编译：大南瓜，编辑：十九、江舜尧。
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导读在过去的几年中，基因组技术被用于人体样本多种多样的研究，尤其在转录组领域，其反映了基因在不同的生命阶段，不同生理状态，不同组织类型以及不同环境条件表达的情况。本文中，研究人员通过对来自四个独立数据群的2202个大脑样本（包括皮层，海马和小脑三种脑区）进行系统综合分析，并将这些样本分为不同的年龄阶段（从5-10岁婴幼儿到100岁的老年人）。首先，确定了与年龄变化相关的来自皮层的1148个基因，海马中的874个基因以及在小脑中的657个基因。根据γ-rank相关性分析发现，其中的某些基因的表达随着年龄的增长具有显著的相关性。接下来，研究人员发现在大脑皮层和海马区域之间有258个基因明显重叠，大脑皮层，海马和小脑三个脑区之间有63个基因重叠；功能富集分析发现，参与应激反应以及免疫反应的基因均上调，而参与突触，神经传导以及钙信号传导的基因均下调。对脑中不同细胞类型进行分析后发现，在生命的早期阶段，神经元细胞活性增加，而在老年阶段，神经元细胞活性降低；转录因子的分析中发现，参与大脑皮层与海马区域共有的258个基因的特征转录因子有MEF2(A,D)，PDX1，FOSL(1,2)和RFX(5,1)。最后，研究人员利用深度神经网络算法建立了基于衰老特征的分子生物标记物对生物年龄进行预测，该预测方式相对于已有的预测器而言，有着更高的准确度以及可信度。
原名：Transcriptomic landscape, gene signatures and regulatory profile of aging in the human brain
译名：人脑衰老的转录组图谱，基因特征和调控轮廓
期刊：BBA - Gene Regulatory Mechanisms
IF: 6.525
发表时间：2020.1.24
通讯作者：Javier De Las Rivas
通讯作者单位：西班牙萨拉曼卡大学生物信息学和功能基因组学组
DOI号：10.1016/j.bbagrm.2020.194491
本文选取了GEO数据库中自2011年至2014年分别发表在nature，neurobiological disease，nature communication以及neurobiological aging中的四篇文献，数据库中得到了2202个由大脑皮层，海马以及小脑组成的转录组数据，作者将这些数据按年龄阶段从幼儿（D0）到老年人（D7,D8,D9）进行了分类（表1）。首先，作者对来自这四个数据库的样本基于affy和RMA算法进行了归一化，对这些数据的不同年龄阶段的差异表达进行相关性分析，进而线性回归，并且将每个年龄段与相邻十年进行分析，计算每当年龄增长时，基因的表达变化及相应p值，得出与年龄变化的相关性较高的基因。接下来，在确定属于大脑皮层，海马以及小脑分别与年龄相关的特征基因后，对它们进行了GO，KEGG通路富集分析，从而确定了这些与年龄变化相关的基因，参与了什么样的代谢通路与疾病发生过程。在对所分析的大脑的三个脑区的与衰老相关的基因取交集后，作者通过标准化富集分数进一步分析了这些基因的启动子结合部位进而确定了启动子；此外，作者利用脑中不同细胞的特征基因对将分析数据中的细胞分为了神经元细胞，星形胶质细胞以及小胶质细胞。将人的一生大致分为了青年时期（1-39岁）以及老年时期（50-100岁），分析这两个年龄组脑中的细胞类型随着年龄的变化是否存在异同。最后，作者利用所分析出来与衰老相关的基因表达信息，建立了对生物年龄预测的深度学习算法，深度学习算法输出的是一个基于大脑年龄预测的生物年龄，作者对此算法进行了验证。表1 不同年龄阶段的人类大脑样本的转录组的数据集概况
1 使用t-SNE比较来自大脑三个区域的转录组样本
首先作者对来自四个数据集的样本进行了简要分析，数据集1包括大脑皮层429个样本，海马区域35个样本，小脑区域34个样本，而数据集3包括大脑皮层374个样本，海马121个样本和小脑130个样本。利用t-SNE非线性降维技术对数据集1（图1A）和数据集3（图1B）可视化。结果显示，大脑的三个区域中，大脑皮层与海马的转录组相当相似，而大脑皮层，海马这一个整体和小脑区域分离。图1 利用t-SNE分析来自两个数据集的人类大脑样本的整个转录组信号
2 综合分析不同年龄阶段脑中基因的表达变化和趋势
为了探究人类大脑的转录组特点以及基因调控与衰老之间的关系，作者将四个数据集的结果进行了整合，对每个数据集都进行了标准化处理。每个数据集相同脑区的基因进行了独立分析，分析与年龄阶段呈现一致的上调或下调的基因；接下来进行结合分析，寻找与年龄变化有显著差异的基因，通过此种方法，确定了与年龄变化呈显著相关的1148个大脑皮层中表达的基因，874个海马中表达的基因以及657个小脑中表达的基因。通过γ相关性与设置阈值为0.01的p值，对这些显著相关的变化基因进行了进一步分析。最终得到皮层的信号包括1148个基因（456个上调，692个下调），海马中信号包括874个基因（546个上调，382个下调），以及小脑的信号包括657个基因（323个上调，334个下调）。图2 人类大脑皮层中衰老过程中的基因表达特点
图3 人类大脑皮层中检测到的主要基因在四个数据集中的共表达趋势
接下来对得到的每个基因在各个阶段的表达轨迹进行了完整的分析，通过这种方法，作者得到了两种基因类型，一类是在生命的渐进阶段稳定增加表达的基因，一类是随着年龄增长反而表达减少的基因。在这中间，作者找到了在四个数据集中一致的都随着年龄增长显著增加的一个基因HLA-DPA1（图2A,B,C,D），它是主要组织相容复合体II的成员，在免疫系统中起着重要的作用，负责呈递细胞外蛋白的抗原肽。不仅如此，HLA蛋白家族的其他成员，HLA-DMB，HLA-DPB1，HLA-DPB2以及HLA-DRA都随着年龄的增长表达增加。与增长相对的即表达下调的基因，在四个数据集中最显著的为热休克家族蛋白中的DNAJB5（图2E,F,G,H），这些显著发生改变的基因在四个数据集呈现一致性，可重复性（图3）。3 富集分析显示随着年龄增长，人类大脑免疫反应增加，神经信号减弱
作者为了研究大脑衰老相关的基因改变的特定的生物学通路，使用了GeneTerm Linker工具进行了GO，KEGG，以及InterPro功能富集分析（表2）。结果显示，上调基因主要参与了免疫系统的激活，应激反应（尤其是氧化应激），损伤反应（尤其是DNA损伤）以及病原体反应的的生物代谢通路。在免疫系统激活的通路发现的关键基因是几个分子标记物（CD44，CD59，CD74），以及前面所说的HLA蛋白家族成员，除此之外，还包括与胰岛素信号相关的基因：胰岛素受体（IR）的底物GAB1胰岛素样生长因子1受体（PYGB），以及糖原磷酸酶B（参与调解糖原动员，主要在大脑中发现）。这些基因都随着年龄的增长而上调。值得一提的是，在上调基因的GWAS分析中发现与阿尔兹海默症（AD）相关的基因：CLU，MS4A4A以及MS4A6A，但是这些样本都来自于健康个体，并不存在神经退行性疾病以及认知障碍，作者猜测这可能涉及到阿尔兹海默症的发病机制，通过改变大脑稳态，导致了发病区域的脆弱性，增加了发病风险。
表2 对人类大脑皮层中随衰老而上调的基因（300个）与随衰老而下调的基因（300个）进行功能富集分析
图4 在人类衰老过程中海马中的基因表达谱
而关于随着年龄增长而下调的基因具有丰富的生物学功能，最显著的是参与了与神经元，树突，突触，以及神经元受体和离子通道的相关通路。这些基因有: 肾上腺素受体ADRA1D和ADRA2A，钙电压门控通道蛋白CACNA1G、CACNB1、CACNB3、CACNG3和CACNG4，钙调蛋白激酶CAMK1、CAMK2B、CAMK2N1、CAMK4和CAMKK2，氨基丁酸受体GABBR2和GABBG3，钾电压门控通道KCN家族KCNJ、KCNK、KCNN和KCNQ，以及许多神经元的高度特异性基因(如神经蛋白，NRSN1，NRSN2,NRXN2和NRXN3;还有神经嗜氧蛋白NXPH1，NXPH2和NXPH3)（图4）。这些基因随着年龄的负调控说明，随着年龄的增长，神经元和突触功能功能明显下降，并逐渐消失，而这些下降与神经退行性病理学无关，而仅仅与衰老有关，这对今后衰老的相关研究具有重要的参考价值。作者对皮层老化基因（1148个基因，456个上调，692个下调）以及皮层和海马交叉基因（258个）分别再次进行独立分析功能富集，得到了与表2相似的结果。4 随年龄增长的大脑皮层和海马的转录组特征
与衰老相关的基因筛选得到之后，作者就进一步探究了这些基因所涉及的转录因子。首先对大脑皮层，海马以及小脑分析得到的与衰老相关基因进行了一个交集分析发现，大脑皮层与海马之间有较大交集，与小脑之间有明显的分离（图5A），这也与图1结果相一致。图5 大脑衰老信号的重叠和调控网络
图中显示，在与年龄相关的衰老基因中，大脑皮层与海马区域有258个重叠基因，其中129个上调，129个下调，通过对这些重叠的上调和下调基因进行转录因子富集分析，得到了4个较显著的转录因子，分别是FOSL1,2，MEF2A,D，PDX1和RFX5。这4个转录因子，共调控了67个随着年龄增长上调的基因，以及91个随着年龄增长下调的基因。进一步发现，FOSL1,2和RFX5与上调基因联系较多，MEF2A,D，PDX1与下调基因联系较紧密（图5B）。图5B中圆圈的大小代表与年龄增长相关性的大小，如前文所述的HLA-DPA1以及DNAJB5。在这其中，受这四个转录因子调控所上调的基因与免疫系统相关性较高（HLA家族与CD家族），下调的基因与神经细胞的传递以及囊泡运输有关（如不同钾离子，钙离子通道）。作者对来自皮层与衰老相关的1077个编码基因同样进行了转录因子预测分析，发现411个基因上调，666个基因下调，其中有592个基因受6个转录因子调控，分别为HBP1，MEF2D，REST，TEAD4，FOSL1，以及PDX1。这其中，评分最高的HBP1通过控制细胞周期来调控皮层发育过程中神经元分化的时间，而这个参与调节的转录因子同样随着年龄的增长而过表达。此外，MEF2D则参与了神经元细胞的分化和发育的调控，并直接参与小胶质细胞产生白细胞介素的调控，保护了神经元细胞免受炎症的影响。5 神经元细胞随年龄增长而减少，星形胶质细胞和小胶质细胞活性增加
由于作者所选取的数据包含了大脑皮层样本相对应的基因的完整转录组学的数据，并且这些大脑皮层样本来自不同年龄段的个体，研究者可以在这些样本中去研究特定细胞的状态和进化。基于这个想法，作者发现在2015年Darmainis等人确定了对大脑中细胞类型进行分类的一类分子标记，即用21个特定基因分别来鉴定神经元细胞，星形胶质细胞以及小胶质细胞（图6C）。接着作者就利用这些特定基因对所要分析的数据集进行了细胞类型分析。首先，作者先将四个数据集中的数据分别分为青年时期的人（1-39岁）以及老年时期的人（50-100岁），接下来对各个组中细胞类型随着年龄增长发生的倍数变化进行了分析，最后，对各个数据集中的数据进行了综合分析，察看是否有较为一致的统计性结果。结果表明，在整个青年时期，与神经元细胞有关的基因在四个数据集中有一致的增加，而星形胶质细胞以及小胶质细胞并没有一致的结果（图6A）；而正相反，在人的老年阶段（50-100岁）神经元细胞的基因有了一致的减少，星形胶质细胞与小胶质细胞反而有着一致的增加（图6B）。生命早期阶段神经元细胞活性的增加表明，从儿童到成人，大脑在生命的最初阶段会增强神经元的活动，而在生命的后期阶段，尤其是60-65岁之后，神经元细胞活性减弱。利用相同的实验方法，对海马区域进行独立分析，也得到了与以上相同的结果。
图6 细胞类型特异性基因表达随脑皮质衰老的
6 深度学习神经网络为生物年龄提供了可靠的预测器
作者基于所分析总结的与年龄增长相关基因构建了一个深度学习神经网络（DLNN）用于计算人的个体年龄。通过对已有的两种机器学习算法（random-forest,RF和support vector machine，SVM）进行比较，输入相同的数据进行验证，用R2这个统计度量来衡量回归预测与真实数据点的近似程度。结果表明，DLNN方法提供的生命年龄预测器比RF以及SVM这两种已有的机器学习算法有更好的预测性，输入相同数据，作者所建立的DLNN，SVM以及RF的R2值分别为0.91,0.77和0.86.（图7A，B，C）。
图7 应用深度学习神经网络建立基于皮层衰老基因特征的可靠的生物年龄预测器
进一步对比了现在已有的深度学习神经预测网络（DLNN）用于预测与作者开发的DLNN在预测生物学年龄的准确性。首先对比了Putin与其同事，基于临床血液测试数据建立了预测人实际年龄的方法，这项工作对于十年内的年龄预测达到81.5%的准确度，R2为0.8，在预测试剂年龄方面的平均误差（MAE）为6.07岁；而2013年Steve教授开发的一种基于DNA甲基化数据来进行的年龄预测，对其所计算的相关性值进行了与本实验的对比发现，Steve教授的预测器的R2为0.83。本文中，作者所建立的DLNN对于年龄的预测，在10年范围内为85.3%的准确度，R2为0.91，MAE值为5.78岁。这些结果表明，基于与衰老相关的分子生物标记物的预测指标更为准确。与生物年龄相关性最高的前20个上调或下调的基因列在了图7D，E中，上调基因最相关的为GFAP（胶质纤维酸性蛋白），下调基因最相关的为PNOC（孤啡肽前体），同时这两个基因也与大脑衰老相关。衰老可广义地定义为影响大多数生物体随时间的变化出现功能衰退的现象，其特征是生理完整性的逐步丧失，导致功能受损，衰退以及死亡几率增加。而目前，标记衰老的精确分子与决定生物体的衰老速率的机制还不为人所知。在本篇文章中，作者探索和分析了与年龄和衰老相关的人类大脑的转录组特点和基因调控特点。这些研究结果表明，随着年龄增长，大脑中某些基因会发生变化，而这些基因能够反映生物体年龄。这些基因的变化可能是时间的流逝，年龄的增长的结果，是人体对损伤产生的压力应激反应而导致的。总而言之，本篇文章的工作呈现了与老化相关的人类大脑的转录组特点以及基因调控概况。实验结果为更好的理解在衰老过程中脑中在转录水平上所发生的变化提供了较好的平台，并且开辟了一种新的方式来研究大脑疾病，特别是那些没有明确治疗思路的疾病，如阿尔兹海默症。
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