编译: Yong-qin，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
番茄（Solanum lycopersicum）研究植物果实发育成熟的重要模式作物。叶绿素含量和光合活性影响果实的淀粉积累和营养成分，研究表明Golden2-Like转录因子SlGLK1/2、BEL1-like家族基因SlBEL11、生长素响应基因SlARF4/6/10调控叶绿素积累和叶绿体形成，同源异形盒基因TKN2/4激活SlGLK2表达。类胡萝卜素的生物合成则受多种转录因子调控：MADS-box转录因子RIN、TAGL1、TDR4，NAC转录因子SlNAC4、NOR，AP2/ERF转录因子SlERF6、SlAP2a，且与乙烯信号通路间接相关。类黄酮随果实成熟在表皮积累，MYB转录因子在类黄酮的生物合成发挥重要作用，并且MYB–bHLH–WDR具有互作调控作用。目前，研究表明MYB转录因子与叶绿素和类胡萝卜素积累相关。柑橘CrMYB68负调控类胡萝卜素积累，猕猴桃MYB7通过激活番茄红素β-环化酶表达从而调控类胡萝卜素积累。本研究发现番茄SlMYB72同时调控果实中叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮的代谢。原名：SlMYB72 regulates the metabolism of chlorophylls, carotenoids, and flavonoids in tomato fruit
译名：番茄SlMYB72基因调控叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮代谢
期刊：Plant Physiology
IF：6.305
发表时间：2020.05
通讯作者：邓伟
通讯作者单位：重庆大学生命科学学院
DOI号：10.1104/pp.20.00156
1、SlMYB72表达分析及亚细胞定位
SlMYB72基因ORF共726bp，含242个氨基酸，在N端包含R2R3结构域和高度保守的三联体色氨酸。番茄MYB基因家族的系统发育分析表明SlMYB72、SlMYB83、SlMYB81、SlMYB85、SlMYB68、SlMYB66聚集于番茄S7亚家族，与拟南芥S7亚家族相近。RT-qPCR表达分析表明SlMYB72在根、花、果实中高表达（图1A），SlMYB72-GUS载体染色表明SlMYB72在果实和花的雄蕊中染色较深（图1B），绿色荧光蛋白载体表明SlMYB72定位于细胞核中（图1C），酵母杂交系统表明SlMYB72具有转录激活活性（图1D）。图1 SlMYB72表达分析及亚细胞定位。A：RT-qPCR分析SlMYB72的相对表达量（Rt根，St茎，Lf叶，Fl花，Img未熟果实早期，Img2未熟果实晚期，Mg成熟绿果实，Of成熟红果实）；B：SlMYB72-GUS载体表明各个部位的表达活性；C：SlMYB72的亚细胞定位；D：pGBKY7-SlMYB72在酵母细胞GAL4报告系统中验证其转录活性。
2、SlMYB72对番茄果实叶绿素/叶绿体、类胡萝卜素/有色体、类黄酮、酚酸积累的影响
SlMYB72的RNAi沉默株系和过表达株系用于研究该基因的作用，RT-qPCR表明6株RNAi株系的SlMYB72表达量均下调（图2A），SlMYB72的过表达株系的表型无明显变化，而RNAi株系中的绿色果实表现出大小不一的深绿色斑点，红果实呈现黄色斑点（图2B）。
番茄果皮由外/中/内果皮组成，RNAi株系中叶绿素a和b的含量明显上升（图2C-D），透射电子显微镜观察出RNAi株系中果皮的深绿色区域的叶绿体大小和数量明显增加（图2E-G），这表明SlMYB72影响叶绿素积累和叶绿体形成。此外，叶绿体与植物光合作用相关，RNAi株中的光化学势、光系统II的有效光化学量子产额有所提高。RNAi-SlMYB72果实的外/中/内果皮番茄红素含量明显下降（图3A），类胡萝卜素含量上升（图3B），单细胞的有色体大小和数量增加（图3C-E），表明SlMYB72对类胡萝卜素和有色体的影响。在RNAi株系中进行叶绿体和有色体的自体荧光成像，表明叶绿体主要存在于外果皮和中果皮，而有色体主要存在于红色的成熟果实（图4），进一步证明了SlMYB72对叶绿体和有色体生物合成的影响。RNAi株系的成熟果实中总黄酮、芦丁、槲皮素、总酚酸、没食子酸、绿原酸的含量均显著上升（图5A-F）。利用二苯氨基苯基硼酸染色观察类黄酮，结果显示RNAi株系的橙色和绿色荧光较深，因此山奈酚和槲皮苷的含量较高（图5G）。图2 RNAi-SlMYB72株系的的叶绿素积累和叶绿体合成。A：RT-qPCR验证RNAi株系的表达；B：RNAi株系的果实表型；C-D：外/中/内果皮的叶绿素a/b含量；E-G：叶绿体大小与数量。
图3 RNAi-SlMYB72株系的类胡萝卜素积累和有色体合成。A-B：外/中/内果皮的番茄红素和类胡萝卜素含量；C-E：有色体大小和数量。
图4 RNAi-SlMYB72株系的叶绿体和有色体的自体荧光成像。
图5 RNAi-SlMYB72株系的类黄酮含量。A-F：黄酮、芦丁、槲皮素、总酚酸、没食子酸、绿原酸含量；G：类黄酮的自体荧光成像。
3、SlMYB72的基因调控作用
对RNAi株系进行RNA-seq以确定潜在的基因靶标，基因表达分析共筛选5260个差异表达基因，包括784个下调基因和4476个上调基因，KEGG分析富集于光合作用、光合作用天线系统、碳固定、淀粉和蔗糖代谢、类胡萝卜素/类黄酮生物合成、脂肪酸代谢、苯丙素生物合成，MapMan分析富集于光反应、光呼吸、细胞壁/脂类、萜烯、类黄酮的生物合成。研究表明SlARF4负调控叶绿素积累，与SlMYB72作用相似。酵母双杂交、pull-down分析结果表明SlMYB72与SlARF4存在互作（图6A-C），体内双分子荧光互补分析表明SlMYB72余SlARF4互作于细胞核内（图6B）。选择6个参与叶绿素积累的差异表达基因的启动子分析，表明POR、CHLH、TKN2基因包含R2R3-MYB的结合序列，这3个基因均在RNAi株系中上调表达（图6D），电泳迁移率变动分析表明带标记的POR、CHLH、TKN2基因探针与GST-SlMYB72蛋白结合时流动性发生变化（图6E-G），染色质免疫共沉淀（FLAG抗体）表明POR、CHLH、TKN2的启动子高度富集（图6H），因此POR、CHLH、TKN2是SlMYB72的靶标基因。有10个差异表达基因与类胡萝卜素代谢相关，序列分析表明PSY（八氢番茄红素合成酶）、ZISO（ζ-胡萝卜素异构酶）、LCYB基因的启动子包含MYB结合序列。RT-qPCR表明RNAi株系中PSY和ZISO基因下调而LCYB基因上调（图7A）。电泳迁移率变动分析表明GST-SlMYB72蛋白靶标于PSY、ZISO、LCYB基因启动子，导致迁移发生变化（图7B-D），染色质免疫共沉淀验证了体内SlMYB72与PSY、ZISO、LCYB启动子的结合（图7E），因此SlMYB72直接调控PSY、ZISO、LCYB基因表达。RNAi株系中存在与类黄酮生物合成相关的差异表达基因，其中4CL（4-香豆酸辅酶A连接酶）、CHS1/2（查尔酮合酶）启动子包含MYB结合序列。4CL、CHS1/2基因在RNAi株系中表达上调（图7F），电泳迁移率变动分析表明GST-SlMYB72蛋白靶标于4CL、CHS1/2基因启动子，导致迁移发生变化（图7G-I），染色质免疫共沉淀进一步验证SlMYB72与4CL、CHS1/2的体内互作（图7J）。本研究利用RT-qPCR分析RNAi株系果实的不同颜色区域的SlMYB72表达水平，结果表明深绿色区域的SlMYB72表达水平低于浅绿色区域，POR、CHLH、TKN2的表达模式与SlMYB72相反（图8A）。红色果实中，黄色区域的SlMYB72表达水平低于红色区域，PSY、ZISO、LCYB表达模式相反（图8B）。这表明SlMYB72-RNAi株系的基因沉默不均匀，导致果实果皮的不均匀着色表型。图6 SlMYB72与SlARF4的互作，以及与参与叶绿素积累的差异表达基因的互作。A-C：酵母双杂交、双分子荧光互补分析、pull-down分析SlMYB72与SlARF4的互作；D：POR、CHLH、TKN2的相对表达量；E-G：电泳迁移率变动分析POR、CHLH、TKN2与GST-SlMYB72互作；H：染色质免疫共沉淀。
图7 SlMYB72与类胡萝卜素代谢相关的差异表达基因的互作。A：RT-qPCR相对定量；B-D&G-I：电泳迁移率变动分析；E&J：染色质免疫共沉淀。
图8 A-B：RT-qPCR分析果实不同颜色区域的的基因表达（g浅绿色区域，dg深绿色区域，r红色区域，y黄色区域）；C：SlMYB调控网络。
番茄果实的成熟过程包括叶绿体转化为有色体、叶绿素降解、类胡萝卜素积累。本研究证明了MYB转录因子SlMYB72同时调控果实的叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮代谢。其中POR基因是叶绿素生物合成的关键酶，催化叶绿素a转化为叶绿素b。CHLH基因编码Mg鳌合酶的H亚基，影响原卟啉IX转化为Mg-原卟啉IX。PSY基因催化八氢番茄红素的合成，PSY1基因的缺失导致番茄果实的黄色表型。ZISO基因参与番茄红素的生物合成。LCYB基因催化番茄红素向β-胡萝卜素转化，LCYB过表达促进植物体内β-胡萝卜素含量。4CL编码4-香豆酸辅酶A连接酶，催化苯基丙氨酸转化为4-香豆酸辅酶A（类黄酮前体）。CHS基因促进3个丙二酰辅酶A和1个p-酰基形成柚皮素查尔酮，是类黄铜生物合成的首要步骤。
番茄果实含大量叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮，它们的代谢途径相互影响。本研究表明SlMYB72的调控作用，但过表达SlMYB72不影响叶绿素。类胡萝卜素、类黄酮积累，可能的原因为SlMYB72受非编码RNA调控，或者SlMYB72需要与SlARF4互作而发挥作用。总体而言，SlMYB72通过直接与SlARF4互作调节叶绿素积累，并直接调控POR、CHLH、TKN2基因表达，SlMYB72调控类胡萝卜素和类黄酮生物合成，直接靶向PSY、ZISO、LCYB、4CL、CHS1/2基因（图8C）。本研究揭示了MYB转录因子的重要作用，促进果实营养改良的遗传工程。番茄SlMYB72属于MYB基因家族，定位于细胞核内，有转录激活的活性。SlMYB72的基因沉默导致果实的不均匀着色，并且促进叶绿素和类黄酮的积累，抑制番茄红素产生。转录组及互作分析表明SlMYB72直接调控POR（原叶绿素酸脂还原酶）、CHLH（Mg鳌合酶H亚基）、TKN2、PSY（八氢番茄红素合成酶）、ZISO（ζ-胡萝卜素异构酶）、LCYB（番茄红素β-环化酶）、4CL（4-香豆酸辅酶A连接酶）、CHS（查尔酮合酶）的表达。因此，SlMYB72是番茄果实叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮代谢的重要调控因子。
本研究在转录组数据上集中研究叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮代谢途径的差异基因，并通过启动子序列筛选靶标基因进行互作验证。因此SlMYB72或其同源基因在其他富集途径的作用有待探究。
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