编译：云佩b，编辑：十九、江舜尧。
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赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）是污染物监控领域重要的生态毒理学实验动物。然而，镉（Cd）对蚯蚓转录组层面的影响仍不为人知。首先，作者将赤子爱胜蚓暴露在不同镉浓度的土壤（10、30、60mg/kg土壤）中，然后使用高通量基因表达分析描述了赤子爱胜蚓的基因表达情况。此外，比较各个镉处理组与对照组之间的基因表达谱，发现差异表达基因（DEG）主要富集在酶活性、代谢、氧化压力、再生和凋亡通路。从这些通路中随机选出8个DEG用以验证RNA测序结果。在镉暴露下，6个基因（金属硫蛋白-2、植物络合素合酶1a、铜锌超氧化物歧化酶、性别决定区Y-box 2、性别决定区Y-box 4b、TP53调控的凋亡抑制因子1样蛋白）上调表达，2个基因（β-1,4-内切葡聚糖酶、p53凋亡刺激蛋白2样蛋白）下调表达。这些基因的表达变化提示蚯蚓能通过多个通路降低镉污染土壤中的毒性及生物利用度。本研究初步将蚯蚓转录水平与土壤生态系统的镉生态风险性进行了关联，为该方向的工作提供了一定基础。
论文ID
原名：Transcriptome analysis of genes expressed in the earthworm Eisenia fetida in response to cadmium exposure
译名：转录组分析赤子爱胜蚓基因表达对镉暴露的响应
期刊：Chemosphere
IF：5.34
发表时间：2019.09
通讯作者：柴丽红
通讯作者单位：长安大学环境科学与工程学院
DOI号：10.1016/j.chemosphere.2019.124902
实验设计
收集土壤，风干研磨，筛出直径2mm以下土壤颗粒，检测土壤有机质含量、pH值、钾离子交换能力、总氮、有效磷、可溶性盐含量。将蚯蚓置于洁净土壤与厩肥混合基质中14天，镉污染土壤经过30天稳定化，放入蚯蚓。设置镉含量分别为0、10、30、60 mg/kg干土，每组30条蚯蚓，分为3份平行重复。所选成年蚯蚓体型、重量接近(280-320 mg，3月龄)，生殖环带发育完好。所有组均放置于室温下，土壤含水率50%，昼夜等长，培养30天。每组随机取出3条蚯蚓，洗净，液氮研磨，提取RNA并建立cDNA文库。Illumina HisSeq 2500平台测序，读段经过质量控制后，与NR、SwissProt、GO、KEGG、eggNOG数据库资料进行比对。对4组蚯蚓的转录谱进行主成分分析，DESeq找出差异表达基因（DEG）。DEG进行GO、KEGG通路分析。选择8个与镉毒害相关的基因进行qRT-PCR验证。
结果
为获得蚯蚓的基因表达谱概况，从对照组、各个处理组分别收集3个生物学重复个体，构建cDNA文库，使用Illumina NextSeq500平台测序，把纯净读段拼装为326208个unigene，长度从200bp到31873bp。Unigene的平均长度为625bp，N50值为865bp（表2）。使用BLAST软件和HMMER软件（BLAST, E value≤10-5；HUMMER, E value ≤10-10），发现在获取的326208个unigene中，17007个可映射到数据库（NR、GO、KEGG、eggNOG、Swiss-Prot）里的注释。注释结果意味着4544个unigene在5个数据库中均有同源序列，NR数据库拥有最多的同源序列。在NR的物种分布中，赤子爱胜蚓的转录组数据被鉴定为多毛纲动物，本纲最高等的海蠕虫与赤子爱胜蚓有最高的同源性（19.23%），随后是水蛭的13.34%。
表1 赤子爱胜蚓的qRT-PCR引物
表2 序列分析总结
表3 功能注释结果总结
表4 差异表达基因总结
为进一步了解这些unigene的功能特点，使用GO、eggNOG和KEGG数据库进行注释和分类。GO分析中，17702个unigene（5.43%）成功注释并被分为67个分类条目中。GO数据库通常将unigene分为3个大类，分别是生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）。GO分布分析指出，BP大类包括了24个功能组，细胞过程的注释结果数量最多，其次是单器官过程和代谢过程。CC大类包括24个功能组，属于细胞、细胞组分和膜条目的unigene数量最多。在MF大类下预测到19个功能组，unigene主要涉及到结合和催化活性。 共有8001个unigene注释到KEGG数据库，被分到5个分枝，包含35个已知的KEGG通路。这些通路中，涉及到多数同系unigene的通路是信号传导（1032个unigene）、内分泌系统（517个unigene）、运输和分解代谢（458个unigene）。另外，50611个unigene在eggNOG数据库有注释，可分为26个NOG功能组，以A-Z指代。这些功能组中，“一般功能基因”条目（简写为R）聚集最多unigene，随后是“未知功能”（简写为S）和信号传导机制（简写为T）（图1）。
差异表达基因的分析
为鉴定不同组别的差异表达基因（DEG），使用DESeq方法比较了对照组与各个处理组。与对照组相比，从暴露于10 mg/kg、30 mg/kg和60 mg/kg镉离子的蚯蚓中分别鉴定出5907、6011和6310个DEG（表4）。将对照组定义为“Cy”，10 mg/kg、30 mg/kg和60 mg/kg镉离子处理组分别定义为“Cy10”、“Cy30”、“Cy60”。与对照组相比，最高镉离子浓度组的蚯蚓DEG表达谱具有显著差异。PCA图（图2）显示，所有样品清晰地分为4组，Cy和Cy60之间的距离最远。之后的火山图显示了Cy vs Cy 10、Cy vs Cy 30和Cy vs Cy 60配对中分别有1531、 1744 和1544个DEG显著上调，4376、4267和4766个DEG显著下调（图3）。
DEG的GO和KEGG富集
为了解DEG的生物学功能，作者进行了GO分类的富集分析。GO富集数据表明，P<0.05时，DEG主要功能可分为3类。Cy vs Cy10组中，BP、CC和MF类别下的条目数量分别为760、149和246个。Cy vs Cy30组中，BP、CC和MF类别下的条目数量分别为767、127和243个。Cy vs Cy60组中，BP、CC和MF类别下的条目数量分别为897、162和282个。图4分别展示了Cy vs Cy10 组、Cy vs Cy30组、Cy vs Cy60组中，MF、CC、BP类别下丰度最高的前10个条目。
为进一步评估DEG的生物学意义，又进行了KEGG通路富集分析。通路检测使用P<0.05的超几何测试。在比对到KEGG数据库以后，Cy vs Cy10、Cy vs Cy30、Cy vs Cy60的DEG分别成功注释到162、162、178个通路。暴露在不同镉浓度下DEG富集程度前20的通路如图5所示。氨基酸合成、糖酵解/糖异生在所有处理组中的富集程度均为最高。
根据注释DEG功能的重要程度，作者列出了一些调控酶活性、代谢、氧化胁迫、再生和凋亡等功能的关键基因（表5）。在已鉴定的DEG中，它们能注释到NR数据库并与里面的序列匹配。MT、MT2、PCS1a、SOD、CCS、TRIAP1和Sox2等基因的表达水平在Cy60里面最高，而EfEG、CCAR1、Sox12、Sox7、ASPP1和ASPP2表达水平在Cy60里面最低。
图1 拼装unigene的eggNOG分类。X轴：eggNOG的26个大类名称。Y轴：注释到该大类中的unigene数量。
图2 根据未加权UniFrac距离的主成分分析代表了4个组别之间的距离。不同颜色的图形代表不同组别的样本。
图3 各组差异表达基因的火山图(A) Cy vs Cy 10；(B) Cy vs Cy 30；(C) Cy vs Cy 60。纵线代表变化倍数阈值=2，横线代表变化的显著性p=0.05。红点为显著上调表达基因，蓝点为显著下调表达基因（多重比较的调整p值<0.05）。无显著差异表达基因以灰点表示。
基因表达模式的验证
使用实时定量RT-PCR验证RNA测序结果。选择8个与蚯蚓的镉毒害相关的基因进行验证。如图6所示，qRT-PCR分析的8个基因的表达水平与它们在RNA测序结果中上下调情况一致。在镉暴露情况下，MT2、PCS1a、SOD、Sox2、Sox4b和TRIAP1上调表达，EfEG和ASPP2下调表达。由此确认RNA测序结果准确可靠。
图4 赤子爱胜蚓各个比较组DEG的GO分类(A) Cy vs Cy10；(B) Cy vs Cy30；(C) Cy vs Cy60。
图5 赤子爱胜蚓各个比较组DEG的KEGG富集通路(A) Cy vs Cy10；(B) Cy vs Cy30；(C) Cy vs Cy60。X轴：DEG在该通路中的占比。Y轴：富集程度前20个通路。圆点大小代表该通路中DEG数量，圆点颜色代表该通路中富集显著度p。
讨论
作者使用Illumina NextSeq500测序平台获取了326208个unigene，170007（52%）可被注释。本研究获得的数据可增加实际转录组的覆盖深度，而且能够提升赤子爱胜蚓转录组数据从头拼装的精度和可靠性。NR注释结果包含了分布在很多环节动物基因组中的同源序列，提示赤子爱胜蚓unigene的拼装结果可靠，并且说明赤子爱胜蚓与其他环节动物有更亲密的进化关系。此外，赤子爱胜蚓（正蚓科）比Helobdella robusta（舌蛭科）更接近Capitella teleta（小头虫科），这与3者的进化关系是一致的。
研究结果表明，DEG的出现提示了不同浓度的镉暴露会对赤子爱胜蚓产生代谢和防御功能方面的影响。DEG数量似乎与镉浓度呈正相关。相应地，PCA图显示，对照组与各个处理组之间的距离随着镉浓度上升而梯度增加。结果表明，赤子爱胜蚓暴露在Cy60中所受的影响要比相对低剂量组（Cy30和Cy10）更大。DEG的GO富集结果揭示了所有比较组的DEG都显著富集到MF大类下与酶类应答相关的催化活性条目中。另外，KEGG通路分析中，DEG主要参与了氨基酸生物合成和糖酵解/糖异生。推测蚯蚓对导致生理胁迫的不同浓度镉暴露有着不同的转录应答。
金属螯合蛋白（MT）是一类富含半胱氨酸、低分子量的蛋白，人们已从蚯蚓中鉴定、克隆到MT的两个异构体并获取了其特征。MT通路这一金属解毒机制对于非必需金属和必要元素的解毒十分重要，因为它们对镉和铜有高度结合活性。Brulle等人发现，当蚯蚓处于金属离子暴露（尤其是镉暴露）时，MT对编码MT的转录本数量呈剂量依赖性增加。本研究观察到镉暴露个体内的MT1、MT2有高水平表达，且表达水平随着镉浓度上升而大幅增加。这些发现与前人报道的基质镉浓度上升诱导蚯蚓体内MT产生的现象一致。上述结果显示，增加MT 的表达水平是降低镉导致的毒害作用的有效途径。
植物络合素（PC）是麸光甘肽经由植物络合素合酶（PCS）催化缩合形成的。顾名思义，植物遭到某些金属微量元素的暴露后，PC能够高亲和度地络合金属，促进植物的金属解毒。此外，Brulle等人通过从镉暴露的赤子爱胜蚓中分离出PCS的编码基因，为PC存在于环节动物门提供了首个功能性的证据，提示PCS的基因表达是由镉诱导的胁迫引起的。本研究通过转录组测序方法发现了PCS基因，并使用qRT-PCR确认了PCS1a的表达水平。所有经过镉暴露的赤子爱胜蚓PCS1a表达水平均显著上升。PCS表达增加很可能是蚯蚓清除污染土壤中的镉元素并减低其毒害作用的有效途径。
内切-1,4-β-葡萄糖苷酶（EG）是一种纤维素酶，能够把纤维素水解为糖以通过发酵转化为生物乙醇，存在于真菌、细菌和无脊椎动物中。Nozaki等人在P. hilgendorfi蚯蚓的消化道中检测到内切-1,4-β-葡萄糖苷酶的活性，表明EG应该有助于蚯蚓对纤维素的消化。最近Ueda等人一直在分离、克隆赤子爱胜蚓中功能性表达的内切-1,4-β-葡萄糖苷酶基因（EfEG）。我们从本研究获取了EfEG基因序列并通过BlastN鉴定了它们。不同程度的镉暴露引起了EfEG基因表达水平显著地呈剂量依赖式下降。这提示了镉浓度上升可能通过下调EfEG基因的表达水平而阻碍了纤维素降解为糖的过程。
所有生物都存在细胞抗氧化防御系统，以抵御氧化胁迫下活性氧（ROS）的产生。超氧化物歧化酶（SOD）是一种抗氧化酶，可以保护生物免受氧化胁迫，也被用作评价重金属和有机化合物等外源物胁迫效应的生物标志。我们分析了镉胁迫下蚯蚓的SOD基因的表达水平。所有处理组中的SOD表达水平均显著上调。蚯蚓遭受胁迫时产生的这种SOD表达增加的情况与Maity等人的报道是一致的。他们发现，镉积累的增加会增强Cu/Zn-SOD的活性。因此，上调的SOD基因表达是为了保护蚯蚓免受氧化压力，并且能抵消土壤镉浓度增加诱导产生的超氧自由基。
与Y染色体性别决定区相关的高流动性基团box2（Sox2）是一种转录因子，在多功能干细胞诱导方面有关键作用。细胞转录网络逐步克服分化程序从而制造出多功能干细胞。大量实验和描述性研究表明，再生过程和多功能干细胞存在于种类繁多的环节动物之中。Xiao等人的实验表明，赤子爱胜蚓具备明确的针对不同截断情况的再生能力及策略。Zheng等人成功获取赤子爱胜蚓的Sox2全长基因。本研究在mRNA水平检测到Sox2。值得注意的是，Sox2基因在所有镉处理组中都有表达增加的情况，而且在10和60 mg/kg镉处理组中有显著增加（p<0.001）。过表达蚯蚓体内的Sox2基因可能是利用生物修复处理镉毒害的积极方向。
与Sox2相似，Sox4属于SOX（与Y染色体性别决定区相关的高流动性基团box）家族并且也是一种转录因子。Liu等人发现，microRNA-140调控的SOX4表达下调可抑制增殖并促进前列腺癌的凋亡。此外，Quiroz等人发现，在垂体发育过程中，Sox4b对于促甲状腺细胞和促性腺细胞的分化有重要作用。我们获取了Sox4b基因序列并发现Sox4b的mRNA表达水平在所有镉处理组中均有上升（p<0.05）。特别的是，Sox4b表达的上调，使得启动蚯蚓干细胞增殖以促进某些组织增殖、分化和再生过程的信号分子得以合成和激活。这可能是保护蚯蚓免受镉毒害的有效策略。
p53凋亡刺激蛋白2样蛋白（ASPP2）可通过C端与p53结合以刺激依赖p53家族针对前凋亡基因的转录活性。Rubinsztein和Wang等人均证实了ASPP2抑制细胞生长并刺激凋亡。Liu等人的研究表明，诱导ASPP2过表达可以促进肝癌细胞的凋亡性死亡以治疗癌症。此外，Li等人发现，在肾细胞癌中，ASPP2表达下调促进了细胞运动、生长并增加了细胞耐药性。本研究表明，所有镉处理组蚯蚓的ASPP2 mRNA表达水平有显著（p<0.001）下降趋势。蚯蚓中扰动的ASPP2信号提示了凋亡通路可能与镉诱导毒性的作用机制相关。
TP53调控的凋亡抑制因子1（TRIAP1）是一个含有76个氨基酸的小型进化保守蛋白。TRIAP1是由TP53诱导的细胞生存因子，在低水平的基因毒性胁迫下协助减少细胞死亡。Park和Nakamura发现，TRIAP1通过与热激蛋白70互作而阻断凋亡肽酶激活因子1和Caspase9凋亡复合物的形成，从而调控凋亡通路。而且，Adams等人发现，过表达TRIAP1会导致Caspase 9激活的减少并削弱了凋亡的诱导。我们发现，所有镉处理组蚯蚓的TRIAP1表达均有显著增强（p<0.001）。上调蚯蚓TRIAP1的表达可能会使得镉暴露引起的生理胁迫下的增殖潜力增加。
表5 DEG对应基因的FPKM值。
图6 qRT-PCR验证unigene
结论
在缺乏赤子爱胜蚓合适基因组信息的情况下，转录组分析成为了研究基因表达的有力工具。根据mRAN的比较分析，镉主要影响了富集在氨基酸生物合成和糖酵解/糖异生通路上的DEG。酶活性、代谢、氧化胁迫、再生和凋亡通路也受到了镉的影响。此外，RT-qPCR验证了MT、PCS、EfEG、SOD、Sox2、Sox4b、APPSP2 和 TRIAP1的基因表达水平。需要进一步明确这些分子反应以阐明它们作为生物标志的用途，这将有利于我们理解赤子爱胜蚓作为生物监测程序如何评估环境管控中的风险。
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