编译：热血本能，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国第三大癌症。传统的手术、放疗、化疗、生物治疗等综合治疗方法， 5年生存率仍较低，部分原因是对胃癌进展机制缺乏认识。已有研究表明环状RNA广泛参与糖尿病、神经系统疾病，尤其是癌症等生理和病理过程。环状RNA的异常表达促进癌症的发生和发展，鉴于环状RNA与肿瘤发生、发展的密切关系，环状RNA在胃癌中的作用及其机制值得深入研究。为了探究其潜在的机制，研究人员采用RNA-seq和qRT-PCR方法筛选了胃癌组织与正常组织间差异表达的环状RNA。并通过qRT-PCR方法确定候选环状RNA，以及用CCK-8和细胞侵袭试验测定细胞的增殖和侵袭能力等。研究者通过RNA-seq在胃癌组织中筛选出一种新的CircRNA circMRPS35，其表达与胃癌患者的临床病理特征及预后相关，并且circMRPS35在体内外均抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。机制方面研究者发现circMRPS35可以将组蛋白乙酰转移酶KAT7招募到FOXO1和FOXO3a基因的启动子上，从而诱导H4K5的乙酰化。而且circMRPS35还可直接与FOXO1/3a启动子区域特异性结合，激活FOXO1/3a的转录，并引发其下游靶基因表达，包括p21、p27、Twist1和E-cadherin等，从而抑制细胞的增殖和侵袭。总之，该研究结果不仅揭示了circMRPS35在调控组蛋白修饰的抗癌治疗中的关键作用，而且倡导通过circMRPS35/KAT7/FOXO1/3a通路来对抗胃癌。
论文ID
原名：CircMRPS35 suppresses gastric cancer progression via recruiting KAT7 to govern histone modification
译名：CircMRPS35通过招募KAT7来调节组蛋白修饰来抑制胃癌的进展
期刊：Molecular Cancer
IF：10.679
发表时间：2020.03
通讯作者：杨世明&胡长江
通讯作者单位：第三军医大学新桥医院消化内科
DOI号：https://doi.org/10.1186/s12943-020-01160-2
实验设计
结果
首先研究者采用RNA-seq法检测了3对胃癌组织及癌旁组织中circRNA的表达(图1a)。在这些样本中总共识别出了57623个不同的环状RNA，其中35120个环状RNA至少包含两个独立的反向剪接reads (图1b)。通过与circBase相比，结果中有29007个匹配的环状RNA和28616个新的环状RNA。其中大多数外显子环状RNA小于1500个核苷酸(nt)，中位长度约为500个nt (图1c)。接下来，作者又使用RefSeq数据库对这些确定的circRNA候选项进行了注释。发现这些环状RNA大部分来源于外显子，其他环状RNA与内含子、3 -UTR、5 -UTR、基因间区、反义序列等排列(图1d)。分析结果发现胃癌组织中有13个候选环状RNA被显著下调，9个被上调(图1e)，作者进一步通过qRT-PCR检测30对胃癌及癌旁组织中候选环状RNA的表达。结果显示有9个环状RNA具有统计学差异，其中来自MRPS35基因外显子2、3、4、5的hsa_ circ_0000384的p值最小。为了进一步阐明新型环状RNA circMRPS35的特性，研究者设计了发散引物和聚合引物分别对反向拼接产物和线性扩增产物进行扩增(图1g)。从图1h可以清楚的看出，不同的引物在cDNA中扩增出circMRPS35，而在gDNA中扩增不出circMRPS35。并且外显子2和外显子5的头尾拼接经Sanger测序证实(图1i)。鉴于环状RNA没有poly-A尾巴，作者在逆转录PCR过程中使用了random和oligo dT引物。从图1j可以看出，Oligo dT引物转录的circMRPS35的逆转录量要比随机引物转录的少很多。从图1k可以看出，circMRPS35相对于MRPS35的线性mRNA更能抵抗RNase R的消化。图1l显示，在MKN45细胞中，经转录抑制剂放线菌素D处理后，circMRPS35明显比MRPS35 mRNA更稳定。结果显示，circMRPS35是一个稳定的circRNA，并且在胃癌组织中表达量较低。
图1：人胃癌组织中环状RNA (circMRPS35)的鉴定与验证
2. CircMRPS35的表达与胃癌患者预后密切相关
随后研究者为了评价circMRPS35表达与临床病理特征的关系，对160对胃癌及其癌旁组织进行了原位杂交(ISH)。结果发现circMRPS35在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织(图2a和2b)。circMRPS35表达水平与肿瘤晚期转移(TNM)、淋巴转移及肿瘤大小呈负相关(图2c-2e)。受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析显示，基于circMRPS35的预测曲线下面积为0.6976，说明circMRPS35可用于预测患者的预后(图2f)。为了确定ROC曲线生成后的最佳截断值，找到了敏感性和特异性之间的平衡。为了使敏感性和特异性最大化，引入了约登指数，即最大值=敏感性+特异性- 1。由ROC曲线可知，当敏感性为77.23%，特异性为59.32时，约登指数最大。因此，此时circMRPS35表达的值是决定高表达水平或低表达水平的最佳截断值。从图2g可以清楚的看出，circMRPS35的低表达与胃癌患者生存时间的缩短密切相关。因此，circMRPS35在胃癌中具有明显的临床意义。
图2: CircMRPS35表达与胃癌患者预后良好相关
3. CircMRPS35在体外抑制胃癌细胞的增殖和转移
为了评价circMRPS35的功能，研究者使用qRT-PCR方法检测了circMRPS35在人胃癌细胞系和GES-1细胞中的表达情况。图3a显示，circMRPS35水平在SGC7901和MKN28细胞中相对较低，而在MGC803和MKN45细胞中相对较高。将其过表达质粒pCDH-CMVCircMRPS35转染SGC7901和MKN28细胞后，CircMRPS35较pCDH-CMV-Control载体明显升高，而MRPS35 mRNA和蛋白表达无明显变化(图3b)。图3c和d显示，circMRPS35在G1期显著抑制细胞生长，诱导细胞周期阻滞。图3e进一步揭示了circMRPS35抑制胃癌细胞侵袭的作用。此外，研究人员还设计了针对circMRPS35的反向剪接位点的siRNAs，这些siRNAs显著降低了circMRPS35的表达，但对MRPS35的mRNA和蛋白表达没有影响(图3f和3g)。此外，敲除circMRPS35可显著促进MGC803和MKN45细胞的增殖、细胞周期加速和侵袭(图3h-j)。总之，这些结果明确证实了circMRPS35在体外可以调节胃癌细胞的行为。
图3：CircMRPS35在体外抑制胃癌细胞的增殖和转移
4. CircMRPS35在体内抑制胃癌细胞的生长和转移
当然，研究人员随后检测了CircMRPS35在体内对胃癌细胞的调节作用。为了进一步阐明circMRPS35在体内的作用，研究者构建了具有circMRPS35增减功能的稳定的胃癌细胞系。如图4a-c所示，circMRPS35可降低异种移植小鼠的肿瘤生长和体重。并通过免疫组织化学染色(IHC)进一步表明，在circMRPS35过表达的肿瘤中，Ki-67和PCNA表达降低(图4d)。进一步研究表明，shRNA慢病毒下调MGC803中的CircMRPS35可增加肿瘤生长、肿瘤重量，增加Ki-67和PCNA的表达(图4e-h)。此外，小型动物活体成像系统和HE染色结果显示，circMRPS35在体内显著减少了裸鼠肺部的转移灶(图4i-l)。并且circMRPS35的下调增加了裸鼠肺转移灶的数量(图4m-p)。这些结果进一步证实了circMRPS35在体内能够抑制胃癌的生长和转移。
图4：CircMRPS35的表达抑制了胃癌细胞在体内的生长和转移
5. CircMRPS35通过转录激活FOXO1和FOXO3a来抑制胃癌的进展
为了探讨circMRPS35抑制胃癌细胞增殖和侵袭的机制，研究者随后通过RNA-seq分析来阐明circMRPS35敲除后的基因表达谱。通过GO富集和KEGG通路分析表明，在参与肿瘤的circMRPS35调控信号通路中，FOXO信号通路的相关性最强(图5a)。由于FOXO家族在哺乳动物中进化保守，由FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6 4个成员组成。外源性表达circMRPS35后检测其表达情况。图5b-d显示，circMRPS35显著提高了FOXO1和FOXO3a的mRNA和蛋白水平，但对FOXO4和FOXO6无明显影响。然而，CircMRPS35基因敲除对FOXO1和FOXO3a的磷酸化无明显影响。已有研究证实FOXO1的靶基因为p21和p27， FOXO3a的靶基因为Twist1、E-cadherin、Snail和Y-box binding protein 1 (YB-1)。图5e-f显示，circMRPS35相应改变了p21、p27、Twist1和E-cadherin的表达，而对Snail和YB-1没有明显的影响。此外，FOXO1的减少显著减弱了circMRPS35的表达，促进了p21和p27的表达，缓解了SGC7901细胞的细胞周期阻滞和增殖抑制(图5g-i)。FOXO3a敲低降低了circMRPS35诱导的E-cadherin表达，挽救了circMRPS35诱导的Twist1表达抑制和细胞侵袭(图5j和k)。荧光原位杂交(FISH)显示circMRPS35主要定位于SGC7901和MGC803细胞的细胞核中(图5l)，并通过核质RNA的分离分析进一步证实了这一点。双荧光素酶报告基因实验表明，circMRPS35显著提高了FOXO1和FOXO3a的启动子活性(图5n-5o)。综上所述，结果显示circMRPS35通过转录激活FOXO1和FOXO3a来抑制胃癌细胞的行为。
图5：CircMRPS35通过上调FOXO1和FOXO3a的转录活性来抑制胃癌的进展
6. CircMRPS35在胃癌组织中的表达与FOXO1和FOXO3a相似
接下来，研究者还调查了circMRPS35、FOXO1和FOXO3a在胃癌组织中的临床相关性。结果发现FOXO1或FOXO3a在胃癌组织中的表达均显著降低(图6a和6b)，并且FOXO1表达水平与肿瘤大小呈负相关，FOXO3a表达与TNM晚期及淋巴转移呈负相关(图6c和6d)。ROC曲线提示FOXO1和FOXO3a表达均可用于预测患者预后(图6e和6f)。FOXO1或FOXO3a的低表达与胃癌患者的低生存期密切相关(图6g和6h)。而且，FOXO1和FOXO3a的表达与circMRPS35的表达呈正相关(图6j和6i)。有趣的是，circMRPS35和FOXO1或FOXO3a低表达组的生存时间最短(图6k和6l)。综上所述，这些数据有力地说明circMRPS35介导的FOXO1和FOXO3a信号通路在胃癌中起着至关重要的作用。
图6：CircMRPS35在胃癌组织中的表达与FOXO1和FOXO3a相似
7. CircMRPS35将KAT7招募到FOXO1和FOXO3a基因的启动子中
为了进一步研究circMRPS35-激活FOXO1和FOXO3a转录的机制，研究者将MGC803裂解物与生物素化的circMRPS35探针孵育，然后进行RNA下拉实验和质谱分析(图7a)。可能参与转录调控的候选蛋白，包括基本转录因子3 (BTF3)、赖氨酸乙酰转移酶7 (KAT7)和TATA-box结合蛋白相关因子15 (TAF15)，在后续的验证试验中进行了评估。作者通过RIP和RNA下拉进一步证实，只有KAT7特异性地与circMRPS35结合(图7b和7c)。通过FISH和免疫荧光结果显示，circMRPS35与KAT7共定位于MGC803细胞核内(图7d)。分子对接表明，circMRPS35片段(反向剪接位点)与KAT7残基形成多个氢键相互作用，包括Trp-350、Asp- 430、arg483、Gly-485、tyr486、Gly-487、lys488、Lys- 524、Ser-592(图7e)。随后，作者设计了标记为flag的KAT7质粒的不同突变来分析KAT7和circMRPS35之间的相互作用(图7f)。RNA下拉实验明确证实了KAT7 (256-315aa) C2H2结构域对于其与circMRPS35的相互作用至关重要(图7g)。先前的研究表明，KAT7更倾向于在赖氨酸5处乙酰化H4，赖氨酸12处乙酰化H3，赖氨酸14处乙酰化H3。最近对人类基因组组蛋白乙酰化模式的研究表明，H4K5ac、H4K12ac和H3K14ac可能富集于FOXO1和FOXO3a的启动子区域。随后，ChIP实验结果发现，在MGC803细胞中，只有H4K5ac直接与FOXO1和FOXO3a的启动子区域结合(图7h和7i)。图7j显示了circMRPS35和H4K5ac在MGC803细胞核中共域化。RNA下拉和RIP实验表明H4K5ac与circMRPS35特异性相互作用(图7k和7l)。此外，circMRPS35、KAT7和H4K5ac的共域化被超高分辨率成像证实(图7m)，表明circMRPS35与H4K5ac和KAT7相互作用形成三聚体复合物。作者还进一步通过RNA纯化(ChIRP)法分离染色质表明circMRPS35直接与FOXO1和FOXO3a启动子区结合(图7o)。这些综合证据有力地表明，circMRPS35作为一个模块支架将KAT7招募到FOXO1和FOXO3a基因的启动子中。此外，KAT7敲除减弱了circMRPS35，增加了FOXO1和FOXO3a基因启动子中的H4K5ac水平(图7p和7q)。最终，KAT7的下调显著降低了circmrps35诱导的FOXO1和FOXO3a mRNA和蛋白的表达（图7r和7s）。综上所述，circMRPS35通过招募KAT7增加了FOXO1和FOXO3a启动子区域H4K5的乙酰化水平。
图7：CircMRPS35作为模块支架将KAT7招募到FOXO1和FOXO3a基因的启动子中。
8. CircMRPS35在胃癌增殖和转移中的作用机制。
在这个模型中, circMRPS35通过招募KAT7到FOXO1和FOXO3a基因启动子区域作为模块支架来改变组蛋白修饰模式, 从而增加其启动子区H4K5的乙酰化, 最终改变下游基因p21、p27、Twist1和E-cadherin的表达，抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。
图8：CircMRPS35在胃癌增殖和转移中的作用机制
结论
更多推荐
1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
联系客服
