的重要功能。
对本研究所采茶叶蜡质成分的初步分析表明，与对照相比，LD中C29烷烃的比例显着增加，而其他VLC烷烃含量变化不大。可能是差异表达的CER1同源物参与了VLC烷烃的生物合成，并可能主要参与了茶树C29烷烃的生物合成。茶树VLC烷烃生物合成途径有待进一步研究，以确定在这一途径中过度表达的基因是否能增强茶树对草食性昆虫的抵抗力。
在茶绿叶蝉取食的茶树上，SA水平显著增加，而JA水平略有增加(图3)，这似乎表明SA和JA途径是同时诱导的。本研究中茶绿叶蝉对茉莉酸的诱导水平较低，可能是由于采用了较长的昆虫处理时间。在识别入侵者之后，迅速而有效地诱导防御激素对于植物启动防御反应是至关重要的。在与昆虫的最初接触中，植物通常经历防御激素产生的快速激增，在持续的昆虫侵袭期间，其水平通常被观察到趋于平稳或下降。一般认为JA主要诱导对组织损伤昆虫、坏死性病原菌和伤害的抗性，而SA主要诱导对生物营养性病原菌和昆虫的抗性，造成的伤害很小。在植物中，SA和JA防御途径通常是相互对抗的，作为一种面对不同入侵者的适应策略，已经在多个研究中被证实。
在对茶绿叶蝉侵染反应中上调的激素途径中，SA介导的途径似乎起着最主要的作用，因为负责从肉桂酸合成SA的PAL基因的几个同源基因显著上调，可能参与SA信号转导的WRKY TF单独过表达，SA水平显著升高。在这些途径中，SA介导的途径似乎起着最主要的作用，因为负责从肉桂酸合成SA的PAL基因的几个同源基因显著上调，可能参与SA信号转导的WRKY TF单独过表达，SA水平显著升高。茶绿叶蝉的若虫和成虫会用口针刺穿和摄取幼芽中的植物液体，对组织的损害很小，因此，茶绿叶蝉激活SA途径的模式与其他刺吸性昆虫中通常观察到的模式一致。在本研究中，用于模拟刺吸性昆虫攻击的微毛细管针的持续伤害并没有增加茶树中SA的产量(图3)。这一事实可能表明茶绿叶蝉中存在未知的激发子，它们导致茶树对植物激素的不同反应。
另一方面，SA通路的激活有利于茶绿叶蝉的表现，而不是作为对其的有效防御，这个现象在其他与昆虫相互作用的各种植物中也有记录。例如，短脉叶螨对SA生物合成和信号转导缺陷的拟南芥突变体的产卵作用低于野生型拟南芥，尽管在野生型拟南芥中这种昆虫侵染可以同时诱导SA和JA的产生。
SA和JA信号通路之间的相互作用是高度复杂的，它们或拮抗或协同地影响不同植物的防御反应。鉴于不同生态型的茶树品种对同一种昆虫的反应可能不同，利用抗病和感病茶树品种进行比较，进一步探讨SA-JA串扰在茶树抗绿叶蝉机理中的功能相关性十分必要。
防御性特征一直被认为是植物以牺牲生长和繁殖等其他植物功能为代价获得的。当受到昆虫或病原体的攻击时，植物的新陈代谢通常被重新编程，以增强专门化的新陈代谢，以抵御入侵者，而同时初级新陈代谢往往受到抑制。我们发现茶绿叶蝉取食下调了光合作用、细胞稳态、RNA多腺苷基化、胺代谢等过程，为防御和生长之间的权衡提供了证据。此外，虫害茶叶中谷胱甘肽含量显著降低，总氨基酸(主要是茶氨酸和谷氨酸)含量降低59%。植物的氨基氮状况对昆虫的氮代谢有很大的影响，因为吸食昆虫的食物来自韧皮部汁液，这是一种被认为是缺氮的组织。这些植食性昆虫中N养分的有效性反过来影响它们的生长和繁殖。因此，茶叶中氨基酸和谷胱甘肽浓度的大幅下降可能会对昆虫的行为产生很大的负面影响，并可能阻碍进一步的取食。这可能代表了一种提高叶片对茶绿叶蝉侵染抗性的策略，这一可能性有待进一步研究。另一方面，谷胱甘肽已多次被报道在植物对生物和非生物胁迫的反应中发挥重要作用。叶食后谷胱甘肽含量的明显降低是否会对茶树的抗逆性产生负面影响，还有待研究。
结论
综上所述，本研究都结果全面概述了茶树对茶绿叶蝉的转录、代谢和激素反应，发现在被茶绿叶蝉取食的茶树中引发了剧烈的转录组和代谢组重编程。由于苯丙烷类和类黄酮生物合成相关基因的上调，在遭受叶蝉取食的茶叶中，黄酮类化合物积累到显着水平，它们是诱导防御昆虫食草性疾病的主要贡献者。大量诱导编码角质蜡烷烃生物合成的基因，导致茶叶蜡质中C29烷烃含量增加，可能在增强抗性中起关键作用。此外，茶绿叶蝉取食增加了两种防御植物激素SA和JA的产生，其中SA介导的途径似乎在防御反应中起着更主要的作用。后续利用多重组学方法比较抗病和感病茶树基因型对茶树绿叶蝉采食后的反应，无疑将有助于更好地理解抗病机制。
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