编译：Young，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
豆科植物已经与根瘤菌形成了共生关系，它们的根形成了称为结节的独特固氮器官。研究表明，非生物和生物胁迫改变了植物中基因表达和转录本迁移的特性。然而，关于豆科植物-根瘤菌共生形成过程中，根瘤菌在全基因组范围内响应根瘤菌感染的系统性转运，在根与芽之间的系统性转运知之甚少。在本文的研究中，发现两个大豆（Glycine max）品种Peking和Williams具有较高的单核苷酸多态性。这使能够表征这两个品种异种移植物中转录本的起源和迁移。本文鉴定了4,552个在大豆中产生移动RNA的基因，并发现根瘤菌感染在结瘤的早期触发了茎与根之间的mRNA大量运输。这些mRNA中的大多数丰度相对较低，它们的转运以选择性方式发生在大豆植物中。值得注意的是，在结瘤的早期阶段，从嫩芽移动到根部的mRNA在许多与根瘤发育有关的响应过程中都富集了。而且，由根瘤菌感染诱导的许多已知的与共生相关的基因的转录本可以在芽和根之间移动。研究发现为豆科植物-根瘤菌共生过程中的内源性RNA转运提供了更深入的了解。原名：Rhizobial infection triggers systemic transport of endogenous RNAs between shoots and roots in soybean
译名：根瘤菌感染触发了大豆芽和根之间内源性RNA的系统转运
期刊：SCIENCE CHINA Life Sciences
IF：4.611
发表时间：2020.6
通讯作者：孔照胜
通讯作者单位：中国科学院微生物研究所
DOI号：10.1007/s11427-019-1608-7
将两个大豆品种进行相互嫁接并等到伤口完全愈合后，对嫁接体进行了根瘤菌的侵染。分别收取了根瘤菌侵染3天和7天的嫁接体大豆的根部和叶部，并收取未侵染的根部和叶部作为对照，然后分别提取各个样品的总RNA，经过高通量测序，利用RNA-Seq数据和基于基因组重测序数据鉴定的SNP信息，对嫁接大豆中的异源转录本进行鉴定，寻找根瘤菌侵染过程中可进行长距离移动的RNA分子。为了探索豆科植物-根瘤菌共生过程中芽与根之间的系统性RNA交换，我们设计了使用两个远缘相关的大豆品种Peking和Williams的嫁接实验（图1A–C）。两个品种之间RNA分子中单核苷酸变异（SNV）的差异能够表征异源移植植物中它们的起源和迁移。首先，对这两个品种进行了全基因组重测序。使用Williams 82的测序基因组作为参考，在两个品种中检测到大量SNV，而两个品种仅共享一小部分SNV。Peking拥有2,316,620个SNP（2,181,588个独特SNP），Williams具有152,454个SNP（42,962个独特SNP）（图1D）。不同基因组的SNP位于大豆中的25,738个基因中，占大豆总基因的近一半。这两个品种之间的相互嫁接是在下胚轴7天后进行的发芽。关节伤口愈合后，用重氮根瘤菌缓释剂USDA110接种移植物的根部（图1）。从接种的嫁接植物（接种后3、7天）和未接种的对照中收获根和芽材料。为了消除个体差异，每个样品都是在相同环境和条件下生长的八种嫁接植物的混合物。然后将样品进行下一代测序（NGS）。每个单独的RNA-Seq文库产生约80至1.43亿个读数。获得的RNA-seq数据和基于基因组重测序数据鉴定的SNV用于鉴定通过移植组织转运的异源转录本。图1 两个大豆品种之间的异种嫁接系统显示出高的SNP频率。A，对等移植物的实验策略和示意图的概述。B，在Peking和Williams之间使用的嫁接组合以及用重氮芽孢杆菌USDA110接种。比例尺= 2厘米。C，Peking（CHN，红点）和Williams（美国，黑点）品种的原始采集地点。D，Peking和Williams之间不同基因组SNP的信息。
当在受体组织的RNA-Seq库中检测到其从源组织读取的相应RNA-Seq读段时，转录本被定义为可移动。产生可以在砧木和接穗之间运输的转录本的基因被认为具有嫁接可传递的转录本。在两个生物学重复中必须至少检测两次移动转录本。根据SNP信息，在根瘤菌接种后的不同阶段，从这两套嫁接材料中共鉴定出4,552个产生嫁接可传播转录本的基因（图2）。图2 根瘤菌感染触发了大豆芽和根之间多种mRNA的运输。倒置移植物的维恩图和示意图表示了在横纹肌接种的不同时期，Peking和Williams之间详细的活动mRNA数量。A，在未接种的对照组中仅鉴定到相对少量的移动mRNA（n = 108）。B，用重氮芽孢杆菌USDA110接种移植物以3 dpi诱导大量mRNA（n = 4,524）向远端组织的转运。C，在7 dpi时，仅发现67个可移动的mRNA。为了探索移植物可传递的mRNA的功能，首先评估了其在结瘤早期（3 dpi）下根瘤菌诱导的丰度与迁移率之间的关联。根据它们在3 dpi时在源组织和受体组织中的表达方式，将这些转录物分为四类。第一类转录本在源组织和受体组织中都相对较高的表达（RPKM（每千个碱基对的读图> 100）。其余的移动成绩单又分为三类 (group II, III and IV)。组II转录本在来源和受体组织中的表达水平相似（来源RPKM /受体RPKM> 0.5和<2）；与源组织相比，III组转录物在受体组织中的表达水平更高（源RPKM /受体RPKM≤0.5）；和IV组转录本在源组织中的表达水平高于受体组织（源RPKM /受体RPKM≥2）。有趣的是，在各种异种移植组合中，绝大多数已鉴定的移植物可传递转录本属于II组，并且这些可移动转录本在3 dpi时在源和受体组织中表现出相似的表达模式（图S1）。这些结果表明，根瘤菌诱导的选择性转运在很大程度上不是由于源组织和受体组织之间的基因表达差异引起的，并且在组织之间转运的基因转录本可能与共生和根瘤的发育有关。图S1 根瘤菌诱导的可移动RNA的表达水平与移动性的关系为了进一步研究这些移植物可传递的mRNA的功能，在这些植物的根瘤菌感染后的不同时间进行了基因本体论（GO）富集分析（图S2-S5）。在未接种的对照中，发现从Peking到Williams根的流动mRNA富含与翻译调控，对营养水平的响应，对细胞酰胺代谢过程的调控以及蛋白质活性调控相关的过程，从Williams芽到Peking的移动mRNA参与了染色质沉默，基因表达的负调控和大分子生物合成过程，代表了一般的细胞活动（图S2）。另外，从Peking到Williams芽的流动mRNA在与氧化还原过程，三羧酸循环，柠檬酸代谢过程和囊泡对接有关的过程中富集，从Williams根到Peking芽的流动mRNA参与了小麦的调控。转录，RNA生物合成过程，细胞大分子生物合成过程和基因表达。图S2 未接种根瘤菌对照组可移动RNA的GO生物学功能分析
毫不奇怪，在3 dpi时，响应于根瘤菌而产生从Peking芽到Williams根部的移动转录本的基因富含结瘤相关的响应过程，包括对镉离子的响应，细胞分裂，囊泡介导的转运，微管组织，肌动蛋白聚合或解聚的调控，细胞周期，自噬和一些植物激素介导的信号传导途径（如生长素，细胞分裂素，乙烯，茉莉酸和脱落酸）的正调控（图S3和S4）。从Williams芽到Peking根的移动转录本与结节相关的响应过程有关，包括对几丁质的响应，细胞周期过程，细胞分裂，木质素代谢过程以及一些植物激素介导的信号传导途径，如油菜素类固醇，脱落酸，水杨酸，乙烯，茉莉酸和赤霉素。相比之下，响应根瘤菌从Peking根运输到Williams枝的转录本富含氮化合物的代谢过程，对氮化合物的响应，酰胺生物合成过程，尿素运输，囊泡介导的运输，对生长素刺激的细胞反应以及对乙烯和茉莉酸介导的信号通路的应答（图S3和S4）。另外，在与基因表达，芽或根系统发育以及信号转导的调节有关的过程中观察到富集。从Williams根到Peking芽的移动转录本参与RNA生物合成过程的调节，染色质沉默，基因表达的负调节和氮化合物代谢过程的调节。此外，具有编码转录因子（TF）活性的移动转录本的基因在茎到根方向上大量富集，而在根到芽方向上却不富集（图S3和S4）。例如，MADS-box蛋白，乙烯响应转录因子（ERF），钙调蛋白结合转录激活因子，含NAC域的蛋白质，和WRKY，MYB和bZIP转录因子据报道与共生有关。有趣的是，在这些可移动的mRNA中，RNA结合蛋白编码基因的转录本在两个方向上都大量富集（图S3和S4），并且可能参与其货物RNA的运输。图 S3 根瘤菌侵染3天时地上部分在转录水平上系统地调控根瘤的形图 S4 根瘤菌侵染 3 天时根部向上转移的 RNA 的功能分析在7 dpi时，从Peking梢到Williams根的移动转录本富含光合作用，电子传输链，对营养水平和细胞外刺激的响应（图S5），并且涉及从Williams芽到Peking根的移动转录本。在染色质沉默，基因表达的负调控和细胞大分子的生物合成过程中。相反，响应饥饿，营养水平和细胞外刺激，从Peking根到Williams枝的转录物富集，从Williams根到Peking芽的移动转录物参与染色质沉默，基因表达的负调控和细胞过程的调控。7 dpi时可移动mRNA的功能与未接种状态下的功能相似。因此，在7 dpi时，结节相关mRNA的活性和转运显着降低。4 大豆植株地上部分在转录水平上系统地调节根瘤形成根瘤菌感染引起短暂的防御反应和持续的Nod因子信号转导。同时，根瘤菌可特异性激活激素的生物合成以及细胞周期的信号传导和激活。根瘤菌感染诱导了细胞周期相关基因的表达增加。研究发现，与细胞周期相关的基因转录本的运动方向主要是从芽到根，而这种长距离运输只发生在3 dpi的时间点上。几个编码细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1（CKS1），cyclinT1-4（CCNT），cyclin-H1-1（CCNH），cyclin-D3-1（CYCD3），染色单体凝聚因子（MAU2）和E3泛素-基因的基因蛋白连接酶（UPL3）直接参与细胞周期的调控。这些活动的细胞周期相关转录本的功能与根瘤起始过程中的细胞分裂事件相关。3到7 dpi的周期对于结节的分化和发育至关重要，这些细胞周期相关的mRNA从新芽到根的迁移可能促进结节的形成。最近的研究表明，自噬过程可以调节豆科植物-根瘤菌的共生，感染和结节发育，而自噬相关的激酶PI3K对于共生至关重要。普通豆（菜豆）和根瘤菌之间的关系。在这里，鉴定了15种与自噬相关的可移动自噬相关的mRNA，这些mRNA特别从嫩芽向下移动到根部，包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶TOR，VPS15，BECN1调节的自噬蛋白1和几种自噬相关蛋白。细胞骨架组织在结节器官的发生和功能中起重要作用。我们发现涉及皮层微管组织的基因的转录物丰富，包括有丝分裂核分裂，表皮细胞分化，细胞壁组织，纤维素生物合成过程和细胞形状调节，这些生物学过程与在根瘤的分化，伸长和成熟过程中发生的一系列变化。此外，肌动蛋白的细胞骨架在调节细胞内运输和运输中起着核心作用，而囊泡介导的运输对于信号和物质交换，感染线的形成以及根瘤的形成是必要的。在这里，发现大量与小泡介导的运输相关的基因转录物（VAMP7，COPB1，SEC24，SEC26，AP2A，VPS29，Rab1，EXOC4等），微管组织（CESA，CSNK1，NEK5等），肌动蛋白的聚合或解聚（SCAR1 / 2，ARP2 / 3等）主要从枝条运输到根部，表明来源组织（枝条）对植物在转录水平上在根中形成豆科植物-根瘤菌共生。5 根瘤菌感染改变了涉及激素生物合成和信号传导的转录本的运输几乎所有的植物激素都能调节根瘤共生。最近的遗传和生理学证据表明，根瘤菌引起的植物激素变化在宿主中起着至关重要的作用，这是成功形成根瘤的前提。例如，细胞分裂素和生长素在结节细胞增殖和分化的控制中起基本作用。赤霉素，油菜素甾醇和茉莉酸在最佳浓度下对感染线的形成和根瘤的形成具有积极影响，而乙烯和水杨酸对根瘤的形成则具有主要的负面影响。脱落酸可以减少卷曲的根毛和含有感染丝的根毛的比例，并抑制钙的尖峰作用。有关功能的最新研究结节上的植物激素仅限于检查激素水平。研究发现，根瘤菌感染触发了转录物的系统运动，该转录物参与了植物生长素，细胞分裂素，赤霉素，乙烯，茉莉酸，水杨酸，脱落酸和油菜素的生物合成和信号转导。有趣的是，几乎所有与植物激素相关的转录本都从嫩芽转运到根部，并且发现只有三种与植物激素相关的转录本（植物生长素，乙烯和茉莉酸）从根部转运到嫩芽。探索了已知的共生相关基因转录本的运动。NF-YA1（核转录因子Y），LYK（LysM结构域受体样激酶），PUB1（含U盒结构域蛋白），RIP1（根瘤菌诱导的过氧化物酶1），ENOD2（早期结节蛋白2）的转录本。并且发现SUCS1（蔗糖合酶同工型X1）在根茎感染的响应下在茎和根之间运输（表1）。根瘤性结节因子（NFs）通过细胞外溶素基序（LysM）结构域与受体相互作用，并诱导豆类的结瘤信号传导。在百脉根中，CCAA Tbox核因子-Y（NF-Y）亚基基因LjNF-YA1和LjNF-YB1在根瘤原基中表达，并作为结节内含物（NIN）和根瘤器官发生的转录靶标如NIN功能丧失所见，LjNF-YA1的敲低抑制了Smad1的表达。NF-YA1通过调节截短支原体中感染丝的形成来控制根瘤菌感染的进程。在蒺藜苜蓿中，LYK3共生受体激酶与E3泛素连接酶PUB1相互作用并将其磷酸化，从而在共生过程中负面调节根瘤菌感染和结瘤。在这里，我们发现大豆中的LysM结构域受体样激酶3和另一LysM结构域蛋白，NF-YA1和PUB1的转录物以3 dpi的速度从芽特别地运输到根部（表1）。早期结节蛋白基因ENOD2是结节实质分化的标志，是在根瘤形成的早期由脂-几丁质结节信号诱导的。NFs诱导了另一个编码过氧化物酶的早期结节蛋白基因RIP1，RIP1的表达与早期共生过程紧密相关。RIP1也与Nod因子诱导有关活性氧的产生。出乎意料的是，响应于根瘤菌感染，ENOD2和RIP1的mRNA运动从根部向上诱导到芽。蔗糖合酶基因SUCS1在结节中表达，是固氮所必需的。研究发现，SUCS1大豆同源物的转录本在芽和根之间以3 dpi双向运输，在源组织和受体组织中均具有相对较高的表达水平（RPKM> 100）。除了上述已知的根瘤相关基因外，还发现其他几种共生相关基因的转录本在茎和根之间转运（表1），例如细胞分裂素受体CRE1，膜联蛋白样蛋白ANN1和阳离子通道蛋白POLLUX，参与豆科植物与根瘤菌的共生相互作用。我们还发现，参与固氮的几种基因（ISCU1，GS，DGD2）的转录本在枝条和根之间运输。表1 可进行长距离转移的参与豆科植物和根瘤菌共生过程的 RNA为了确认这些转录本的迁移性，我们在大豆中使用了毛状根转化方法，用pro35S：ANN1-GFP / pro35S：ENOD2GFP / pro35S：SUCS1-GFP和空载体（pro35S：GFP）转化了根（图3A）。然后对来自转基因根和芽的RNA样品进行RT-PCR分析。GFP（绿色荧光蛋白）是一种非植物mRNA，将移动的转录本与GFP的根部融合在一起，以检测芽中GFP的转录本。当三天后将转基因植物接种重氮芽孢杆菌USDA110时，我们在芽中检测到融合到ANN1，ENOD2和SUCS1的GFP mRNA，而未接种的对照或7 dpi时未检测到GFP mRNA（图3B）。因此，移动的转录物序列可以触发GFP RNA从根到芽的转运。这些结果与RNA-Seq数据一致，也提供了重要的证据来证明mRNA的运动与根瘤菌感染有关。图3：在转基因大豆中融合了可移动转录本的GFP的RT-PCR分析。A，使用毛根转化法的转基因大豆的图像。Bar= 2厘米。B，在3 dpi时，在芽中检测到与ANN1，ENOD2和SUCS1融合的GFP mRNA（n = 12）。在未接种的对照中或在7 dpi时，在芽中未检测到GFP mRNA（n = 12）。将这些实验重复三遍。ACTIN用作内部对照。在根瘤菌与大豆共生的早期，根瘤菌的侵染可以诱导大量的 RNA 在大豆根部和地上部之间进行长距离双向转移，并且这种由根瘤菌诱导的转移具有一定的选择特异性在结瘤早期，从地上部分转移到根部的 RNA 参与了许多与结瘤相关的反应过程；此外，许多已知的共生相关基因受到根瘤菌的侵染后可以在地上部分和根部之间进行长距离的转移。
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