编译：思越，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
心肌缺血后心力衰竭（HF）是住院和死亡的常见原因，miR-21作为心脏纤维化的中央调节器，已经在小型动物模型中证明其作为治疗纤维化的靶点。然而，将治疗性反义微小核糖核苷酸（LNA-AntimiR）递送到大型动物的心肌仍具有挑战性。本文通过构建猪心衰模型，并通过导管将antimiR-21局部递送，以探究其适用性和治疗效果，并确定其对心脏转录组特征的影响和心肌细胞类型的变化。
论文ID
原名：AntimiR-21 Prevents Myocardial Dysfunction in a Pig Model of Ischemia/Reperfusion Injury.
译名：AntimiR-21可预防缺血/再灌注猪模型中的心肌功能障碍
期刊：Journal of The American College of Cardiology
IF：18.639
发表时间：2020年4月21日
通讯作者：Christian Kupatt & Stefan Engelhardt
通讯作者单位：慕尼黑工业大学
DOI号：10.1016/j.jacc.2020.02.041
实验设计
研究内容
1. AntimiR-21局部注射抑制miR-21的表达
作者首先确定短暂栓塞下miR-21的表达情况，发现短暂阻断左前降支（60分钟）后，左心室心肌的远区和边缘区的miR-21表达逐渐上调（图1A）。接着进行缺血/再灌注（I/R），5天内不进行治疗以形成疤痕，分别在I/R后第5天和第19天进行将LNA修饰的antimiR-21注入冠状动脉（图1B），在I/R损伤后33天，从左室缺血心肌制备的RNA通过qRT-PCR发现，冠状动脉内注射antimiR-21导致miR-21表达显著降低（-66%）（图1C），且发生在边缘区而不是远端。并在补充试验证明，心脏、右心室、左心房和右心房其他区域的miR-21水平没有改变，肺和肾脏的miR-21适度降低，且肝肾功能更完整，未发现心律失常或死亡。表明局部注射LNA-antimiR-21对猪心衰模型左室心肌miR-21的长期抑制是有效的。
图1 注射LNA-修饰的AntimiR-21后对miR-21的抑制功效。（A） miR-21在缺血后心肌中的表达。（B）实验策略。短暂栓塞60分钟后，灌注33天。在再灌注损伤的第5天和第19天，用导管局部注射antimiR-21，并展示了 miR-21, LNA-antimiR-21, 和LNA-antimiR-control的序列，其中灰色区域表示种子序列，红色部分表示与miR-21互补的碱基。（C） 局部注射LNA-antimiR-21或LNA-antimiR-control后miR-21的表达。
2. miR-21的减少，降低了I/R诱导的不良心肌重塑
接着作者探究了LNA-antimiR-21对心肌重塑的影响（图2）。在I/R后33天，均观察到明显的不良心脏重塑，包括心脏重量与体重的比率显著增加、心肌细胞肥大和心肌纤维化。但在AntimiR-21注射组中，心脏不良重塑表现均降低（图2A至2C）。作者接着评估了与心肌重塑相关的关键病理过程，包括成纤维细胞增殖、炎症和血管生成（图2D至2F）。与对照组相比，免疫荧光染色显示成纤维细胞增殖和巨噬细胞浸润在AntimiR-21注射组被显著抑制，但未观察到毛细血管密度的变化（图2F）。并通过qRT-PCR验证了心肌细胞mRNA的表达水平，也发现与心肌重塑相关的基因表达在AntimiR-21注射组显著下调。补充资料显示，左心室远端有关心肌重塑的上述参数和表达几乎没有发生变化。
图2 miR-21的抑制，保护心肌免受I/R诱导的心肌肥厚和纤维化。（A）心脏重量与体重的比。（B）心肌边缘区切片麦胚凝集素染色（左）和定量数据（右）；（C）心肌的天狼星红/快绿胶原蛋白染色；（D）心肌边缘区波形蛋白染色（成纤维细胞）；（E）心肌边缘区CD68染色（巨噬细胞）；（F）心肌边缘区抗CD31抗体染色测定毛细血管密度；（G）胶原基因（Col1a1、Col1a2和Col3a1）、平滑肌肌动蛋白（Acta2）和心肌肥大相关基因（Nppa、Nppb和Myh7）的mRNA水平检测。
3. AntimiR-21局部注射改善心肌功能
为了评估抑制miR-21对心功能的影响，在缺血前（第0天）、第5天（注射AntimiR-21前）、缺血后第33天进行侵入性血流动力学测量，并在第0天和33天记录射血分数和心肌血流灌注量，并在第33天收集组织。相比于对照组，AntimiR-21注射组减少了整体心肌功能显著下降，舒张末压升高，左室卒中量减少，收缩率降低等明显心衰表现（图3A至3E），并增加了心功能储备（图3D和3E）。通过声纳微测量法测量心内膜下节段的缩短，评价左心室功能。根据血流动力学分析，AntimiR-21注射组相比于对照组，在静息和起搏（140次/min）条件下改善了局部收缩性（图3F）。注射造影剂后的荧光透视同样显示，在第33天AntimiR-21注射组的射血分数下降显著小于对照组（图3G）。
图3 AntimiR-21局部注射改善整体和局部心肌功能。（A） I/R后第33天的压力-体积关系；（B～E）PV分析测定的整体心肌功能指标，（B）左室舒张末压（C）每搏输出量（D）收缩速度（E）舒张速度；（F）第33天心内膜下节段缩短；（G） I/R损伤前和再灌注后第33天射血分数变化
4. AntimiR-21使心肌衰竭的转录特征恢复正常
作者使用RNA-seq技术探究抑制miR-21对猪模型的疾病相关基因表达影响。将AntimiR-21注射组、对照组和假手术组（每组n=3）左室缺血心肌进行RNA测序，并使用参考基因组（Sus scrofa version 11.1）进行mapping，共比对上1.12亿个reads（图4A）。主成分分析显示，在3个不同实验组中，数据集之间存在明显分离，且高度同质（图4B）。通过TargetScanHuman分析与miR-21相关的靶基因，发现抑制miR-21后，相比于不含miR-21位点的mRNA，miR-21的靶基因表达明显下调（图4C）。
5.AntimiR-21抑制了衰竭心肌的促纤维化和炎症转录标志物
接着作者去确定心衰模型中miR-21调控涉及的生物过程。通过对差异表达基因的GO富集分析显示，主要涉及与组织重塑相关的过程，包括细胞外基质组织、细胞粘附、成骨细胞分化和炎症反应（图4D和4E左）。抑制miR-21对炎症和免疫反应的影响最强，其次是ERK-MAP激酶活性（图4D和4E右）。接着作者通过WB验证了AntimiR-21抑制ERK-MAP激酶的蛋白表达，免疫荧光染色确定其主要发生在心脏成纤维细胞中（图4G）。
图4差异表达分析揭示AntimiR-21局部注射后抑制了miR-21靶点。（A）RNA-seq测序流程；（B）主成分分析；（C）miR-21位点相关基因Fold Change累积分布；（D）差异表达基因的GO富集分析；（E）差异表达基因与相关GO条目的弦图；（F）心肌裂解物的磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）和非磷酸化ERK（tERK）的免疫印迹；（G）pERK阳性心肌细胞占比的免疫荧光染色
6. 使用反卷积方法确定心脏巨噬细胞和成纤维细胞是AntimiR-21治疗的关键细胞类型
作者认为，在心肌中观察到的转录变化，可能源于细胞类型的比例改变，试图通过反卷积算法去推测心肌内的细胞比例变化。由于现有的小动物单细胞数据集含有的心肌细胞类型很少，且丰度低。于是，作者使用从小鼠心脏筛选的4种主要心肌细胞类型（心肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞）的转录组数据，以及单细胞测序数据（图5A），并将以上4种细胞中的特异性最高且丰度最高的特征基因合并取交集（图5B），构建反卷积特征矩阵。并通过UMAP算法识别出每种细胞高特异度的特征基因（图5C），进而验证特征矩阵的有效性。最后通过构建的反卷积算法，去探究相关细胞类型比例的变化。结果发现，巨噬细胞和成纤维细胞数量显著增加是衰竭心肌的重要特征，且AntimiR-21注射组显著地逆转了以上两种细胞的变化。综上，这种基于RNA-seq数据的无偏估计可以定量的方式确定细胞组分，并证实了AntimiR-21治疗有利于相对细胞组分的稳态恢复。
图5 RNA-seq结合基因反卷积方法揭示巨噬细胞和成纤维细胞在AntimiR-21治疗的作用。（A）反卷积构建流程；（B）根据基因在细胞类型的丰度和特异性取交集；（C）巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞特征矩阵中的前3个富集基因的UMAP特征和小提琴图；（D）基于反卷积方法估计心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的相对比例。
评论
本文为大型心力衰竭动物模型中miR-21抑制的可行性和疗效提供了证据，AntimiR-21有效抑制了miR-21的重塑相关功能（图6）。在缺血再灌注损伤后的第33天，经LNA-21处理的心脏降低了纤维化和肥大状态，并改善心脏功能。RNA-seq分析显示，AntimiR-21治疗后的心肌中，miR-21靶基因组被显著下调，并抑制了炎症反应和促有丝分裂的蛋白激酶信号。通过心肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞RNA-seq数据和单细胞RNA序列数据构建反卷积特征矩阵分析发现，巨噬细胞和成纤维细胞的数量减少是AntimiR-21治疗的关键。然而，作者也同时发现AntimiR-21也造成肺部和肾脏的miR-21的基因被敲除，可能会引起其他器官的副作用，需要借助载体系统、细胞特异性靶向等方法克服该局限性。
图6 AntimiR-21通过作用于心肌巨噬细胞和成纤维细胞防止心肌重塑
更多推荐
1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
联系客服
