编译：Jerry，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
茸毛由表皮细胞发育而成，人们认为茸毛是茶树品质、种质资源评判的关键特征之一。尽管我们对茶叶代谢产物已经有了充足认知，但对茶树活体茸毛代谢物成分以及茶叶、茸毛在分子水平上的差异均所知甚少。本研究中，研究者开发了茶树嫩芽茸毛采集的方法并检测了其中的儿茶素、咖啡因、氨基酸和芳香化合物等次生代谢产物。结果发现，上述物质在茸毛中浓度显著低于叶片。本研究进行了RNA测序，探讨了茸毛、叶片的分子调控机制，以进一步了解茸毛、叶片的差异。以茸毛与叶片作对比，测序共计获得了52.96 Gb原始数据，差异表达基因（DEG）数量为6560个，包括4471个上调基因、2089个下调基因。值得注意的是，研究鉴定了主要代谢产物的生物合成通路的结构基因、转录因子和其他关键差异表达基因，并在茸毛、叶片之间比较分析了这些基因，而且鉴定了茸毛特有的基因。研究结果有助于了解茶树茸毛、叶片在代谢物与转录组层面的差异，为认识、再评估茸毛在茶叶品质形成、茶树生长发育等方面起到的作用开启了新视角。
论文ID
原名：Integrative Transcriptomic and Metabolic Analyses Provide Insights into the Role of Trichomes in Tea Plant (Camellia Sinensis)
译名：转录组与代谢综合分析有助于了解茶叶茸毛的作用
期刊：Biomolecules
IF：4.69
发表时间：2020.02
通讯作者：Yue Chuan
通讯作者单位：福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室
DOI号：doi:10.3390/biom10020311
实验设计
本文运用液质联用技术，对茶叶茸毛及叶片的氨基酸类、儿茶素类和芳香化合物进行了鉴定和定量分析，并对茸毛、叶片进行了比较转录组分析，比较了两者在代谢产物通路基因、转录因子和其他关键基因的差异，最后使用RT-qPCR验证参与茸毛发育和次生代谢产物合成的基因。
结果
1 茸毛、叶片中关键次生代谢产物的比较
运用超高效液相-三重四级串联质谱从茶树茸毛和叶片中检出了19个氨基酸。然而，茸毛中未检出苏氨酸、叶片中未检出丝氨酸。叶片中总氨基酸含量为茸毛的10倍以上（表1）。在茸毛和叶片中，茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量都是最高，分别占两个部位氨基酸总量的93.1%、94.4%。对儿茶素进行定量，叶片中儿茶素含量显著高于茸毛（超过61倍）。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）和表儿茶素（EC）是含量最高的儿茶素类。叶片中EGCG、ECG、EGC和EC含量分别是82.7mg/g、28.8mg/g、17.7mg/g、4.2mg/g，以上成分在茸毛中含量分别为1.1mg/g、0.54mg/g、0.085mg/g、0.037mg/g（表2）。叶片中芦丁含量（0.39mg/g）为茸毛（0.058mg/g）的6倍。叶片咖啡因含量（31.2mg/g）是茸毛（1.01mg/g）的30倍以上。
表1茶树茸毛和加工叶片中氨基酸含量（mg/g干重）
表2茶树茸毛和加工叶片中主要儿茶素、咖啡因和芦丁的含量（mg/g干重）
2 茶叶茸毛和叶片中芳香化合物的比较
运用气相质谱，在新鲜茸毛和经处理的茶叶中鉴定了34个主要芳香化合物并对这些物质进行了定量。在这些物质中，茸毛、叶片含量最高均为植醇，其次是3,5-二甲基苯甲醛、2-苯乙醇、苯甲醇、2-己烯醛、(Z)-3-己烯醇和芳樟醇（表3）。然而，叶片中多数芳香化合物的含量均显著高于茸毛，特别是橙花醇、甲基水杨酸、顺式芳樟醇氧化物（呋喃型）、2-己烯醛、顺式-2-己烯丁酸、芳樟醇、α-法尼烯、苯乙醇、(Z)-3-己烯醇、顺式橙花叔醇和芳樟醇氧化物（吡喃型）。这些物质被认为是茶叶芳香品质的重要基础。另外，(E)-2-己烯醇、己烯丁酸甲酯和顺式-2-己烯己酸甲酯在茸毛中有显著富集，环己酮、顺-3-己烯基丁酯、2-乙基己烯醇和苯乙醛在茸毛中含量也有非显著性的富集。
表3茶树茸毛和加工叶片中主要香气成分的含量（nmol/g鲜重）。
3 RNA测序、参照基因组比对以及新基因注释
为探讨茸毛、叶片（各三个生物学重复）中差异基因，本研究建立了6个cDNA文库。总共获得3.53亿个高质量序列，序列信息上传至NCBI（SRA accession: PRJNA560722）。每个样本平均滤后碱基、Q20值、Q30值分别是8.83 Gb、97.88%和93.95%。共有11460个转录本被鉴定为新基因并注释到Pfam、SUPERFAMILY、GO、KEGG数据库。
4 茸毛、叶片差异表达谱
构建火山图以寻找茸毛、叶片间表达量有显著差异的基因。根据设置的参数（p-value < 0.01 and |log2 Fold Change|>1），茸毛、叶片之间共有6560个差异表达基因。其中，上调基因数量（4471）多于下调基因（2089），而且上调的差异表达基因变化倍数大于下调的基因。
分别对上下调的差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析，以分析茸毛、叶片差异表达基因的功能富集。对于茸毛中上调的差异表达基因，有62个GO term，包括涉及生物过程（BP）的29个、分子功能（MF）的27个，还有5个细胞成分（CC），有显著富集（p<0.05）。在这些term当中，富集量最多的成分可分为核酸结合转录因子活性（GO:0001071）、序列特异性DNA结合的转录因子活性（GO:0003700）、铁离子结合（GO:0005506）、以掺入或还原分子氧方式作用于配对供体的氧化还原酶活性（GO:0016705）、胁迫应答（GO:0006950）、作用于糖键的水解酶活性（GO:0016798）、水解氧苷键的水解酶活性（GO:0004553）、序列特异性DNA结合（GO:0043565）以及多器官过程（GO:0051704）（图1A）。
此外，KEGG通路富集分析显示，差异表达基因被匹配到96个通路上，显著富集的有“苯丙素生物合成（ath00940）”、“谷胱甘肽代谢（ath00480）”、“角质、木栓和蜡质生物合成（ath00073）”、“半胱氨酸和甲硫氨酸代谢（ath00270）”以及“植物-病原相互作用（ath04626）”（图2A）。
下调差异表达基因可分为749个term，归为BP、MF和CC三大类，显著富集的10个term均属于MF大类，包括作用于磷酸盐的碳-氧裂解酶活性（GO:0016838）、萜类合成活性（GO:0010333）、作用于磷酸盐的碳-氧裂解酶活性（GO:0016838）、丝氨酸型肽链外切酶活性（GO:0070008）、蛋白二聚活性（GO:0046983）、硫酸盐跨膜转运活性（GO:0015116）、含硫化合物跨膜转运活性（GO:1901682）以及镁离子结合活性（GO:0000287）（图1B）。另一方面，KEGG通路分析表明，尽管有2200个下调差异表达基因被分到76条通路中，仅有“植物激素信号传导富集（ath04075）”和“光合作用（ath00195）”通路上有显著富集（图2B）。这表明茸毛几乎没有光合作用能力。
图1 A茸毛和叶片比较上调差异基因的GO富集； B 茸毛和叶片比较下调差异基因的GO富集。
图2 A茸毛和叶片比较上调差异基因的KEGG富集； B 茸毛和叶片比较下调差异基因的KEGG富集
5 区分茶叶茸毛和叶片代谢产物生物合成通路的差异表达基因谱
作者检索、分析了涉及茶氨酸、儿茶素类和咖啡因生源途径的目标基因的表达模式，鉴定出32个涉及咖啡因生物合成的的基因，表达谱显示，这些基因有20个在茸毛中表达下调，12个上调（图3A）。然而，这些基因中只有咖啡因合成酶（TEA010054）、可可碱合成酶（TEA028049）表达水平有显著下调（log2 Fold Change > 1.0）。另外，还确认了27个涉及茶氨酸生源途径的基因（图3B）。在这些基因中，茸毛中的2个编码谷氨酰胺合成酶（GS）的基因（TEA032125和TEA028194）有显著下调（log2 Fold Change >1.0），精氨酸脱羧酶（ADC、TEA032991）则显著上调。研究发现，茶氨酸合成酶基因（TS,TEA015198）也发生了不显著的下调。从茸毛、叶片比较转录组资料中分离出78个基因，包括41个上调基因、31个下调基因，涉及了调节儿茶素生物合成（图3C）。其中，14个基因在茸毛中显著上调，包括苯丙氨酸（PAL，TEA003374、TEA014056、TEA003137、TEA014166、TEA034008）、肉桂酸酯4-水解酶（C4H，TEA016772,、TEA014864）、查耳酮合酶（CHS，TEA023331、TEA023340）、黄酮醇合酶（FLS，TEA034025、TEA016601、010328）、丝氨酸羧肽酶1A（SCPL1A，TEA009668、TEA027746、TEA034057）；6个基因显著下调，包括二氢黄酮醇4-还原酶（DFR，TEA024758、TEA023829）、花青素合酶（ANS，TEA015769）、花青素还原酶（NAR，TEA009266）、SCPL1A (TEA016469、TEA011647)。有趣的是，促进以香豆酰辅酶A为底物合成木质素的肉桂酰辅酶A还原酶（CCR，TEA014563、TEA014565、TEA013353）和肉桂醇脱氢酶（CAD，TEA022464），在茸毛中均有较大程度的上调表达。
图3 茶树代谢产物生物合成途径中关键基因的表达谱。鉴定了咖啡因生物合成途径（A）、茶氨酸生物合成途径（B）和儿茶素生物合成途径（C）中的关键基因，并用热图表达了它们在茸毛和茶叶中的表达水平。红色和绿色星号分别表示显著上调和下调的转录本。
6 茸毛、叶片之间的转录因子差异表达谱
转录因子在调控次生代谢产物和茸毛发育方面有关键作用，例如MYB、NAC、WRKY、C2H2、bHLH、同源框-亮氨酸拉链蛋白等。共有2369个转录因子被鉴定，将其分为66类，以进一步分析茸毛、叶片间的差异调节。从117个MYB差异表达基因中，筛选出95个在茸毛、叶片之间有差异表达的基因。其中，74个在茸毛中显著上调，21个在茸毛中显著下调（图4A）。
研究发现，某些MYB差异表达基因在茶叶中不表达，例如TEA003067、TEA031473、TEA024116、TEA007100、TEA014321、TEA017098、TEA023817、TEA018834、TEA001697、TEA011677、TEA025707、TEA023311、TEA026096。TEA026096在叶片无表达，TEA027578在茸毛中无表达。共确认108个NAC的差异表达基因，其中33个在茸毛、叶片之间有显著差异表达。当中的30个在茸毛中显著上调，TEA013629、TEA013108、TEA022743、TEA007908、TEA015555、TEA013548、TEA011210在茸毛中特异表达（图4B）。有40个WRKY差异表达基因在茸毛、叶片间有显著表达差异，包括33个在茸毛中上调、6个在茸毛中下调的差异表达基因。TEA027312、TEA012365、TEA027198, 、TEA003077在茸毛中特异表达，TEA002329在茸毛中无表达（图4C）。C2H2锌指蛋白的差异表达基因有31个，19个在茸毛中表达上调，12个在茸毛中表达下调（图4D）。差异表达的同源框-亮氨酸拉链蛋白基因有24个，16个在茸毛中上调表达，8个在茸毛中下调表达（图4E）。bHLH的差异表达基因有33个，19个在茸毛中下调表达，14个上调表达，而且TEA011884在茸毛中无表达（图4F）。TCP差异表达基因13个，茸毛中6个上调表达，7个下调表达（图4G）。WD40差异表达基因10个，7个在茸毛中上调标达，3个下调表达（图4H）。
7 茸毛、叶片之间的其他关键差异表达基因
基因家族中变异最大的差异表达基因有：cupin超家族蛋白、GDSL型酯酶、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、纤维素合酶（CesA）、萜类合酶（TPS）、过氧化物酶、果胶酯酶等。我们筛查了这些基因，以进一步探讨茸毛、叶片中的其他关键差异表达基因，并发现这些家族中的差异表达基因大多在茸毛中出现了上调表达。
有趣的是，GST的全部46个差异表达基因在茸毛中都出现了上调表达。TEA003710、TEA026775、TEA011793、novel.3766, TEA014619、TEA017750、TEA000281、novel.5581、TEA019073、novel.11209、TEA000526在叶片中无表达（图5A）。在确认的46个cupin超家族基因当中，39个在茸毛中显著表达上调，TEA018757、TEA012292、novel.8627, TEA008753、TEA002999、TEA015757、TEA003524、TEA012706、novel.6092在叶片中无表达（图5B）。36个过氧化物酶的差异表达基因中，29个在茸毛中表达上调，TEA021877, TEA014821、TEA012933、TEA007569、TEA029019、novel.1871、novel.7434在茸毛中高表达（图5C）。茸毛中的17个TPS差异基因上调表达，16个下调表达。TEA031969、novel.8382在茸毛中特异表达，novel.10662在茸毛中无表达（图5D）。确认的15个CesA中，11个在茸毛中上调表达，4个下调表达（图5E）。26个GDSL型酯酶的差异表达基因在茸毛中均有显著上调表达（图5F）。果胶酯酶的21个差异表达基因中，12个在茸毛中上调表达，9个下调表达，TEA004577、TEA003984在叶片中无表达，为茸毛特异性表达基因。
图5 茸毛与叶片比较组中其他关键基因的表达模式。鉴定了谷胱甘肽S-转移酶（GST，A）、铜蛋白超家族蛋白（cupin，B）、果胶酯酶（C）、萜烯合成酶（TPS，D）、纤维素合成酶（CesA，E）、GDSL型脂肪酶/酯酶（F）和过氧化物酶（G）的具有显著差异表达（log2FoldChange>1.0）的转录本，并用热图表示它们在茸毛和叶片中的表达水平。未检测到FPKM值的转录本显示为白色。
8 差异表达基因的验证
作者选出21个参与了茸毛发育调节及其主要次生代谢通路的调节转录因子和结构基因，运用RT-qPCR验证RNA测序结果。两者的结果吻合，证明转录组数据可靠真实（图6）。还观察到TCS1和TPS1在叶中有高表达，而它们与次生代谢产物合成相关。转录因子ZAT12、ATHB40、WUSCHEL3在茸毛特异表达，它们可能与茶树茸毛发育相关。
图6荧光定量PCR验证。选择21个与茸毛发育和主要次级代谢途径有关的调控基因TFs和结构基因，包括WRKY43、MYB5a、ZAT5、ZAT12、ATHB40、WUSCHEL3、GL2、bhl162、bhl83、TTG1、FLS、C4H、CHS1、CHS3、DFR、LAR、TS1、GS2、AMPD、TCS1和TPS1，进行RT-qPCR测定。GAPDH基因作为内参基因。
讨论
本研究采用新方法，首次从新鲜茶叶嫩芽中分离得到了新鲜茸毛，并运用RNA测序分析技术揭示了茸毛、叶片在代谢产物和基因表达模式层面的差异。结果表明，茶叶茸毛不能合成代谢产物。茸毛中主要的儿茶素类、氨基酸类、咖啡因和挥发性芳香化合物含量较低。确认了6560个差异表达基因（4471个在茸毛中上调表达、2089个在茸毛中下调表达），探讨了茸毛、叶片之间的分子调控机制的差异。此外，还确认了若干茶叶茸毛特异性表达基因（特别是不同类型的转录因子），发现茶叶茸毛和茶树的环境适应有密切关系。上述发现为理解茶叶茸毛在茶叶品质形成和茶树生长发育中的作用提供了基础信息。
评论
本研究选择了茶叶茸毛这一报道相对较少的材料为切入点，进行茸毛、叶片之间的代谢谱差异分析，获得了两者之间品质差异的线索。而比较转录组研究可以挖掘两者之间成分差异的分子机制。通过分析次生代谢产物生源途径关键基因、转录因子、其他关键基因的差别，作者认为茶叶茸毛的功能可能与茶树环境适应有紧密联系，茸毛在茶叶品质评价中的作用也值得重新思考。
更多推荐
1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
联系客服
