编译：思越，编辑：十九、江舜尧。
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肿瘤微环境（TME）是无数信号分子形成的复杂网络，给人类癌症的新型治疗靶标识别带来了挑战和机遇。MicroRNA（miRs）由于其在不同水平上影响信号通路的能力，在寻求新型癌症治疗方法上至关重要，包括miRs在癌症发生，发展以及化学耐药性中的作用。miRs的经典途径是以mRNAs为靶点进行转录后基因沉默，对信号传导途径的一级调控中具有重要意义。此外，还发现miRs可通过非经典途径调控信号通路，例如充当Toll-like受体的配体或执行二级功能（例如调节蛋白质翻译和相互作用）。这篇综述主要介绍了miRs作为调控因子，在肿瘤信号转导中的作用方面取得的进展，以及作为TME信号转导通路的新调节因子的作用。
论文ID
原名：MicroRNAs as Emerging Regulators of Signaling in the Tumor Microenvironment
译名：肿瘤微环境中MicroRNAs正成为新兴信号调节因子
期刊：Cancers
IF：6.162
发表时间：2020年4月8日
通讯作者：Shahzad Nawaz Syed；Bernhard Brüne
通讯作者单位：法兰克福歌德大学医学院
DOI号：10.3390/cancers12040911
主要内容
1. MiRs的形成
miRNA是一类存在与动植物体内、大小为21-25nt的内源性非编码单链小分子RNA，对生物体转录后的基因表达调控起关键作用。在高等真核生物中，miRs作为重要的调控基因，通过结合到mRNA的3’非翻译区（3’UTR）行使转录后抑制基因表达的功能。miR的关键区域是5’末端的2-7个核苷酸，被称为“种子”区域，并通过microRNA响应元件miR response elements (MREs)进行“通信”。
MiR通常由内含子编码，先被RNA polymerase II或Ⅲ转录，一般最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾(AAAAA)的pri-miRNA。miRs的成熟是发生在细胞核和细胞质中的多步过程。pri-miRNA经“微处理器(microprocessor)”复合物剪切（由RNA特异性内切核糖核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白DGCR8组成），生成由70个核苷酸组成的不完全的前体RNA（pre-miR）。接着被核内转运蛋白Exportin5与核蛋白RNA的复合物识别，通过细胞核孔复合体被运输到细胞质后，被干扰素诱导蛋白激酶（PACT）和反式激活反应元件RNA结合蛋白（TRBP）等组成的复合物切割。随后Dicer整合到Argonaute（AGO）蛋白复合物中，形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。通过RISC复合体识别出特定靶点之后，成熟的miR通过与靶mRNA的3’UTR内的靶位点结合（见图1），从而诱导经典的转录后基因沉默。
图1. MiR的发生，交换和细胞间转移。（1）MiR的形成过程；（2）MiR可以从供体细胞输出到肿瘤微环境（TME）中，抑制受体细胞中的靶基因表达。（3）细胞外囊泡（外泌体，微囊泡，凋亡小体）、RNA结合蛋白（RBP）、低密度脂蛋白（LDL）等载体协助miR转运。（4）在细胞内，miRs装载至多囊泡体（MVB）中，与质膜融合释放miRs到腔外空间。（5）miR作用于靶标Toll样受体。
2. 肿瘤微环境的MiRS的发生和迁移
除了细胞内miR，细胞外miR参与TME中的多种组分和分子组装，发挥信号通路调节剂的功能。细胞外miR以自分泌或旁分泌方式，或封装在miR复合物装配体中诱导基质细胞的促肿瘤功能，如细胞外囊泡（EVs）外泌体，蛋白质/脂蛋白-miR复合物。直接转移到细胞中的病毒miRs并不依赖于细胞外囊泡。相比于凋亡小体，外泌体（10-100 nm）带有多囊小体（MVB）的腔内囊泡，通过与质膜融合释放到腔外空间。作为一种自发的生理现象，对细胞完整性十分重要。由于外泌体与受体细胞的相互作用，现认为两者之间传达“加密”信息。肿瘤来源的外泌体（Texo）富含miR，其分子组成与非恶性细胞的外泌体不同，可能表明某些miR由于旁分泌信号传导而转录。大量研究表明，miR在细胞之间，尤其在TME中发生交换，甚至miR加工机器也通过外泌体或凋亡小体在细胞之间运输，在确定其在癌症miR治疗药物中的用途中起着重要作用，以靶向TME中的信号传导。
除了细胞外囊泡介导miR迁移，在细胞外还检测到大量miR与RNA结合蛋白（RNP）的复合物，包括AGO2 以及核磷脂（NPM1）。AGO2结合的miR被神经菌毛蛋白1（NRP1）吸收，内部的miR仍保留调节癌细胞的增殖和迁移的功能。NRP2通过TAM促进肿瘤细胞凋亡碎片的胞吐，并促进肿瘤生长。RNP–miR复合体是否参与TME的信号调节仍需要研究。
在TME的高密度和低密度脂蛋白中，也发现了大量的miR，被认为是重要的转运蛋白。研究表明，高密度脂蛋白（HDL）介导的miR-223的转移抑制了内皮细胞中细胞间粘附分子1（ICAM1）的表达。在乳腺肿瘤中，发现巨噬细胞5通过CD36吸收非外泌体LDL-miR-37。
3. MiR在TME的经典途径
miR在体外可以靶向所有mRNA，并且每个miR可以基于其种子序列靶向多个mRNA 。因此，可以假设整个转录组部分受miRome调控。蛋白质调控是转录组调控的延伸，miR参与细胞信号传导的蛋白质的调节（图2A），涉及激酶的蛋白质磷酸化，磷酸酶和/或蛋白酶体降解引起的去磷酸化。研究表明，miR影响mRNA的蛋白表达。此外，miR介导的蛋白输出调节可在不同细胞类型中实现特定的表达模式，对维持生理稳态中起着重要作用。TME在病理生理相互作用至关重要，并受到miR调节。在TME中，miR将蛋白质作为“基因表达微处理器”，并通过细胞信号分子的相互作用网络发挥功能，每个步骤都与信号级联反应有大规模的协调。
广泛表达的基因倾向于受各种miR调控，广泛表达的miR也倾向于调控更多的靶基因，在蛋白质和miR中也存在类似的关系。然而，就转录后基因调控而言，miR通过直接靶向细胞核中的主要转录本，来调控其他miR的生物发生。研究发现，miR-709直接与核中pri-miR-15a / 16-1上的MRE结合，并阻止其加工成pre-miR-15a / 16-1，从而抑制了诱导细胞凋亡的miR簇miR-15a / 16 -1成熟（图2E）。此外，研究表明，miR-122阻止了miR-21的成熟，该miR-122与核中pri-miR-21的基础区域中的一个19nt含UG的识别元件结合，并阻止Drosha-DGCR8在肝癌细胞中将pri-miR-21转化为pre-miR-21。
由于miR种子序列与MRE之间存在特定的相互作用，因此MRE的类型决定了miR的作用。大多数MRE位于3'UTR中，此区域常受到切割和可变多聚腺苷酸化（APA）。全基因组研究表明，约50–70％的人类mRNA具有3'UTR亚型，并在多种癌症中发现APA介导的3’UTR缩短和MRE丢失。3'UTR截短的致癌基因转录物通常会失去miR调控，表现出更强的致癌特性。Nudix水解酶21（NUDT21）是APA的关键调节因子，敲低NUDT21增加了APA位点的使用，导致致癌转录本的3'UTR缩短，增加细胞增殖，迁移和异种移植的生长。通过NUDT21表达的恢复，保护了近端PAS位点不受NUDT21的切割，从而增加3’UTR延伸率和miRNA介导的转录抑制，并减少癌症生长。
图2 MiR作为TME中信号的调节剂。（A）miRs的经典途径包括与目标mRNA的3’UTR结合，以通过降低mRNA稳定性或降低翻译，行使转录后基因表达抑制；非经典途径包括通过与3’UTR结合而增加翻译，从而掩盖RNA结合蛋白的结合位点，防止mRNA降解；（B）miR-328以非依赖种子序列的方式，与翻译抑制剂异源核糖核酸蛋白E2（hnRNP E2）结合来防止CEBPA mRNA结合，从而保护CEBPA mRNA的翻译；（C）miR-10a与核糖体蛋白mRNA的5’UTR结合并增强其翻译。（D）MiR通过将转录激活因子募集到基因启动子中的互补元件上或通过充当转录调控RNA的支架来激活转录；（E）miR-709直接与pri-miR-15a/16-1上的19nt-MRE结合并阻断其进入pre-miR-15a/16-1的过程，从而抑制miR-15a/16-1成熟；（F）多个miR通过靶向3'UTR中的相应MRE共同调节靶mRNA，如PTEN被 miR-21, miR-106b, miR-93和miR-301共同调节
RISC复合物是影响TME中miR沉默效果的关键因素。RISC作为关键的酶组装体，可引导成熟的miR与靶mRNA的3’UTR结合，从而抑制靶基因。但在缺氧影响下，RISC复合物的活性会下调，降低miRs的基因抑制能力。研究证明，TME中的缺氧会增强表皮生长因子受体（EGFR）与AGO2的结合，从而提高AGO2-酪氨酸393的磷酸化，减少Dicer结合AGO2，抑制抑癌基因miR的加工。
mRNA上的多个MRE可能会产生mRNA-miR的调节网络，可能影响在TME的病理生理情况下的时空效应。癌细胞中PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）/ Akt（蛋白激酶B）和mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶标）信号转导中的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）是典型的范例，MiR-21在HER2 +和三阴性乳腺癌中过表达，并通过靶向PTEN来抑制自噬。此外，在乳腺癌组织中高表达的miR-106b，miR-93和miR-301，还通过P3K / Akt途径调节PTEN以增加细胞增殖。除了直接靶向PTEN的3’ UTR外，miR-425还可以通过上调细胞周期蛋白和过度激活PI3K / Akt途径来诱导乳腺癌细胞的生长和进程等。
4. TME中的非经典途径
转录后基因沉默是miRNA的经典作用方式，但是miRs还具有执行诸如激活转录的功能。miR通过靶向启动子元件激活基因转录的现象称为RNA激活（RNAa）。有研究发现内源性miR-589与启动子RNA结合来激活COX-2转录。此外，miR可以通过与富含嘌呤的双链DNA形成三螺旋结构而与基因启动子结合。这种相互作用可能会通过空间效应改变DNA的拓扑结构，并可能使转录因子结合，进而影响转录激活或抑制。在E-钙粘着蛋白和含冷休克结构域的蛋白C2基因（CSDC2）启动子中，包含miR-373互补位点。通过miR-373以序列互补依赖性方式将RNA聚合酶II（RNAP II）募集到启动子上，增强基因的表达（图2D）。miR-10a积极靶向了5’UTR核糖体蛋白mRNA，并增强了其翻译（图2C），从而积极控制了整体蛋白的合成。
鉴于miR在不同水平的基因调控中起作用，RNA介导的基因激活机制可能不仅只是转录水平或表观遗传的改变。通过记录几种miR（例如miR-369-3）基因表达的转录后激活因子的作用，发现这些miR可根据细胞周期进程的不同而增强TNF-α的翻译（图2A）因此，miR似乎通过各种机制上调了基因表达，但许多机制在分子水平上仍未完全理解（见图2）。
miR还可通过充当RNA诱饵，进而与互补mRNA或调节性RNA蛋白结合来调控基因的表达。由于miR以互补的序列特异性方式结合在mRNA靶标的3'UTR内，那miR可能通过占据特定mRNA中的RBP结合位点或作为诱饵竞争性地结合RBP本身而间接干扰RNA结合蛋白的活性，并抑制RBP-mRNA相互作用。miR-328通过其“非种子”序列的富含C簇，与聚（rC）结合蛋白异源核糖蛋白E2（hnRNP E2）特异性结合，并充当翻译抑制剂。反过来，这会在体内和体外阻碍CCAAT /增强子结合蛋白α（CEBPA）mRNA与hnRNP E2的结合，并恢复CEBPA mRNA的翻译（图2B）。
成熟miR是单链形式的RNA，具有特定的抗原二级结构。有文献报道，对于单链或双链RNA在TME中的免疫原性，但miR引起免疫应答仍需要进一步的研究。Fabbri发现miR-21和miR-29a可以分别充当TLR 7和TLR 8的特异性激动剂（见图1），肺肿瘤细胞通过外泌体分泌这些miR。被巨噬细胞吞噬并最终到达含TLR的内体。miR和TLR之间的相互作用引起转移性炎症反应，局部促进癌细胞生长，并通过核因子κB（NF-κB）激活和IL-6和TNF-α的分泌而转移。从机制上看，miR–TLR相互作用与miRs在转录上的调控作用均是通过互补序列特异性结合，因为miRs可能通过富含GU的基序（对于miR-21为GUUG，对于miR-29a为GGUU）结合TLR 7和TLR 8，这对于RNA-TLR识别至关重要。因此，通过充当旁分泌信号分子并触发TLR，miR可以充当TME信号的关键调节因子。
5. TME中MiR的级联效应
由于miR的靶基因组混杂，在TME条件下miR干扰信号传导级联的各种水平。NF-κB途径作为癌症和炎症中研究最深入的信号传导级联之一，可以被癌细胞中的miR直接或间接激活（图1），且NF-κB信号传导途径的关键成分和调节蛋白也处于miRs的直接控制之下，以调节NF-κB信号传导的活性。研究发现，在宫颈癌细胞中，上调的miR-130a直接靶向TNF-α的3’ UTR并降低了其表达。通过NF-κB/ miR-130a /TNF-α/NF-κB的负反馈通路，下调NF-κB活性，进而增强了miR-130a的表达。此外，还显示了miR-15a，miR-16和miR-223等miR在非经典NF-κB途径中起作用。在胃癌细胞中，通过在NF-κB途径中靶向IKKα激酶的miR-16的调控，认为miR-16是NF-κB反式激活靶标的证据。表面受体信号传导级联最终导致NF-κB活化，其中部分与miR在肿瘤进展和炎症反应中有关。肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）是一类多功能细胞内信号转导接头蛋白，通过miR（例如miR-146a / b）激活NF-κB，从而抑制乳腺癌细胞中TRAF6和白细胞介素1受体相关激酶（IRAK1）的表达。转化生长因子β活化激酶1（TAK1）作为信号转导和NF-κB活化的蛋白，在活化后通过特异性结合TAB 1-3衔接蛋白被TRAF6泛素化。
在炎性肿瘤环境中，miR积极参与细胞内和细胞间信号传导。在这种动态情况下，miRs会根据环境的提示而从进行调节，通过负反馈环或正反馈，上调或下调信号通路中涉及的许多靶基因，这使其成为癌症信号转导中最通用的调节剂。
评论
本文综述了miRNA在肿瘤微环境中的作用。miRs的经典途径是基于种子序列，将mRNA靶向转录后基因沉默，这在信号通路的一级调控中具有重要意义。此外，miR不仅抑制基因表达，在某些情况下还激活了基因表达，而且还靶向由细胞因子和生长因子触发的经典信号传导级联，并为其结构复杂性提供了理论依据。基于它们的化学结构和序列，它们可以充当其他调控RNA的支架，例如竞争性内源RNA（ceRNA），还可以充当诱饵和RNA调控蛋白激活基因的转录（图2）。二级结构还决定了miRs对邻近染色质的脱靶作用，从而影响基因表达。此外，还证明了miRs免疫原性与TLR的关系，为miRs作为TME中信号传导途径的新型调节剂的作用提出了自己的见解。
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