编译：秦时明月，编辑：十九、江舜尧。
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基于RNA测序(RNA-seq)的转录组分析已成为现代植物生物学中不可缺少的研究工具。几乎所有的RNA-seq研究都提供了稳态转录组的研究结果，它包含了一定时间内所有RNA的信息，但却缺乏RNA合成和降解的动态信息。只有几种专门的测序技术，如GRO-seq，可以提供植物RNA合成速率的信息。本研究证明了用修饰的、无毒的尿苷类似物5-乙炔基尿苷(5-EU)在拟南芥(Arabiopsis Thaliana)幼苗中进行RNA标记可以深入了解植物转录组的动态变化。5-EU可以标记初生态的和不稳定的RNA、剪接产生的RNA加工中间产物以及叶绿体RNA。5-EU的脉冲示踪实验使研究人员在不需要化学转录抑制剂(如放线霉素等)的情况下确定RNA的稳定性。通过5-EU脉冲示踪实验对多腺苷化RNA的稳定性进行了无抑制剂的全基因组分析，发现RNA的半衰期比报道的化学转录抑制后的RNA要短。综上所述，拟南芥初生态转录组含有不稳定的RNA和RNA加工中间产物，表明多腺苷化RNA在植物中的稳定性较低。本研究为植物RNA稳定性的无抑制剂分析奠定了基础。
论文ID
原名：Metabolic Labeling of RNAs Uncovers Hidden Features and Dynamics of the Arabidopsis Transcriptome
译名：RNA代谢标记揭示了拟南芥转录组的隐藏特征和动态变化
期刊：The Plant Cell
IF：8.631
发表时间：2020.2
通讯作者：Sascha Laubinger
通讯作者单位：奥尔登堡大学&图宾根大学&马克斯·普朗克化学基因组学中心&马克斯·普朗克发育生物学研究所
DOI号：10.1105/tpc.19.00214
实验设计
本研究所用植物材料为野生型拟南芥Columbia-0(Col-0)。在含有5-EU、BrU、4-SU、虫草素以及正常的MS培养基中进行植物培养，并对拟南芥幼苗进行RNA提取。使用5-EU标记初生态RNA并分离以进行Illumina文库的制备，然后进行5-EU标记的RNA体外转录试验以及RT-qPCR分析。研究人员接下来分析了Neu-Seq文库的Illumina reads，并研究了Neu-RNA-Seq文库的特征，然后进行可变剪接分析。对于ERIC-seq采取相同的实验步骤，首先分析ERIC-seq文库的Illumina reads，然后研究ERIC-seq文库的特征。本研究使用Integrative Genomics Viewer version 2.3.80进行RNA-Seq结果的可视化。
结果
1 5-EU标记拟南芥RNA
首先，研究人员测试了通常用于体内RNA标记的小分子是否对拟南芥具有毒性作用。将野生型拟南芥Col-0种子在包含不同浓度标记物质5-EU、BrU或4-SU以及虫草素(一种通常用于诱导转录抑制的腺苷衍生物)的培养基上萌发。在含4-SU或虫草素的MS培养基上萌发的幼苗出现死亡。5-EU或BrU对种子萌发或幼苗发育无明显负面影响。研究人员还在正常的MS培养基上培养幼苗，并将5d龄的幼苗转移到含有5-EU、BrU、4-SU或虫草素的MS培养基中。转移到4-SU或更高浓度虫草素的幼苗表现出发育停滞，不能形成真叶，最终死亡。相比之下，5-EU和BrU对拟南芥的发育没有明显影响。与其他标记物质相比，4-SU在哺乳动物细胞培养中也观察到了较高的毒性。
接下来，研究人员进行了一系列初步实验，以研究在无毒的5-EU中培养拟南芥幼苗是否会导致体内RNA标记。拟南芥种子在MS培养基中恒光培养5d，然后在培养基中添加不同浓度的5-EU。研究人员通过将生物素共价连接到5-EU残基上，从总RNA中分离出含5-EU的RNA，然后用链霉亲和素包被的磁珠进行纯化。研究人员将从未经5-EU处理但经过5-EU标记的RNA纯化过的幼苗中分离出的RNA作为阴性对照。附着在链霉亲和素磁珠上的RNA用于cDNA的合成和随后的RT-PCR分析(图1A)。
与阴性对照相比，经200 mM 5-EU处理的植物的RNA含量更高，这表明研究人员实现了5-EU对拟南芥幼苗内源RNA的标记(图1B)。在另一组重复实验中，研究人员还通过RT-qPCR检测了叶绿体RNA的富集。研究人员发现，在5-EU处理后，与未处理的对照相比，三个选定的mRNA最多富集了70倍(图1C)。用500 mM 5-EU进行的短期脉冲实验表明，在向生长培养基中添加5-EU 30到60分钟后，含有5-EU的RNA已经开始积累(图1D)。在5-EU标记后，剪接后的成熟mRNA以及未剪接的前体mRNA都开始积累(图1D)。这些结果表明，5-EU不仅可以在体内标记RNA，还可以富集RNA加工中间体。此外，这些结果表明植物剪接系统可以处理5-EU标记的RNA。
2 初生态与稳态转录组的比较
因为研究人员发现在植物生长培养基中加入5-EU 60分钟后，标记RNA开始积累(图1)，所以选择这个时间点进行链特异性RNA-seq文库的制备。这样的短期脉冲可能会使初生态的preRNAs和不稳定的RNAs被分离出来，而处于稳定状态的转录组中存在其他的RNAs时，很难检测到这些RNAs。为了制备初生态的5-EU标记RNA测序(Neu-seq)文库，研究人员如上所述从总RNA中纯化了5-EU标记的RNA。同样的总RNA样本也被用来制备常规的RNA-seq文库，研究人员直接将其与60分钟时间点的转录组进行比较。因为初生态的preRNAs可能没有被多腺苷化，研究人员选择性地移除rRNA，并随机地为所有RNA准备RNA-seq文库。Neu-seq文库的测序reads比常规RNA-seq文库的要差，这可能是因为5-EU标记的RNA在文库制备和测序过程中容易积累更多的错误。
为了比较稳态转录组和Neu-seq转录组，研究人员首先计算了所有基因的转录丰度。来自稳态转录组和Neu-Seq转录组的每百万转录(TPM)值显示出高度的相关性(图2A)。为了测试Neu-seq文库是否富集了稀有RNA，研究人员首先认定表达值<1TPM的所有RNA都是稀有的。当研究人员比较Neu-seq和常规RNA-seq文库时，研究人员在两种文库类型中都发现了TPM为1的16406个基因(图2B)。然而，稳态转录组只包含69个RNA(TPM>1)，这是Neu-Seq没有检测到的(TPM<1；图2B)。其中，研究人员发现了几个小的核RNA，它们是剪接体的组成部分(例如At2g04375，At1g05057，At5g61455，At2g04455，At4g06375，At5g04085)。这样的RNA可能不是以高速率产生的，但表现出很高的稳定性，因此在稳态转录组中更容易检测到。相反，Neu-Seq文库包含4058个RNA(TPM>1)，这些RNA在常规RNA-Seq文库中没有被检测到(TPM<1；图2B)。这样的RNA可能是初生态的或不稳定的RNA，在稳态转录组中很难检测到。用MAPMAN进行的基因分类分析表明，在Neu-seq文库中检测到的特异性表达的基因在诸如包括microRNAs的非编码RNA的类别中富集(图2C)。miRNAs来源于较长的初级RNA(pri-miRNAs)。在植物中，类似RNaseIII的酶DICER-LIKE 1(DCL1)会迅速将原始RNA处理成成熟的miRNAs，导致pri-miRNAs的丰度很低，因此很难检测到。在Neu-seq转录组中总共可以检测到30个miRNAs的表达，但在稳态转录组中没有检测到(图2D)，表明Neu-seq具有检测低丰度RNA(如pri-miRNAs)的能力。
Neu-seq文库还包含比稳态转录组更多的反义RNA(图2E到2G)。其中最突出的例子是FLOWERING LOCUS C (FLC)。对于FLC来说，反义方向的转录对于建立抑制性染色质标记很重要。有趣的是，研究人员观察到在初生态RNA转录组的FLC位点上反义RNA的高度积累，但在稳定状态的转录组中没有(图2E)。这些结果表明，在本研究的实验条件下，FLC位点的RNA产生主要发生在反义方向。其他带注释的反义基因也得到了类似的结果(图2F和2G)。为了测试与稳态转录组相比，反义RNA是否在Neu-seq文库中积累，研究人员分析了RNA-seq在反义方向上映射到注释基因的数量，并计算了所有基因的反义TPM值。正义/反义TPM之间的比例明显向正义TPM偏移，表明拟南芥的大部分基因主要在正义方向转录(图2H)。然而，在Neu-seq文库中，正义/反义TPM的比率明显低于稳态转录组，这表明Neu-seq比标准RNA-seq可以更好地检测反义RNA(图2H)。前人的GRO-seq实验也在拟南芥转录组中检测到了大量的反义转录组。这些结果表明，反义RNA是拟南芥转录组的组成部分，它们的检测需要更复杂的RNA标记技术，如Neu-seq或GRO-seq。
3 RNA加工中间产物在初生态转录组中的积累
除了稀有RNA外，研究人员还分析了Neu-seq是否适合检测RNA加工中间体，如未剪接的pre-mRNA。为了检测Neu-seq文库中是否富含pre-mRNA，研究人员首先使用FeatureCounts将reads分为外显子、内含子、外显子/内含子连接和基因间reads。Neu-seq文库包含的映射到内含子-外显子边界的reads (占所有reads的6.8%)是稳态RNA-seq文库(占所有reads的2.8%；图3A和3B)的2.5倍。这些结果表明，Neu-seq特异性地覆盖了未剪接的pre-RNAs。仅映射到外显子或内含子区域的reads数量在两个文库之间没有显著差异(图3A和3B)。Neu-seq文库的纯内含子reads可能并不比RNA-seq文库丰富，因为拟南芥内含子相对较短(平均为165个碱基)，而研究人员的Illumina文库的reads长度为150个碱基。因此，研究人员预计未剪接的pre-RNA的内含子保留主要由外显子/内含子连接reads表示。很少有reads被映射到Neu-seq和稳态RNA-seq文库中的基因间隔区(图3B)。这些发现表明，拟南芥中绝大多数转录区域都有注释，只有少数的额外转录区域被检测到。
由于研究人员在Neu-seq文库中观察到更多映射到内含子-外显子边界的reads，研究人员应用复制多变量法分析转录本剪接(rMATS)的算法来检测在初生态或稳定状态转录组中特异性积累的剪接异构体。大多数差异剪接的RNA异构体含有内含子保留，这些内含子主要在Neu-Seq数据集中被检测到(图3C)。只有少量包含内含子保留的RNA在稳态转录组中更为丰富(图3C)。图3D至3F显示了由rMATS发现的显着保留在初生态转录组数据集中的一些内含子。rMATS可以检测剪接异构体，包括5’或3’可变剪接位点变换、外显子互斥或外显子跳跃。研究人员在初生态转录组和稳态转录组中检测到更多包含5’或3’ 可变剪接位点变换或外显子跳跃的RNA(图3C)。这些结果表明Neu-seq可用于检测剪接中间体和变异体。
研究人员设想了两种可以解释Neu-Seq数据集为何带有更多内含子保留的RNA的原因。首先，与其他内含子相比，这类RNA可能含有剪接效率较低的内含子。在这种情况下，在Neu-seq文库中检测到的剪接变异体将是剪接中间体，这些剪接中间体将被进一步加工成成熟的mRNA。第二种解释是，Neu-Seq数据集中的RNA异构体替代可能是RNA剪接的非功能性产物，其仅短暂积累并且会快速降解。无义介导的mRNA衰减(NMD)途径移除了一些不正确剪接的mRNA，从而调节了拟南芥中数千个mRNA的表达和降解。为了区分这两种情况，研究人员将Neu-seq与对NMD突变体的转录组分析确定的NMD靶标进行了比较。研究人员发现，7%产生带有内含子保留的RNA的基因也积累在NMD突变体中，并且由Neu-seq鉴定到的所有包含内含子保留的剪接变异体中有93%与已知的NMD靶标不重叠(图3G)。这表明，Neu-seq鉴定出的一小部分未剪接RNA是NMD消除的目标，但在Neu-seq文库中检测到的大多数RNA剪接变异体可能会进一步加工成成熟的mRNA。
4 拟南芥RNA的脉冲示踪标记及多腺苷化RNA的整体衰变分析
RNA的代谢标记也可以通过脉冲示踪实验来测量RNA分子的稳定性。研究人员进行了5-EU免疫沉淀示踪(ERIC)-seq，这是一种类似于BRIC-seq的技术。为了确保5-EU的标记数量，研究人员在200 mM的5-EU中孵育拟南芥幼苗24 h，然后用含有20 mM未标记尿苷的培养基替代含5-EU的培养基。在示踪开始后的0、1、2、6、12和24小时收集样本(图4A)。研究人员从总RNA中分离出poly(A)-RNA，因为研究人员主要对成熟的多腺苷化RNA的稳定性感兴趣，而不是对RNA降解中间产物感兴趣。最近在酵母中的一项研究显示，mRNA裂解和mRNA稳定性之间存在很强的相关性，这表明研究人员的数据可以作为mRNA稳定性的替代指标。研究人员在poly(A)-RNA中添加用5-EU标记的荧光素酶(LUC)RNA。LUC标记使研究人员能够比较不同样品之间的RNA丰度，并了解化学反应、RNA纯化和文库制备效率的差异。如上所述，从Poly(A)-RNA/LUC混合物中纯化5-EU标记的RNA，并将其用于链特异性RNA-seq文库的制备，然后计算基因表达值，并将其归一化为相应样本中的LUC掺入量。研究人员计算了每个时间点三次重复的平均TPM值。在任何时间点都表现出0 TPM表达值的基因将被移除。研究人员还过滤掉了在示踪开始后LUC掺入量累积到125%以上的基因。最终保留了19507个基因，并可以确定其衰减率。为了比较不同表达强度的基因，研究人员将与时间点0的表达相关的所有表达值归一化。示踪24小时后样品的测序reads较少，这表明其可能对ERIC-seq数据质量有负面影响。
通过对基因表达值进行K-均值聚类，研究人员定义了五个mRNA簇。五个簇中的mRNA表现出不同的降解动力学(图4B)。为了确定每个簇的RNA半衰期和衰变模式，研究人员应用指数衰减模型和局部加权散点平滑图 (LOWESS)来计算每个簇的半衰期(t1/2)。簇A中的基因表现出最快的衰变，平均半衰期不到1小时。簇B到E包含更稳定的RNA，平均半衰期分别为1.27、2.13、3.38和5.29小时。指数衰减模型和在簇A到D中的LOWESS产生了类似的半衰期，表明这些簇中的RNA按指数模型衰减。指数衰减模型和LOWESS模型分析的簇E的平均半衰期不同(5.29h和4.2h)。这可能是由于该簇中RNA的不同丰度模式引起的：簇E中的RNA在1小时后开始衰退，但在示踪2小时后重新积累，导致其产生内部峰值。这种现象可能是5-EU标记的核苷酸的重新结合引起的，5-EU核苷酸是在5-EU标记的RNA降解后产生的。虽然研究人员用100倍浓度的未标记尿苷进行示踪，但研究人员不能排除这些尿苷会迅速转化为未标记尿苷，然后用于转录的可能性。5-EU核苷酸的再掺入水平可能很高，特别是在由高转录速率的基因产生的RNA中。
研究人员还计算了所有基因的RNA半衰期。研究人员应用了两种不同的模型来计算半衰期：指数衰减模型和复合模型。指数衰减模型常被用来描述RNA衰变模式和预测RNA半衰期。为了解决RNA衰变过程中RNA积累内峰的问题，特别是对于簇E中的基因，研究人员应用Voigt曲线和指数衰减曲线拟合的复合模型进行了分析。研究人员通过比较拟合曲线代表实际数据的程度来比较指数衰减模型和复合模型的检测能力。拟合优度检验表明，指数拟合的chi2值大于复合模型的chi2值，说明复合模型更准确地描述了实际数据。然而，通过指数和复合模型拟合确定的半衰值显示出高度的相关性(图4C)，并且由复合模型确定的RNA半衰期更短(图4C)。这些结果表明，这两个模型以相似的方式描述了RNA的衰减率，但复合模型预测的某些基因的RNA半衰期较短。一般来说，RNA表现出从几分钟到几小时的广泛半衰期。然而，研究人员发现了许多半衰期小于1小时的RNA，因此本研究建议在未来的实验中应该在示踪的第一个小时内采用更高的时间尺度分辨率。
在拟南芥中被研究最多的20个基因中，有12个基因存在于研究人员的数据集中。其他基因的缺失是因为它们只在特定的组织中表达，或者在特定的处理后表达。研究人员选择这12个基因来显示mRNA衰减模式。结果表明，大多数mRNA表现出几乎完整的指数衰减模式(图4D)。
因为本研究使用Poly(A)-RNA来生成ERIC-seq文库，所以研究人员不能准确地估计非多腺苷化RNA(如细胞器RNA)的稳定性。考虑到叶绿体RNA可以被5-EU有效地标记，研究人员测试了是否可以通过对用尿苷示踪0、2和6h的样品进行单独的实验来检测衰减模式。总RNA被随机用于cDNA合成，这也利于检测到非多腺苷化RNA。在所有样本的RNA被提取后，采用名为aadA的被EU标记的转录本作为标记，并且基于aadA信号对数据进行归一化。研究人员选择了三个mRNA用于RT-qPCR的RNA衰减分析，它们都是以蛋白质无关(即潜在调控)的方式稳定的。所有三个mRNA都显示其随时间而衰减的模式。这一分析表明，基于RNA代谢标记的叶绿体RNA衰减测量是可行的。
5 ERIC-seq数据集的质量评估
研究人员分析了ERIC-seq获得的半衰期在生物学重复中的变化情况。研究人员分别分析了每个生物学重复，并比较了三个生物学重复产生的RNA半衰期，以进行统计学分析。对于这项分析，研究人员进一步过滤掉了在任何分析样本、任何时间点中表达值都为0的所有基因。总而言之，研究人员计算了14355个基因的三个生物学重复的半衰期。根据这些结果，研究人员计算了RNA半衰期平均值、它们的SDs和置信区间。为了确定所有基因半衰期测量的变异性，研究人员计算了变异系数(CV)，它表示SD与平均值的比率。CV允许研究人员直接比较三个生物学重复的RNA半衰值的可变性。较小的CV表示变异较小，而较高的CV表示生物学重复之间的差异较大。总体而言，研究人员发现86%的生物学重复的RNA半衰期测量结果的CV<0.5。然而，应该谨慎应用RNA半衰期数据，特别是对于CV非常高的基因。
6 ERIC-seq和转录抑制实验测定拟南芥mRNA半衰期的比较
研究人员比较了ERIC-seq确定的RNA半衰期和转录抑制实验确定的mRNAs的半衰期。为了进行这个分析，研究人员获得了在实验中使用放线菌素D和虫草素得到的mRNA半衰期。ERIC-seq和转录抑制实验测定的半衰期的总体Pearson相关性分别为0.33和0.25，这表明不同方法之间的相关性较低(图5A和5B)。另外，先前研究测定的半衰期其彼此之间只显示出较低的相关性(图5C)。这些结果表明，不同方法确定的半衰期可能有很大的不同。
有趣的是，ERIC-seq测定的RNA半衰期比虫草素或放线菌素D处理后测定的RNA半衰期短得多(图5A和5B)。然而，从以前的研究中推导出的衰减趋势可以通过ERIC-seq得到证实：没有内含子或内含子很少的基因会产生半衰期更短的RNA(图5D)。先前的研究还发现RNA的稳定性与不同的生物功能相关。为了验证这一假设，研究人员使用MAPMAN分别对最不稳定的10%和最稳定的10%的RNA进行了基因分类分析。产生不稳定RNA的基因多为胁迫相关基因、激素途径相关基因和信号传导相关基因(图5E)。相反，产生非常稳定的RNA的基因多为负责线粒体和质体功能以及初级新陈代谢的基因(图5F)。
讨论
在这项研究中，研究人员展示了5-EU在拟南芥幼苗体内RNA标记的多种功能及其在mRNA检测、加工和稳定性分析中的应用。这项技术可以用于研究RNA在不同条件下的生产和稳定性，如温度、应激或激素处理。此外，5-EU标记可用于分析RNA剪接，并探索特定蛋白质在调节RNA代谢中的确切功能。在今后的研究中，Neu-seq和ERIC-seq可以与需要专门的文库制备方法的RNA配套使用，例如miRNAs或循环RNA。ERIC-seq结合精确的mRNA异构体检测方法，包括3’端测序，将使确定特定异构体的RNA稳定性成为可能。最后，5-EU可用于标记实验，其中未标记的RNA和标记的RNA从同一样本中测序，以计算mRNA的半衰期。
评论
近年来，日新月异的RNA测序技术成为植物研究中必不可少的工具。然而，对于活性RNA的动态研究仍然是一片空白的领域。本篇研究提出了一种利用5-EU对植物RNA进行体内代谢标记的技术，该技术允许从完整的植物中分离出新合成的RNA，并证明了拟南芥RNA的5-EU代谢标记可以用于脉冲示踪实验，这使得我们能够在不使用化学物质来抑制转录的情况下，在全基因组范围内确定多腺苷化mRNAs的稳定性。该研究极大的扩展了活性RNA研究的方法，对未来解决植物RNA新陈代谢领域尚未明确的问题具有重大的参考意义。
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