编译：Nicole，编辑：十九、江舜尧。
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脊椎动物后脑的分割导致菱脑节的形成，每个菱脑节具有独特的身份。专门的边界细胞充当神经元分化的来源或调节者。在斑马鱼中，存在神经发生的空间模式，其中在边界和节段中心形成非神经发生区，部分由Fgf20信号传导介导。为了进一步了解神经发生的控制，本文在3个不同的阶段对斑马鱼后脑进行了单细胞RNA测序。数据分析揭示了已知和新的标志物，分别代表不同的后脑、沿背腹轴的细胞类型以及祖细胞向神经元分化的过渡。本文结果显示在不同阶段之间的祖细胞和分化细胞的转录组中发生了重大变化，揭示了后脑细胞分化过程中新的候选调控因子。这些数据为研究神经发生的模式和祖细胞向神经元分化的过渡提供了宝贵的资源。
论文ID
原名: A single cell transcriptome atlas of the developing zebrafish hindbrain
译名: 发育中的斑马鱼后脑的单细胞转录组图谱
期刊: Development
IF: 5.763（2区）
发表时间: 2020.2.24
通讯作者: David G. Wilkinson
通讯作者单位: 英国弗朗西斯·克里克研究所
DOI号: 10.1242/dev.184143
实验设计
结果
发育中的斑马鱼后脑和周围组织的单细胞分析
为了进一步了解发育中的斑马鱼后脑神经发育的模式，分析了3个发育阶段的单细胞转录组（图1A，B）：16 hpf（神经发生之前的模式），24 hpf（神经源性模式开始）和44 hpf（完全建立了神经源性和非神经源性区域的模式），通过基于液滴的scRNA-seq平台测序（图1C）。总共对9026个细胞进行了测序（16 hpf时为2929，24 hpf时为2568，44 hpf时为3529）。
使用组织标志物基因来分配簇身份，通过生物信息学收集筛选了每个阶段的后脑细胞：16 hpf时的1678个细胞，24 hpf时的1722个细胞和44 hpf时的2729个细胞。
后脑组织成分的总体变化
分析16 hpf，24 hpf和44 hpf的转录组数据，反映了每个发育阶段细胞类型之间的转录组差异（图2A，图3A，图4A）。对每个簇的前30个显着富集的基因进行分析，并通过已知分子标记的表达鉴定每个簇。16 hpf后脑主要由祖细胞组成（占总后脑细胞的91％），处于神经发生不同阶段的细胞（neurod4，neurog1表达升高）占后脑细胞的6％（图2A中的C6簇）。祖细胞在24 hpf时仍是最丰富的后脑细胞类型（后脑细胞的71％），而28％的细胞表达神经发生和晚期分化的不同阶段的标志物（图3A中的C4、6、9、10、11、12）。到44 hpf时，祖细胞的比例进一步降低至40％，其中55％的细胞表达神经发生和神经元分化后期的标记（图4A中的C0、3、5、6、7、8、9、10、11、12、14）。在16 hpf时，聚类主要由片段和背腹轴（D-V）区分（图2A），而在24 hpf和44 hpf时，细胞通过D-V和分化状态聚类（图3A；图4A）。这种变化反映了在后期阶段分化的细胞比例更高，神经元亚型的数量增加了（图4A）。下面，对这些功能中的每一个进行更详细的分析，以揭示已知的基因和区段同一性、D-V同一性和分化状态的新标记。
图2. 16 hpf后脑的细胞群体组成和特征
（A）无监督的UMAP图将后脑细胞细分为10个簇（C0-C89）。（B）每个簇中富集的前30个基因的热图。（C）UMAP图显示代表性基因的对数归一化计数。（D）前30个提取的菱脑节特异性基因。（E）沿D-V轴的基因。
图3. 24 hpf后脑的细胞群组成和特征
（A）无监督的UMAP图将后脑细胞细分为15个簇。 （B）每个簇中富集的前30个基因的热图。（C）UMAP图显示代表性基因的对数归一化计数。（D）在祖细胞中具有背腹限制表达的基因的点图。（E）在分化祖细胞中表达受限的因子的点图。原位杂交显示atoh1a（F，F'）、ascl1a（G，G'）和Neurog1（H，H'）的表达模式。在r4-r5 / r5-r6处背视图（F-H）和后脑横断面（F'-H'）。
图4. 44 hpf后脑的神经元复杂性
（A）无监督的UMAP图将单元细分为16个簇。 （B）每个簇中富集的前30个基因的热图。（C）UMAP图显示代表性基因的对数归一化计数。 （D）点图显示神经元亚型分子特征。原位杂交显示了barhl2（E，E'）、pax2（F，F'）、otpb（G，G'）和tal1（H-H'）的表达模式。位于r4-r5 / r5-r6背视图（E-H），侧视图（E'-H'）和40μm后脑横切面（E'-H'）。
后脑段的转录特征
使用已知标志物的表达可以推断16 hpf时所有簇（C0-C9）的身份（图2A）。这个阶段主要特征是祖细胞的节段同一性和D-V同一性，以及一簇经历神经发生的细胞（C6）。前30个差异表达基因的热图中显示了区分不同簇的基因及其表达水平（图2B、2C）。分别在图2D和图2E中列出了在不同的后脑菱脑节（r）或在背、内侧或腹侧结构域中特异性表达的基因。
具有背侧和腹侧标记基因的UMAP投影图（图2C、E）揭示了D-V与细胞聚集之间的关系。例如，zic2b表达标记所有后脑节段的背侧部分，而Neurog1标记腹侧祖细胞以及分化中的神经元（图2A、2C）。对于某些后脑段（r2、r3、r4、r7），具有不同D-V身份的细胞会分离成离散的簇，推测与阈值有关。最背面神经上皮中的顶板细胞（C8）形成离散的簇，表达标记包括bmp5和nog1（图2B），与表达背面标记的细胞相邻（图2A）。
基于节段同一性的细胞簇显示，这些标记基因在不同节段中表达（图2C）：eng2a（MHB-r1），hoxa2（r2-r5），egr2b（r3、r5），mafba（r5、r6），hoxa3（r5-r7）和hoxd4a（r7）。来自r2、r3和r4的细胞在C0-C1中，其中C0细胞位于腹侧，C1细胞位于背侧（图2A）。不能区分r2和r4细胞，表明存在强转录相似性，均表达egfl6.1、fabp7a和sfrp5（图2D）。r3由egr2b表达标记（图2A、C、D）。与以前的研究一致，r3细胞与r5细胞（C3）相邻，除了egr2b和epha4a基因之外，它们还表达timp2a、aldocb、smea3fb和myo1cb（图2D）。r5还与r6具有转录相似性。但是，r7细胞（C2腹侧和C5背侧）并不与r6细胞相邻，这表明尽管在两个片段中都表达了某些基因（例如hoxa3a、hoxb3a和tox3），但许多其他基因表达不同。此外，还发现了可获得表达数据但尚未在后脑中进行功能研究的基因，包括sp8a（r4和r7较强，r2和r3较弱）、sfrp5（r2-r4）和wnt7aa（r3-r7）。
祖细胞的背腹标志和分化神经元
由BMP、Wnt和Shh信号调节的D-V轴是正在发育的神经上皮的关键特征。在分析的所有阶段，祖细胞均基于其D-V轴进行聚类，这反映了D-V模式建立得较早，并在后脑神经发生期间得以维持。在16 hpf时可以将细胞分为背侧和腹侧祖细胞，以及顶板和底板（图2A）。进一步细分为背部、内侧和腹侧区域。24 hpf和44 hpf将细胞分为背、内侧和腹群体，以及顶板和底板（图3A，图4A）。另外，根据增殖标志物的表达进一步分离祖细胞。在24 hpf时，发现簇C0以及C1和C5的一部分表达了背祖细胞的已知标记，包括zic2b（图3A、C）、zic基因、msx1b/3和olig3/4（图3B，D）。此外，发现新的标记基因表达，包括casz1、cdon、fzd10、myca和pdgfaa（图2B、D）。C1通过表达包括cdca8在内的增殖标志物与C0和C5区别开来（图3A、C）。在背侧分化神经元中也检测到包括zic2b的背侧标志物的表达（C11，图3A、C）。C0和C1的背侧祖细胞和背侧分化神经元（C11）表达前神经元基因atoh1a（图3C、E），通过原位杂交进行了验证（图3F、F'）。内侧祖细胞存在于C1、C3和C5的细胞子集中，共有一些标记基因表达包括背侧（例如zic）和腹侧（例如foxb1a、pax6a），而独特地表达包括gsx1、pax7a/b、ptf1a在内的标记基因和lbx1b（图3C、D）。腹祖细胞细分为多个簇（C7、C2、C3、C8）。C7和C3中参与细胞周期的基因表达水平更高，例如mcm基因（mcm2-6），而C2和C8富含腹侧限制性基因（例如dbx1a/b、irx3a）。总体而言，发现了腹侧祖细胞标志表达特征，包括独特的转录因子：sox21a、foxb1a、sp8a和dbx1a/1b。这些腹祖细胞和分化神经元表达了神经前体基因Neurog1（图3C、E），原位杂交验证了该基因（图3H，H'）。此外，这些细胞表达几种信号转导因子：sfrp5（Wnt信号的可溶性抑制剂）、cyp26b1（RA降解）、scube2（Shh远程信号）和sulf2b（硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）（图3D）。在44 hpf时的分析也使祖细胞聚簇（图4A、B、C）。在此阶段出现的主要特征是分化形成多种神经元细胞类型。
神经元复杂性的表征
从不同的D-V祖细胞域逐渐产生不同的神经元亚型。在16 hpf时，Seurat分析鉴定出一个表达神经发生标记的单个簇（C6）（图2A），在24 hpf和44 hpf时鉴定出表达神经元分化早期和晚期标记的不同簇（图3A，图4A）。无监督聚类分为12个簇：祖细胞（C0、C2、C3、C4），祖细胞和神经胶质（C1），处于不同分化阶段的神经元（C5、C6、C7、C8、C9、C10）和基质（C11）（图5A）。当细胞以其发育阶段进行标记时（图5B），发现在16 hpf时处于神经元分化不同阶段的某些细胞与24 hpf和44 hpf时的细胞重叠。有趣的是，它们表达激活素结合蛋白fstl1a（图5D）以及包括ebf2在内的转录调节子。
进一步表征44 hpf时的神经元复杂性（图4A-D），表达atoh1a的背祖细胞（图4A中的C9;图4C）在后脑中产生dA1兴奋性中间神经元（C0），在感觉信息处理中起作用。barhl1a、barhl2、lhx2b和lhx9是它们的已知标记（图4C；图4E中的原位杂交），此外，发现alcama、bcl11ba（BAF染色质重塑复合体）、pdzrn3b和scrt1b（图4D）。去甲肾上腺素能神经元（NAN）的发育（C10，C11）以tfapa2a的表达为标志（图4C），对于关键NA酶的激活很重要。这些细胞还表达转录因子dmbx1a、lhx1a、lhx5和lbx2。有趣的是，NAN细胞的两个簇通过几个转录因子的表达来区分，包括lmx1bb、tlx2、phox2a和phox2bb（图4D）。在后脑中发现的另一类神经元是GABA能抑制性中间神经元（dB4），聚集在C3中（图4A）。这些细胞表达pax2、lhx1和lhx5（图4D、F）。这些细胞共表达多巴胺能神经元规格中涉及的转录因子otpa/b（图4B-D；图4G中的原位杂交）。在腹侧神经元（C5），由tal1（图4B-D；图4H中的原位杂交）和gata2a/3表达（图4D）标记。腹神经元的另一个簇是C14，表达vsx1、tal1和foxn4（图4C、D；图4H中tal1的原位杂交），将该域定义为V2间神经元。因此，转录组图谱为后脑中不同神经元细胞类型表达的因子提供了新的见解。
图5 16 hpf，24 hpf和44 hpf数据的汇总分析
（A）来自16 hpf、24 hpf和44 hpf的细胞的无监督UMAP图细分为12个簇。（B）3个阶段的背侧和腹侧祖细胞的分子标记点图。点大小对应于每个簇中表达特征的细胞百分比，而颜色代表平均表达水平。（C）UMAP图，其中的细胞根据其来源阶段着色：16hpf（粉红色），24hpf（绿色）和44hpf（蓝色）。（D）UMAP图显示了代表性基因的对数归一化计数。颜色强度与给定基因的表达水平成正比。原位杂交显示cldn5a、fstl1a、mki67、fabp7a、atp1b4和CU929451.2（miR9.3）在24 hpf和44 hpf的表达模式。 （E）显示了GO分类，分别为16hpf（粉红色），24hpf（绿色）和44hpf（蓝色）。（F）沿颞轴的整体后脑变化。
后脑祖细胞的转录转移
16、24和44 hpf祖细胞处于明显不同的簇中（图5A、B）。在16 hpf（C0和C2）和24 hpf（C3和C4）的背侧和腹侧祖细胞中都富集的基因包括cldn5a、fsta和增殖标记物，例如pcna（图5C）。前30个富集的基因GO突出了它们的增殖特性（图5E）。到44hpf时，增殖急剧减少。mki67、nusap1、ccnd1和cdca8在早期后脑中广泛表达，而在44 hpf时它们只限于一小部分背侧祖细胞和vsx1细胞中表达（图5D）。此外，与细胞周期停滞相关的基因（cdkn1ca、cdkn1cb）和Notch信号通路在44 hpf时表达增加（图5E）。总体而言，结果突出显示了发育中的后脑中24 hpf至44 hpf之间的祖细胞中基因表达存在明显的时间变化（图5F）。
区段边界细胞和中心祖细胞
在斑马鱼的后脑发育过程中，前脑基因表达被限制在节段边界侧翼的区域，在后脑边界细胞和菱脑节中心均表达较低。因为神经元分化所需的神经元基因的表达较低，这些位置的祖细胞被归类为非神经源性，尽管谱系分析并未直接显示出来（图6A）。因此进一步使用已知标记的监督聚类来揭示神经原性和非神经原性细胞群体的转录特征。
通过生物信息学分离了24 hpf腹侧祖细胞，并使用rfng（边界），etv5b（段中心）以及Neurog1和Neurod4（神经元分化）来进行聚类。获得了3个群集，将其分为八个子群集（图6B）：C2为边界单元（图6C），C1、C3和C6为区段中心（图6G），C0、C4、C5和C5、C7为神经源性细胞（图6Q）。神经原细胞形成一个连续体，其中前体基因的表达增加而增殖标记mki67的表达减少（图6Q）。表达rfng的边界细胞（C2;图6D）也表达了一些已知的标记：rasgef1ba和Rho GTPase rac3b（图6E）。其中BMP抑制剂卵泡抑素1b（图2F）在节段中心和边界细胞中均富集，原位杂交也证实了边界处的表达增加（图6F）。
片段中心细胞均响应Fgf20信号传导并上调Fgf靶标etv5b。在三个相邻的簇C1、C3和C6中表达etv5b。在C1中，etv5b与Neurog1、ascl1b.1和Neurod4的转录重叠（图6G、Q）。前体神经基因在C6中低水平表达，而在C3细胞中未检测到。野生型解剖后脑与fgf20a突变组织进行RNA测序，显示存在于C1和C6中的metrnl（图6G）是fgf20a-/-突变体中下调的基因之一，并且原位杂交显示在片段中心表达（图6K）。还发现了fsta存在于所有簇中（图6G），原位杂交表明其表达复杂（图6N）。原位杂交证实Fgf20信号传导对于在片段中心表达etv5b、metrnl和fsta是必要的（图6H-P）。总体而言，由边界或中心祖细胞表达部分基因，而大多数转录本在两个细胞群体中表达，表明它们的转录组具有相似性。
在44 hpf时，神经源区已被完全改善，没有检测到rfng和其他边界细胞标记。在此阶段，表达etv5b的细胞在三个相邻的子簇（C2、C6、C7），并且与神经原性基因的重叠减少（图6R-U）。Metrn家族可能在后脑神经胶质发生中发挥作用。神经源性细胞分为两个簇，进一步细分为：C4，C5和C0，具有Neurog1和NeuroD4表达梯度，而C3和C1仅表达NeuroD4（图6R）。
图6.边界细胞和区段中心祖细胞的转录特征
暂时调节后脑神经发生的转录因子
集中分析转录因子对后脑神经发生的潜在贡献，分为3个具离散单元：祖细胞状态的sox2、egr2b、mafba、zic基因、pax6a/b和zbtb16a/b的表达；sox3、neurog1、atoh1a、dbx1a、gsx1、lbx1b处于中间分化状态；atoh1b、neurod4、isl1、vsx1、tal1、pax2a和其他神经元转录因子在最终状态下具有高表达水平。根据分类细胞在很大程度上按照起源的发育阶段和分化状态排列（图7A，B）。16 hpf分化细胞表现出的TFs表达模式与24 hpf祖细胞相似，除了在轨迹末端发现的细胞很少，而24 hpf和44 hpf分化细胞高度重叠（图7B）。
为了确定可能参与神经源性细胞命运决策的TF的时间级联，研究者绘制了在其拟时间表达模式中有显着变化的TF，并根据它们的表达动态对其进行聚类（图7C）。鉴定出7个不同的模式，其中第1个在拟时间开始时高表达，而其他的则表现出渐变的趋势，直到在分化结束时达峰值。第一组（G1）包括egr2b和mafba，在分化开始后迅速下调。在下一组（G2）中，基因在祖细胞中表达直到下一个拟时间才被下调。这些基因与维持祖细胞命运和/或抑制神经发生有关。在拟时间内表达发生变化的基因（G3）：sox3初始表达恒定随后下降。Neurog1、prdm12b、foxp4和foxp4在神经元分化过程中逐渐表达。atoh1b、Neurod4与ebf2在级联反应的下一步（G4）中发现。在下一组中，另一个子集启动表达在拟时间（G5）后期增加，包括zbtb20以及研究较少的uncx、nhlh2、lhx4和sox12。scrt1a和scrt1b在腹侧和背侧表达（图7D-E）而scrt2仅在腹侧发现（图7F）。随后是一组表达较晚但不下降的转录因子（G6），与神经元指标有关（otpa、tal1、tal2a）。在拟时间后期（G7）开始表达的最后一组基因编码神经元同一性的调节因子（isl1/2a、gata3、lhx1a/5/9）。
进一步使用了一种不依赖于拟时间态排序的补充方法，提取一个子模块来举例说明其预测潜力，预测scrt基因在神经发生过程中的作用（图7G）。该网络模块预测G5a、G5a和G4中的基因之间的相互作用。在与nhlh2和神经源性因子（neurod4、elavl3、otpa/b和pax2a）上游的反馈回路中发现了scrt1a和scrt2，而scrt1b与atoh1a/b、atoh8和barhl1a/b相关联。
图7.后脑神经发生过程中转录因子表达的分析
（A）16 hpf、24 hpf和44 hpf后脑细胞的拟时间顺序聚类。根据细胞沿拟时间空间的进展对细胞进行着色（从紫色的拟时间0到黄色的分化结束）。（B）代表每个发育阶段细胞分布的拟时间图。（C）热图显示通过拟时间表达模式聚类的选定TF（q值<0.01）。拟时间排序从左（祖细胞状态）到右（分化神经元）。显示了每个组（G1-G7）的选定转录因子。（D-F）拟时间期间scrt1a、scrt1b和scrt2的表达。在背视（D'-F'）、侧视图（D'-F''）和后脑部分（D''-F''）中显示了scratch基因在44 hpf处的原位杂交。VN =腹侧神经发生，DN =背侧神经发生。（G）使用GENIE3，在44hpf scRNA-seq数据集中的基因之间预测了定向的相互作用网络。
讨论
本文展示利用单细胞转录组的方法研究神经发生和后脑发育的调节机制。分析了16 hpf、24 hpf、44 hpf的后脑细胞转录组的神经发生模式。使用无偏差法根据转录差异对细胞进行聚类，并鉴定了标记基因，创建了一个带注释的基因清单。基于区域特异性基因表达聚类组织表明，相邻的片段具有相似的转录组，但奇数和偶数片之间存在显着差异，这与以前的研究结果一致。相反，r7细胞不与r6细胞相邻聚集，这可能反映出它是前脊髓的过渡区。
发现分化的神经元在16 hpf和24 hpf与44 hpf相比基因表达的主要差异，发现与沿D-V轴形成的神经元细胞类型的已知标记物共表达的新基因，除转录因子外，还包括Shh、RA和Wnt途径的调控因子。有趣的是，所有阶段的许多分化神经元都表达fstl1a，表明BMP抑制作用的潜在作用。相较于16 hpf和24 hpf，在44 hpf时不同神经元细胞类型的产生伴随着祖细胞的基因表达变化，包括增殖标志物和miR9。通过进行拟时间分析，表明了转录因子的级联反应，其中调节神经元迁移的scrt家族基因与proneural因子存在潜在关系。
为了找到标记斑马鱼后脑发育中独特的神经源性和非神经源性区域的基因，使用后脑边界细胞、神经源性细胞和节段中心的已知标记物来标记祖细胞群。此外，通过抑制Fgf途径激活后进行RNA-seq分析，确定了新的信号传导因子，可能参与抑制神经发生或促进神经胶质发生。
评论
中枢神经系统的发育需要精确调节神经元和神经胶质细胞类型与神经祖细胞的分化。祖细胞向神经元分化的转换涉及神经元转录因子的持续高水平表达，启动基因表达的级联，从而导致末端神经元标志物的表达。后脑是中枢神经系统的重要组成部分，在早期阶段，后脑的神经上皮被细分为七个菱脑节（r1-r7），分别表达独特的转录因子，是神经源性和非神经源性区域以及每个节内神经元定位的基础。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）来鉴定后脑发育过程中神经发生的潜在调节方式及特异性表达的基因，得到的数据为提取其他特定细胞群体的信息及相关深入研究奠定了基础。
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