编译：云佩b，编辑：十九、江舜尧。
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为获取不同发育阶段叶片的代谢物含量和酚酸生物合成通路的调控机制，本研究联合使用代谢组、转录组来分析不同发育阶段的青钱柳叶片。使用超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱进行代谢谱分析，使用高通量RNA测序进行转录谱分析。转录组分析显示58个基因参与到酚酸的生物合成。其中10个差异表达基因在所有组别之间都出现。对代谢产物进行鉴定、定量分析，14个位于酚酸生物合成通路上。其中8个差异积累化合物在所有组别之间均存在。代谢组、转录组关联性分析表明，6个差异表达的结构基因与代谢产物积累显著正相关并具有相似的表达趋势。共鉴定出128个可能参与了酚酸生物合成调控的转录因子，其中包括12个MYB、10个碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子。作者建立了酚酸生物合成的调控网络，把参与到显著差异代谢产物的积累的差异表达基因可视化。本研究结果为进一步明确青钱柳叶片发育过程中的酚酸生物合成提供了参考。
论文ID
原名：Combined Analysis of the Metabolome and Transcriptome Identified Candidate Genes Involved in Phenolic Acid Biosynthesis in the Leaves of Cyclocarya paliurus
译名：代谢组、转录组综合分析鉴定青钱柳叶片中参与酚酸生物合成的候选基因
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.32
发表时间：2020.02
通讯作者：Li Junmin
通讯作者单位：台州学院浙江省植物进化生态学与保护重点实验室
DOI号：10.3390/ijms21041337
实验设计
结果
不同发育阶段青钱柳叶片中酚酸生物合成基因的表达
检测到的代谢产物以KEGG数据库中苯丙素生物合成为参照，以此构建青钱柳叶片的酚酸生物合成通路（图1）。共鉴定出58个参与了酚酸生物合成通路的基因（图2A）。4个发育阶段叶片的比较得到了10个DEG，包括1个PAL基因 (TRINITY_DN87383_c2_g1)、1个C4H基因(TRINITY_DN83539_c2_g6)、1个F5H基因(TRINITY_DN86835_c0_g1)、1个COMT基因 (TRINITY_DN95472_c1_g2)、2个CAD基因(TRINITY_DN88256_c1_g1, TRINITY_DN92541_c0_g1)、2个UGT72E基因(TRINITY_DN91186_ c0_g1, TRINITY_DN93270_c1_g1)、1个HCT基因(TRINITY_DN97112_c1_g2)和1个咖啡酰CoA甲基转移酶基因 (TRINITY_DN84484_c2_g1) (图2B)。2个DEG 的表达水平(TRINITY_DN84484_c2_g1、TRINITY_DN88256_c1_g1) 随着叶片发育而下降，而且它们在F1阶段的表达水平最高。仅一个DEG(TRINITY_DN93270_c1_g1)的表达水平先升后降，在F2阶段最高。其余DEG的表达趋势不尽相同，但都在F4阶段表达量最高。共有22个转录因子（TF）参与到酚酸生物合成通路，包括12个MYB转录因子、10个碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子（图2C）。
酚酸生物合成通路中代谢产物的鉴定
图1 青钱柳酚酸生物合成通路。红色方形表示检测到的代谢物，虚线表示一系列的酶促反应。PAL,苯丙氨酸解氨酶; C4H,反式肉桂酸酯-4-单加氧酶; F5H, 阿魏酸-5-羟化酶; COMT, 咖啡酸 3-O-甲基转移酶; CAD, 肉桂醇脱氢酶; UGT72E, 松柏醇糖基转移酶; HCT,莽草酸-O-羟基肉桂酰转移酶; EC: 2.1.1.104, 咖啡酰-CoA O-甲基转移酶; 4CL, 4-香豆酸–CoA 连接酶; CCR, 肉桂酰-CoA 还原酶。
图2 酚酸生物合成通路基因热图（A），酚酸生物合成通路基因的差异表达情况（B），MYB、bHLH转录因子基因热图（C）。
表1 酚酸生物合成通路中的代谢物含量及种类
* CPS, 每秒计数; SE, 标准误差。不同小写字母代表不同发育阶段之间的显著差异。
代谢组、转录组综合分析
为量化基因与代谢产物之间的关系，作者通过关联性分析将转录组和代谢产物数据一体化，并建立了量化转录本-代谢物关系的网络。代谢物和转录组数据经过log2函数变换，然后进行关联性分析。引入该分析中的配对要求Pearson关联系数（PCC）≥0.9、p<0.05。共鉴定出64个关联对，使用Cytoscape软件（3.6.1版本）将它们可视化。可视化网络显示，共有47个节点，由64条边连接。这47个节点包括了32个基因和15个代谢物。43对为正相关，21对为负相关（图3）。在酚酸生物合成中，共发现6个候选DEG，包括PAL (TRINITY_ DN87383_c2_g1)、C4H (TRINITY_DN83539_c2_g6)、CAD(TRINITY_DN92541_c0_g1)、COMT (TRINITY_DN95472_c1_g2)、HCT (TRINITY_DN97112_c1_g2)和UGT72E (TRINITY_ DN93270_c1_g1)。上述结果表明，参与酚酸生物合成的某些DEG与对应的代谢物有高度关联性。转录组数据验证了代谢组数据的可靠性、精确性。
图3 不同发育阶段青钱柳叶片中结构基因和酚酸生物合成通路代谢物的共表达分析。蓝色节点代表代谢物，红色节点代表基因。红色边代表正相关，绿色边代表负相关。
参与酚酸生物合成转录因子的筛选和系统发育分析
为系统地鉴定操控青钱柳不同发育阶段叶片中酚酸生物合成的未知假定转录因子，对代谢通路基因和差异表达的转录因子进行了共表达分析。以前期筛选出的6个酚酸生物合成基因（编码PAL、C4H、CAD、COMT、UGT72E、HCT的基因）作为“引导基因”，鉴定共表达特异关系。通过与PlantTFDB数据库比较，共鉴定出386个差异表达转录因子。在引导基因和差异表达转录因子之间进行关联性分析，配对要求PCC≥0.9、p<0.05。共鉴定出44对关联配对，并使用Cytoscape软件将其可视化。可视化网络显示，414条边将134个节点连接，包括6个引导基因和128个转录因子（图4）。在已鉴定的共表达转录因子中（p<0.05），MYB、bHLH、ERF家族成员是正相关转录因子中最多的成员。
由于MYB和bHLH是参与酚酸生物合成的两个最重要转录因子，所以青钱柳的MYB和bHLH基因被分别用于和拟南芥R2R3MYB转录因子、拟南芥bHLH转录因子构建系统发育树。12个MYB转录因子分为6枝，TRINITY_DN86884_c1_g7、TRINITY_DN92774_c0_g3、TRINITY_DN89360_c1_g9、 TRINITY_DN91730_c2_g1、TRINITY_ DN97533_c2_g5 基因显示出与AtMYB39、AtCDC5、AtMYB91的同源性，它们聚为最大一枝。
参照KEGG数据库苯丙素生物合成方法（图5），构建青钱柳叶片中酚酸合成通路。网络构建综合了所有代谢物、基因、转录因子的结果，以直观表达转录因子调控的基因表达、基因表达、代谢物累积之间的关系。转录因子与结构基因的增强子结合，因此，假设转录因子通过结合到结构基因的增强子上从而激活基因表达，包括代谢物积累。包括PAL、C4H、CAD、COMT、HCT等酚酸生物合成通路中的结构基因受到许多MYB和bHLH转录因子的调控。所有经由关联性分析筛选出的MYB和bHLH转录因子都显示出相似的表达趋势，而且在F4阶段高表达，这种情形与多数差异表达的结构基因很相似（图2C）。特别地，本研究得到了12个MYB、10个bHLH转录因子、10个差异表达结构基因作为候选基因。它们可以被用于研究青钱柳叶片不同发育阶段酚酸生物合成背后的调控机制。
转录组数据的RT-qPCR验证
使用qRT-PCR分析青钱柳中参与酚酸生物合成的酶和转录因子的基因转录丰度。根据4个发育阶段基因表达水平的差异，筛选出18个基因进行qRT-PCR，包括6个结构基因（PAL、C4H、HCT、CAD、COMT和UGT72E）、6个MYB转录因子和6个bHLH转录因子。18个基因与RNA测序数据中的表达模式相似（图6）。因此，本研究数据可用于研究青钱柳中的酚酸生物合成和代谢相关基因。
图4 青钱柳叶片中酚酸生物合成通路结构基因和转录因子共表达分析。黄色节点为MYB转录因子。绿色节点为bHLH转录因子。亮蓝色节点为CO样转录因子。蓝色节点为乙烯反应转录因子（ERF）。粉红色节点为种类激活物样效应器（TALE）转录因子。橙色节点为NAC（NAM、ATAF、CUC）转录因子。灰色节点为其他转录因子。红色边为正相关，绿色边为负相关。
图5 青钱柳不同发育阶段叶片中酚酸生物合成调控网络。红色框为检测到的代谢物。实线框为一步过程，虚线框为多于一步过程。黑色箭头为MYB和bHLH转录因子可能的方向。粉色箭头为酚酸生物合成方向。
图6 实时聚合酶链式反应（PCR）验证RNA测序中参与青钱柳酚酸生物合成候选的unigene。直方图显示实时PCR测得的相对基因表达量。转录组中每一百万个比对碎片中的TPM以折线图表示。左侧y轴为实时PCR测得的相对基因表达量。
讨论
植物中的酚酸主要由苯丙素生物合成途径衍生。AL、C4H、4CL、F5H和COMT是乏味生物合成通路上的关键酶，其行为导致了不同酚酸类化合物的产生。CAD、CCR和UGT72E酶调节不同酚酸衍生物的合成。HCT、4CL和E2.1.1.104 使不同酚酸化合物产生。本研究中，上述10个基因都出现在青钱柳叶片的4个发育阶段（图2B）。然而，4个发育阶段中，10个基因的表达趋势各不相同。例如，C4H、HCT、COMT 和PAL在F4阶段表达量最高，随后是F1、F2阶段，最低为F3阶段；而F5H在F4阶段表达量最高，随后是F3、F1，最低是F2。这些基因在所有检测到的酚酸的积累方面可能都有重要作用。苯丙素生物合成是非常复杂的过程，会生成多个酶的代谢产物；而且，某些酶以多个异构体存在。Gayoso等人报道，番茄根的6个PAL基因中，PAL2有最高表达， 随后是PAL3、PAL4、PAL6。其他报道鉴定了2个油菜BnC4H基因和2个山茶Cs4CL基因。本研究还表明，多基因编码同一个酶，而且它们的表达模式不同。例如，在青钱柳中找到5个PAL基因和7个4CL基因。这些发现提示了多基因家族中不同基因在酚酸生物合成通路上的作用不同。这些基因在特定酚酸生物合成中的作用则有待研究。
植物代谢组学是后基因组时代的新领域，被广泛应用于代谢物积累模式的研究。通过鉴定参与了代谢的基因，该技术还被用于研究代谢物积累模式背后的基因基础，这也是现今植物生物学的研究方向之一。代谢物是细胞生物调节过程的最终产物，其水平可视作植物发育过程对基因和环境改变的响应。本研究对青钱柳4个发育阶段的叶片进行了代谢组分析，鉴定了14个酚酸生物合成通路上的代谢产物，8个有累积差异。L-苯丙氨酸是酚酸生物合成通路的前体，在前三个阶段有累积，在F3到达累积量的顶峰，在F4阶段显著下降（表1）。其他差异表达的代谢产物在4个发育阶段也显示出不同的累积趋势，均在F3阶段最高。上述结果表明，酚酸及其衍生物在叶片发育过程中累积。非显著表达的代谢产物可能受到上游、下游通路的影响，未显示出相似的表达趋势。
由于转录组分析是研究基因表达水平、结构和功能并鉴定表观性状的核心方法，转录组、代谢组联合分析日益成为发掘各种代谢通路中新基因的常用、有效的工具。因此，本方法也应该能有效地研究青钱柳中酚酸生物合成调节机制。本研究中，代谢组数据以及转录谱分析联用，确认了参与酚酸生物合成的基因。这为寻找青钱柳叶片4个不同发育阶段中酚酸累积及调控方面的有用信息奠定了基础。使用关联性网络分析，筛选出6个与代谢产物显著相关的DEG（PAL、C4H、COMT、HCT、CAD 和UGT72E）PAL是苯丙素通路中的关键酶、启动酶，控制了流入酚类化合物网络中前体的流量。PAL活性和PAL表达都和酚酸类及紧密相关。本研究表明，PAL基因的表达水平与苯丙氨酸有着相反趋势，但与合成产物肉桂酸的含量变化趋势一致。这进一步证实了PAL与肉桂酸的积累相关。C4H是广义苯丙素通路上的第二个关键酶，而且是除了PAL之外也控制流入苯丙素通路中前体化合物流量的酶。COMT调控香豆酸到阿魏酸的代谢过程，还参与从5羟基阿魏酰基衍生物生成芥子酰残基和S-木质素的过程。本研究确认了C4H、COMT基因和代谢产物之间的显著正向或负向关联，发现了DEG与代谢产物之间的相似表达趋势。这些结果确认了在青钱柳不同发育阶段叶片酚酸生物合成途径中有着重要作用的结构基因。
基因表达调控必须依赖于转录因子。一般而言，转录因子蛋白的DNA结合域结合到目标基因的顺式作用元件，然后发挥功能。转录因子是调控基因表达和植物生长发育过程中信号传导网络的关键蛋白。它们还参与发育调控、防御启动和胁迫响应等各种生物过程。根据关联性网络分析，共鉴定出128个与引导基因相关的转录因子。三个最大的转录因子家族APETALA2/乙烯反应元件结合蛋白 (AP2/EREBP), MYB-(R1)R2R3和bHLH 在植物生命过程中起到一系列作用。本研究鉴定了12个MYB和10个bHLH转录因子。虽然人们认为只有MYB或bHLH才能调节苯丙素代谢并增强次生代谢产物的生成，许多研究也已经确认它们以复合物形式（如MBW、MYB/bHLH/WD40蛋白复合物）能起到更显著的作用。本研究表明，筛选出的MYB和bHLH转录因子有相似的表达趋势，也与结构基因表达量和代谢产物含量的变化一致。这提示了MYb和bHLH转录因子能调控方式生物合成通路。研究也表明，MYB/bHLH 复合物可能显著地提升次生代谢产物含量。根据筛选出的MYB、bHLH基因和拟南芥R2R3-MYB、bHLH基因构建的系统发育树，我们认为TRINITY_DN94789_c0_g2 MYB、TRINITY_DN94332_c1_g4 MYB、TRINITY_DN97140_c3_g1 bHLH和TRINITY_DN85072_c1_g3 bHLH基因可能具有调控青钱柳不同发育阶段叶片中酚酸生物合成的功能。可能是因为同源的拟南芥MYB转录因子和bHLH转录因子具有该方面的明确功能。在丹参中异源表达金鱼草ROSEA1或拟南芥MYB75/PAP1均促进迷迭香酸和丹参酚酸的含量。这表明AtPAP1是酚酸生物合成的正向转录激活物。过表达PAP1、ROSEA1、VvMYB5a或StAN1，可导致编码PAL、C4H、4CL、HCT、COMT和CAD的基因上调表达。据报道， MYB75、MYB90、MYB111、MYB113和MYB114具有调节苯丙素生物合成通路的功能。TRINITY_DN94789_c0_g2和 TRINITY_DN94332_c1_g4 MYB均与CAD、PAL、HCT和COMT的表达趋势高度一致，且具有显著相关性。bHLH1显示出与苯丙素以及AN1、bHLH1、WD40表达的强烈相关性说明它们是某个基因型中苯丙素含量的决定因素。这些结果提示，上述2个MYB转录因子和2个bHLH转录因子可能调节了这4个酶的基因表达，由此影响酚酸的积累。
尽管另外5组拟南芥MYB基因和所有9组拟南芥bHLH基因未见参与但苯丙素通路的调节，但它们有着其他方面的作用。例如，AtMYB59通过控制根尖细胞周期发展调来控植物根发育，AtMYB99控制花药发育和/或花药功能性。 AtMYB88和AtMYB124/FLP通过限制气孔细胞系较晚分化以及诱导末端分化以影响气孔分化和气孔图案。AtbHLH113与PAP1/MYB75作用，调控花青素生物合成。研究表明，转录因子存在功能冗余。然而， 这些转录因子的功能应当通过实验进行验证。需要进一步确认这些MYB和bHLH是否在酚酸生物合成通路中具有调控作用，如使用染色质免疫沉淀法或在植物中过表达候选的转录因子基因。
评论
青钱柳叶片作为传统草药及新食品原料，富含酚酸类成分。本文以青钱柳4个发育阶段的叶片为研究材料，进行了代谢组、转录组分析，筛选出在4阶段均有差异表达的基因和代谢物。运用关联性分析和共表达分析，得到了结构基因-代谢物以及结构基因-转录因子的共表达情况。最后建立了转录因子-结构基因-代谢物一体的酚酸生物合成调控网络。
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