编译：秦时明月，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：A Natural Variation in PLEIOTROPIC DEVELOPMENTAL DEFECTS Uncovers a Crucial Role for Chloroplast tRNA Modification in Translation and Plant Development
译名：多效性发育缺陷基因的自然变异揭示了叶绿体tRNA修饰在翻译和植物发育中的关键作用
期刊：The Plant Cell
IF：8.631
发表时间：2020.4
通讯作者：陆平利&罗小金
通讯作者单位：复旦大学&河南大学
DOI号：10.1105/tpc.19.00660
实验设计
本实验所用植物材料为水稻品种187R (Oryza sativa)以及非洲野生稻(Oryza longiestinata)。研究人员对利用两个品种所构建的近等基因系进行了一系列表型与生理指标实验，包括光合色素含量和Fv/Fm的测定、透射电子显微镜观察、石蜡切片及细胞大小观察、种子萌发与植物生长测定。之后对引起表型变异的基因PDD进行了图位克隆，并利用遗传互补实验及CRISPR/Cas9介导的基因组编辑构建了突变体来确定PDD基因的功能。然后，对PDD基因进行了序列和系统发育分析、亚细胞定位、酵母双杂交、双分子荧光互补、蛋白质免疫印迹、原核表达及其酶活性分析等，并构建了转基因PDD水稻植株，对转基因植株进行了一系列RT-qPCR、GUS组织染色、生理指标分析，并进行了代谢组与转录组分析以明确PDD基因的分子机制与介导的信号通路。
结果
1 NIL-PDDOL显示出多效性发育缺陷
为了利用自然变异来鉴定水稻的功能基因，研究人员从水稻回交后代中构建了近等基因系。水稻品种187R作为轮回亲本，非洲野生稻作为供体亲本。在这个群体中，研究人员鉴定出一个近等基因系具有严重的多效性发育缺陷，对该近等基因系与187R杂交产生的F2代的遗传和表型分析表明，这些缺陷是由单个隐性基因位点引起的。根据表型缺陷，研究人员将187R的等位基因命名为PDD187R，非洲野生稻的等位基因命名为PDDOL，近等基因系命名为NIL-PDDOL。
表型分析表明，在5叶期之前，NIL-PDDOL的新生叶片呈白化状态，幼苗发育过程中逐渐变绿，但边缘仍呈白化状态(图1A和1B)。但在5叶期后，新形成的叶片呈正常绿色(图1B)。NIL-PDDOL的光合色素含量在三叶期明显低于187R(图1C)，但在发育后期恢复到187R的正常水平(图1C)。鉴于光合色素与叶绿体发育的密切关系，研究人员用透射电镜比较了187R和NIL-PDDOL中叶绿体的超微结构。187R叶片细胞含有正常的叶绿体，叶绿体结构整齐，基粒和类囊体膜正常堆叠(图1D和1E)。相比之下，NIL-PDDOL的细胞严重空泡化，缺乏良好的板层结构(图1F和1G)。然而，NIL-PDDOL在发育后期的细胞有发育良好的叶绿体。研究人员还比较了187R和NIL-PDDOL的光合能力，在三叶期，代表PSII光化学最大量子效率的Fv/Fm值显著低于187R。
此外，NIL-PDDOL植株在整个生命周期中株高和分蘖数均显著降低(图1H-1J)，与187R穗部相比，NIL-PDDOL穗部明显变短，分枝数减少(图1K)，所有节间均显著缩短(图1K和1L)。节间截面的显微镜观察表明，NIL-PDDOL的矮小是由于较小的细胞尺寸造成的(图1M)。此外，尽管NIL-PDDOL的籽粒大小与187R相似，但NIL-PDDOL植株的每穗粒数、结实率和千粒重都降低了，因此导致单株产量大大降低。
2 PDD基因的图位克隆与鉴定
为了鉴定导致NIL-PDDOL多效性缺陷的基因，研究人员进行了图位克隆，利用200株来自NIL-PDDOL与187R杂交的F2植株，初步将PDD位点定位在8号染色体的长臂上(图2A)。为了对PDD进行精细定位，研究人员将NIL-PDDOL与9311杂交，通过分析9000株BC1F2植株，进一步将PDD基因缩小到一个35kb的区间，这里包含日本晴参考基因组中的5个候选基因(CG)(图2A)。其中，CG1和CG3是完全重复的基因。CG2、CG4和CG5分别注释为编码表达蛋白、TrmE家族tRNA修饰GTPase和肽酶。根据基因组注释和现有的mRNA表达数据，研究人员推测CG4或CG5可能是多效性缺陷基因。
研究人员进行了遗传互补实验，以确定哪个基因是PDD。研究人员从187R(图2B)中分离了两个含有CG4或CG5基因片段的独立的二元结构，并分别将这些二元结构转入NIL-PDDOL，并获得了12个CG4结构的独立T0株系和10个CG5结构的独立T0株系(图2B)。在含有CG4(LOC_Os08g31460)互补结构(图2C和2D)的转基因植株中，修复了NIL-PDDOL的表型缺陷，包括色素含量、分蘖数和株高，相反，CG5基因组片段未能挽救NIL-PDDOL的发育缺陷。因此，CG4(LOC_Os08g31460)位点确定为PDD。
为了进一步证实PDD的功能，研究人员通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑构建了pdd突变体，并针对PDD的第一和第二外显子设计了两个不同的gRNAs (图3A)。将含有gRNAs的载体转入187R后，研究人员获得了15个独立的T0株系，经过基因分型，研究人员在3个T0系(pdd-1/+，pdd-2/pdd-3，pdd-4/pdd-5) PDD的两个位点上发现了5个不同的基因组编辑等位基因(图3A)，预测这3个T0系将产生截短蛋白。然而，pdd-2/pdd-3和pdd-4/pdd-5植株存活时间较短，都在五叶期之前死亡，表明这两个等位基因组合突变过于有害，导致植株不能存活到成年期，然而，在包含下代pdd-1/+的96个株系的群体中，研究人员获得了4株完成了生命周期的pdd-1纯合子植株。
基因分型显示pdd-1在第一外显子有1个1bp的T插入，在第二个外显子有1bp的A插入，预测产生一个带有提前终止密码子的mRNA (图3A)，这可能导致一个N端只有35个氨基酸的截短蛋白产生。为了确定这两个小的DNA多态性是否导致pdd-1中无义介导的mRNA衰退，研究人员通过RT-qPCR检测了187R和pdd-1中PDD的mRNA水平。pdd-1对PDD mRNA水平无影响，提示pdd-1突变不改变PDD mRNA丰度。表型分析表明，pdd-1表现出与PDDOL相比相似但更严重的发育缺陷，进一步证实了NIL-PDDOL的多效性缺陷基因为PDD。
此外，对pdd-1/+杂合植株种子群体的遗传分析表明，纯合个体的比例(~16%)远低于预期，这意味着可能有一部分纯合胚未能发育成成熟种子。此外，对187R、NIL-PDDOL和pdd-1的种子萌发和植株生长的表型分析表明，与187R和NIL-PDDOL不同，pdd-1的大部分种子可以萌发但不能成苗(图3F和3G)，进一步证明PDD是水稻正常发育所必需的。这些结果还表明，非洲野生稻自然变异的是一个相对弱的等位基因。
3 PDD编码叶绿体TrmE家族蛋白
在水稻基因组中，PDD被注释为属于TrmE(tRNA修饰E)家族的tRNA修饰GTPase，系统发育分析表明，从细菌到人类的大多数生物只含有一个TrmE基因，这意味着TrmE的拷贝数在进化过程中往往受到严格的自然选择。
蛋白质结构的生物信息分析表明，PDD具有一个预测的叶绿体靶向信号，一个约120个氨基酸残基组成的保守的N末端结构域，一个大约170个残基的中心G结构域，以及一个高度保守的CxGK基序(其中“x”代表任何残基)的C末端区域(图4A)。多重蛋白质序列比对揭示了该蛋白N-末端结构域的两个新的保守区(命名为R1和R2)(图4A)。G结构域包含4个典型的基序(G1~G4)，这是 GTPase的典型特征(图4A)。此外，PDD在植物间高度保守，与玉米和高粱的同源物有80%以上的序列同源性，与拟南芥的同源物有60.9%的同源性。
为了探讨PDD基因的分子功能，研究人员用RT-qPCR方法研究了PDD基因在187R中不同组织的表达模式，结果表明，PDD基因转录本在发育过程中的绿色组织中优先表达，包括苗期的叶片和分蘖期的叶和鞘，而在根、茎和圆锥花序等其他组织中的表达量较低(图4B)。另外，研究人员构建了PDD187R的2167bp启动子区域驱动GUS报告基因的载体，并将其转化粳稻品种日本晴。研究人员在不同发育阶段的不同组织，如叶片、种子、根、圆锥花序和子房的胚胎中检测到GUS信号(图4C)。为了检测PDD的亚细胞定位，研究人员构建了Pro35S：PDD187R-eGFP融合载体，并将其导入水稻原生质体。GFP信号与来自叶绿素的自发荧光信号共定位(图4D)，表明PDD是一种定位于叶绿体的蛋白。
4 PDDOL的自然变异影响了同源二聚体的形成和GTPase活性
为了鉴定PDD187R和PDDOL之间的遗传变异，研究人员克隆了PDD187R和PDDOL的基因组序列，包括它们的启动子区域。序列比对发现在两个品种之间存在SNPs和Indels多态性(表1)，与PDD187R相比，PDDOL的蛋白编码区有一个6bp的缺失和28个SNPs (表1)。这些DNA多态性被预测会导致N端开始处的两个氨基酸(氨基酸)缺失和整个蛋白区的五个氨基酸残基替换(图5A)。为了确定PDDOL在体内是否有缺陷，研究人员构建了一个包含PDDOL编码序列的载体，该序列由来自PDD187R的2167 bp的天然启动子驱动(图5B)。所有16个株系都表现出与PDDOL植株高度相似的表型(图5C-5D)，表明PDDOL是一种功能失调的蛋白质。
为了研究PDDOL的变异是否会影响其mRNA丰度，研究人员通过RT-qPCR检测了187R和NIL-PDDOL中PDD的表达。与187R相比，NIL-PDDOL的mRNA水平降低，这表明PDDOL可能具有更强的启动子或其mRNA的稳定性发生改变。此外，考虑到有两个氨基酸缺失和一个氨基酸替换，研究人员将Pro35S：PDDOL-eGFP载体导入水稻原生质体。结果表明，GFP信号仍然定位于叶绿体，正如对PDD187R (图4D)所观察到的那样，这表明PDDOL的叶绿体定位没有受到这些变化的影响。
N-末端结构域主要介导TrmE家族成员的二聚化，G结构域负责GTP结合和水解。为了确定PDDOL的哪个结构域变异导致该蛋白的功能障碍，研究人员对PDD187R和PDDOL的二聚化及GTPase活性进行了检测。酵母双杂交(Y2H)实验表明PDD187R成功地形成了同源二聚体，但PDDOL没有形成同源二聚体(图5E)。此外，BIFC显示PDDOL失去了形成二聚体的能力(图5F)。最后，为了确定PDDOL的GTPase活性是否也受到影响，研究人员在大肠杆菌中表达并纯化了PDD187R和PDDOL，并用GTPase比色法检测了它们的GTPase活性。结果表明，PDD187R具有很强的GTPase活性(图5G)，而PDDOL的GTPase活性较低(图5G)。综上所述，研究人员的结果表明，PDDOL的变异既导致该蛋白不能形成同源二聚体，也导致其GTPase活性降低。
5 PDD参与水稻叶绿体tRNA的mnm5s2U修饰
鉴于PDD及其TrmE家族同源物的相似序列和蛋白质性质(图4A和图5E-5G)，研究人员推测PDD可能修饰了水稻叶绿体中的tRNA。为了验证这一假设，研究人员用LC-MS/MS检测了187R和NIL-PDDOL叶绿体中tRNA的修饰。首先，研究人员从187R和NIL-PDDOL幼苗三叶期新鲜叶片的叶绿体中纯化了总tRNAs。随后，这些tRNA被完全消化成单独的核苷用于LC-MS/MS (图6A)。研究人员使用多反应监测模式检测到了23种不同类型的tRNA修饰，包括发现与不同TrmE蛋白相关的6种类型，并鉴定出18种修饰的核苷具有分离良好、清晰的离子峰(图6B-6D)。通过比较187R和NIL-PDDOL的修饰水平，发现17种修饰的相对量没有明显的差异(图6E-6G)，但是NIL-PDDOL的mnm5s2U修饰水平明显低于187R(图6G)。研究人员检测了转基因互补株系中叶绿体tRNAs的修饰状态，发现这些株系中修饰的mnm5s2U核苷水平已完全恢复到187R的水平 (图6H)，这些结果表明PDD与水稻叶绿体tRNA的mnm5s2U修饰有关。
此外，为了研究NIL-PDDOL的绿色叶片在发育后期是否恢复了tRNA修饰，研究人员测定了187R的mnm5s2U和从6叶期幼苗分离的NIL-PDDOL叶绿体中mnm5s2U的水平。NIL-PDDOL叶绿体tRNA中mnm5s2U的水平仍然低于187R (图6I)，表明mnm5s2U的修饰水平在发育后期仍然没有恢复。
6 与光合作用和核糖体生物发生相关的叶绿体蛋白水平在NIL-PDDOL中显著降低
鉴于tRNA修饰会影响翻译的保真度和效率，研究人员用免疫印迹法检测了187R和NIL-PDDOL三叶期叶片的光系统I(PSI)亚基PsaB、光系统II(PSII)亚基D1和D2、Rubisco大亚基(RbcL)这4种参与光合作用的关键蛋白水平。与187R相比，NIL-PDDOL中D1和D2几乎缺失，并伴有RbcL和PsaB水平的显著降低(图7A)。这些结果表明，参与光合作用光反应和固碳反应的蛋白质在NIL-PDDOL中受到很大影响。此外，研究人员在187R和NIL-PDDOL中检测了叶绿体转录和翻译系统相关的蛋白质水平，包括PEP (质体编码的RNA聚合酶；RpoA，RpoB和RpoC2)和叶绿体核糖体的亚基(RPS2，RPS3，RPS12，RPL2和RPL16)水平。结果表明，NIL-PDDOL的RpoA、RpoB和RpoC2水平高于187R(图7A)，暗示NIL-PDDOL叶绿体的转录系统可能被增强。然而，NIL-PDDOL中核糖体亚基的蛋白水平显著降低，尤其是RPS2、RPS3和RPL2(图7A)，表明NIL-PDDOL叶绿体中核糖体亚基的积累受到严重损害。
为了确定NIL-PDDOL中蛋白水平的改变是否是由相应的基因表达变化引起的，研究人员用RT-qPCR方法比较了编码上述蛋白的基因在187R和NIL-PDDOL中的mRNA水平。PsaB、D1、D2和RbcL等由PEP转录的光合作用相关基因的mRNA水平在NIL-PDDOL中显著降低(图7B)。然而，与187R相比，由NEP (核编码RNA聚合酶)转录的如rpoA、rpoB、rpoC2、rps2、rps3、rpl2和rpl16等与转录和翻译相关的mRNA水平在NIL-PDDOL中显著增加(图7B)。
NIL-PDDOL中叶绿体核糖体蛋白亚基的积累减少，但其mRNA表达水平增强，这与叶绿体核糖体生物发生缺陷突变体的研究结果类似，因此，研究人员利用分子生物学方法分析了187R和NIL-PDDOL中rRNA的组成和含量。叶绿体核糖体有一个50S大亚基和一个30S小亚基，包含23S、16S、5S和4.5S rRNA和核糖体蛋白。与187R相比，NIL-PDDOL的16S和23S rRNA水平均显著低于187R(图7C)，表明NIL-PDDOL的叶绿体核糖体生物发生受到很大影响。为了研究质体编码蛋白水平在发育后期是否恢复，研究人员分析了187R和NIL-PDDOL植株6叶期绿叶中上述蛋白质的水平，NIL-PDDOL中这些蛋白质的水平在发育后期几乎完全恢复到187R的水平。
7 NIL-PDDOL中叶绿体mRNA转录平衡严重失调
为了深入研究PDD对叶绿体mRNA积累的影响，研究人员用3个生物重复的高通量全转录组测序比较了10日龄(三叶期) 187R和NIL-PDDOL幼苗叶绿体基因的表达谱。48个叶绿体基因的表达水平差异超过2倍。RNA-seq检测到的差异表达基因与RT-qPCR(图7B和图8)获得的数据一致，验证了RNA-seq数据的可靠性。根据叶绿体基因的转录，可以将其分为三类：I类基因主要由PEP转录；II类基因同时由NEP和PEP转录；而III类基因只有由NEP转录。有趣的是，在NIL-PDDOL中，I类基因mRNA水平降低，如编码PSI相关蛋白、PSII相关蛋白和Rubisco大亚基(RbcL)的基因(图8)，表明PEP活性在NIL-PDDOL中是缺陷的。然而，编码PEP和叶绿体核糖体蛋白亚基的III类基因在NIL-PDDOL (图8)中的表达水平大大增加，表明NEP介导的转录的活性在这些植株中得到了增强。
8 大量核基因在NIL-PDDOL中的表达发生改变
叶绿体的发育是由叶绿体和核基因的协同表达调控的，叶绿体中发育或基因表达的改变可以引起核基因表达的巨大变化。为了研究NIL-PDDOL中所有核基因表达的变化，研究人员进一步分析了RNA-seq数据。与187R相比，NIL-PDDOL中1520个核基因表达增加，2377个核基因表达降低(图9A)。
研究人员通过GO富集分析，利用AgriGO进一步对差异表达水平的基因进行了分类，包括与生物学过程、分子功能和细胞成分有关的基因。在NIL-PDDOL和187R中，糖/多糖代谢、应激反应、细胞含氮化合物代谢和二萜类代谢的生物学过程显著富集，而在分子功能中，水解酶活性、肽酶抑制剂活性、阳离子结合活性相关基因富集程度最高；在细胞成分中，胞外区、质体和质外体基因的富集程度最高(图9B)。
在NIL-PDDOL与187R中表达下调的基因中，在生物学过程中富集最多的是光合作用、氧化还原、离子运输、固碳和植物细胞壁组织相关基因。对于分子功能，最丰富的GO分类包括氧化还原酶活性、四吡咯(叶绿素的前体)结合、Rubisco活性、催化活性和转运蛋白活性。在细胞成分中，前五个GO分类是类囊体、细胞质小泡、光系统、叶绿体和质体(图9C)。此外，分析表明，在NIL-PDDOL中表达降低的PhANGs主要参与PSI和PSII、光捕获、碳固定和电子转运过程。此外，GO分类中植物细胞壁组织包括16个编码expansin家族蛋白的基因，它们与植物细胞生长密切相关。如RNA-seq数据热图与RT-qPCR结果所示，与187R相比，NIL-PDDOL中所有16个expansin基因的表达都大大降低(图9D)，这些结果与NIL-PDDOL中细胞尺寸的减小(图1M)一致。
结论
本研究解析了187R中PDD的分子机制和NIL-PDDOL中PDDOL功能受损的分子机制。在187R中，PDD187R将叶绿体tRNA中的尿苷修饰为mnm5s2U，确保了叶绿体中准确和高效的翻译，从而促进了植物的正常发育。在NIL-PDDOL中，PDDOL功能缺陷导致叶绿体tRNA修饰降低，从而影响叶绿体的保真度和翻译效率。因此，叶绿体的异常翻译导致核糖体生物发生受损和光合蛋白水平降低，进而导致NIL-PDDOL幼苗的白化。此外，作为对逆行信号的响应，NIL-PDDOL细胞核内PhANGs和expansin家族基因的转录水平降低，导致细胞体积变小，植株矮小。
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