编译：寒江雪，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Overexpression of bHLH95, a basic helix–loop–helix transcription factor family member, impacts trichome formation via regulating gibberellin biosynthesis in tomato
译名：番茄中过表达bHLH9调节赤霉素的生物合成影响毛状体的形成
期刊：Journal of Experimental Botany
发表时间：2020.3.5
通讯作者：刘明春
通讯作者单位：四川大学生命科学学院
DOI 号：10.1093/jxb/eraa114
实验设计
结果
1 鉴定SlbHLH95为番茄表皮毛形成调控因子
以野生潘那利番茄( Solanum pennellii)与栽培番茄为亲本，构建了10号染色体的渐渗系（IL10-2），与亲本相比，其茎部的毛状体密度变大（图1a）。bHLH家族基因可以调节拟南芥的毛状体形成，IL10-2 中SlbHLH95的转录水平是M82的15倍，而SlbHLH65几乎没有差异（图1b）。
RNA-Seq和RT-qPCR研究表明，SlbHLH95组成性表达，在成熟的果实中转录水平最高，在有高密度毛的茎中转录水平最低（图2a和b），表明SlbHLH95的表达可能与组织中的表皮毛存在负相关。共聚焦激光扫描显微镜分析表明，SlbHLH95定位在细胞核中，与其预测的TF活性一致（图2c）。
图1不同番茄毛状体表型差异。a M82和IL10-2茎部毛状体密度；b RT-qPCR分析SlbHLH95和SlbHLH65的mRNA表达水平。
图2 SlbHLH95的表达模式与SlbHLH95蛋白的亚细胞定位。a SlbHLH95基因在不同组织中的表达水平。b SlbHLH95在不同组织中的相对mRNA表达量。c 亚细胞定位结果。
2 过表达SlbHLH95导致毛状体减少
构建过表达材料SlbHLH95-OE，选取三株SlbHLH95表达量升高了100- 120倍的植株进行进一步研究（图3a）。与野生型相比，SlbHLH95-OE植株茎上毛状体数量明显减少，主要是I型毛状体减少，叶上V型毛的减少叶片中的总毛也减少（图3b-e）。在过表达株系中，调节番茄毛状体的形成的SlCycB2显著下调（图3f），SlGAMYB2、SlGASA4和SlANT1也显著下调（图3g-i），而SlWoolly基本没变化（图3j）。
图3 SlbHLH95过表达系在茎和叶上的毛状体数量减少。a SlbHLH95在过表达植株中的表达。b 茎毛的光镜和扫描电镜结果。c 叶毛的光镜和扫描电镜结果。d WT和SlbHLH95 OE植物近轴叶毛密度。e近轴叶的非腺体V型毛和腺体VI型毛的密度。f-j毛状体相关基因在4周龄叶片WT和SlbHLH95 OE中的相对表达。
3 SlbHLH9过表达系具有多种营养和生殖表型
除了毛状体减少，SlbHLH95-OE还表现出发育迟缓，节间缩短，植株矮化（图4a）。由于节间较短，SlbHLH95 OE成株的平均高度小于WT株的一半（图4b和c）。叶片扭曲和起皱，表皮细胞变小，叶片变小（图4d-f）。与WT相比，SlbHLH95-OE植株有更多腋芽（图4g）。WT产生1-2个腋芽，SlbHLH95-OE系在8周龄时每个植株有3-5个腋芽（图4h）。
SlbHLH95-OE生殖阶段也发生了较大变化，种子萌发至开花的时间推迟了约20d（图5a和b）。虽能正常产生花蕾，但大多数花蕾未达到花期。SlbHLH95 OE系的座果率显著降低，导致单株座果率显著降低（图5c），SlbHLH95-OE结果率为15-20%，而WT植株结果率为95%（图5d）。与WT相比，SlbHLH95OE系在果实发育和成熟方面没有显著差异，但果实更细长，果形指数增加，果形三角状减少（图5e-g）。平均果重也降低，在SlbHLH95-OE中小果比例较高（图5h）。SlbHLH95 OE系每个果实种子数显著减少（图5i）。
图4 SlbHLH95过表达株系的营养生长表型。a SlbHLH95 OE植株矮秆表型研究。b 80天的SlbHLH95 OE植株发育迟缓。c SlbHLH95 OE植株节间较短。d SlbHLH95 OE植株的叶片形态。e WT和SlbHLH95 OE叶片表皮细胞的光镜观察。f WT和SlbHLH95 OE叶片表皮细胞大小的研究。
图5 SlbHLH95-OE生殖发育发生显著变化。a-b SlbHLH95-OE推迟开花和花药萌发。c-d 座果情况。e 果型。f 果实形状指数，即三个有代表性的独立株系的长宽。g果形三角形，即为三条有代表性的独立直线的近端宽度与远端宽度之比。h 果实重量分布。i 每个果实的种子数。
4 SlbHLH95 OE系全基因组转录组分析
对SlbHLH95 OE系4周龄叶片进行了基因表达谱分析。WT和OE系分别表达20854、20699个基因。WT特异表达484个，OE特异表达329个（图6a）。WT与OE共鉴定1368个DEGs，其中SlbHLH95-OE中812个上调，556个下调（图6b）。GO分析，发现DEG分为生物过程 、分子功能和细胞成分三大类（图6c）。KEGG注释，注释到次生代谢产物的合成途径、植物激素信号转导途径和苯丙烷类合成途径（图6d）。SlbHLH95-OE系中调节番茄毛状体形成的大多数基因下调。在SlbHLH95-OE下调的前20个DEG中，发现了SlKS5和SlGA20ox2两个GA生物合成基因显著下调，表明GA含量可能减少（表1）。
图6转录组数据分析。a WT和SlbHLH95-OE系表达基因数量韦恩图。b DEG的火山图。c SlbHLH95 OE与WT之间DEG的GO富集分析。d DEG的KEGG途径富集分析。
表1 SlbHLH95 OE系中的Top20下调基因。
5 SlbHLH95-OE赤霉素含量下降
RT-qPCR分析，与WT相比SlbHLH95-OE的SlKS5和SlGA20ox2基因表达量降低（图7a和b）。GA含量的测定表明，SlbHLH95 OE植株中GA3没有变化，但GA4及其前体GA9显著降低（图7c）。这些结果表明，赤霉素含量的降低可能是抑制毛状体形成的原因，也是SlbHLH95-OE系营养生长和生殖发育发生变化的原因。对两周龄的SlbHLH95-OE进行外源GA4处理，转基因株系植株表皮毛的密度、密度大小和果形等性状得到完全恢复（图7d和e），节间长度与野生型相近（图7f）。外源GA4处理的SlbHLH95 OE系毛密度增加（图7g）。与未经处理的SlbHLH95 OE相比，经GA处理的植株果实形状变得更圆（图7h），果实形状指数和果实形状三角形均显著降低（图7i和j）。这些结果表明，SlbHLH95 OE株系的毛密度降低、植株矮小、果实细长可能是由于GA水平降低所致。
图7外源GA处理挽救了SlbHLH95-OE矮化表型。a-b GA合成相关基因的相对表达情况。c SlbHLH95 OE中GA含量降低。d 外源GA恢复了植株的大小。e 施加外源GA后SlbHLH95 OE植株与WT植株的比较。f 外源GA处理的SlbHLH95 OE植株节间长度与野生植株比较。g 外源GA对SlbHLH95 OE毛密度的影响。h 外源GA对SlbHLH95 OE系果实形态的恢复作用。i GA4处理和未处理的果实形状指数。j GA4处理和未处理的果实形状三角形。
6 SlbHLH95通过与启动子结合直接调节SlGA20ox2和SlKS5
对SlKS5和SlGA20ox2启动子进行分析，发现他们有保守的E-box（bHLH型TFs的靶标）和类似E-box的顺式元件，这些元件可以与bHLH转录因子结合。转录激活验证实验表明，SlbHLH95的表达导致SlKS5和SlGA20ox2启动子的活性降低，表明SlbHLH95对两个GA生物合成基因的转录产生负调控（图8a和b）。与对照组相比，SlbHLH95显著抑制了酵母生长，而当与突变的E-box序列竞争时，SlbHLH95没有显著影响酵母生长（图8c和d），表明SlbHLH95通过与E-box顺式元件结合抑制SlKS5和SlGA20ox2启动子的活性。SlbHLH95通过与SlKS5和SlGA20ox2启动子内的E-box基序直接结合，充当GA生物合成的负调控因子。其可能是导致毛状体减少以及其他营养和生殖表型变化的原因。
图8SlbHLH95通过直接与顺式调节元件结合抑制SlGA20ox2和SlKS5的表达。a和b双荧光素酶报告分析。c和d 酵母单杂分析SlbHLH95抑制SlGA20ox2和SlKS5启动子的活性。
结论
本研究报道了一种新的bHLH-TF，SlbHLH95作为一种推测的毛状体形成调节因子，通过对导入系群体进行定位来鉴定毛状体相关基因。在番茄中的过表达SlbHLH95导致茎、叶和幼果的毛密度降低，同时还表现出GA缺陷型表型。本研究为bHLH-TF通过调节GA生物合成控制番茄毛状体的形成提供了新的线索。
评论
表皮毛在生物和非生物胁迫中起着重要作用，而作物表皮毛形成的调控机理仍知之甚少。本文对SlbHLH95、GA与表皮毛形成之间的联系进行了探究。发现发现SlbHLH95通过与SlGA20ox2和SlKS5的启动子直接结合以抑制GA表达，来抑制番茄表皮毛形成。对作物表皮毛形成的调控机理的深入研究提供基础。
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