编译：洛雪，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：miR155 regulation of behavior, neuropathology, and cortical transcriptomics in Alzheimer's disease
译名：miR155对阿尔兹海默病行为学、神经病理学及皮质转录组学的调控
期刊：Acta Neuropathologica
IF：14.251
发表时间：2020.9
通讯作者：Joel T Dudley &Michelle E Ehrlich
通讯作者单位：美国纽约西奈山伊坎医学院
DOI号：10.1007/s00401-020-02185-z
实验设计
结果
1 miR155敲除的8月龄APP/PSEN1小鼠脑中Aβ沉积增多
图1 在8月龄APP / PSEN1小鼠中， miR155敲除会增加脑Aβ沉积，但不会改变小胶质细胞或星形胶质细胞的激活。a,d 8月龄的APP/PSEN1和APP/PSEN1; miR155-/-小鼠大脑中的6E10免疫反应的斑块（红色）和Iba1免疫染色的小胶质细胞（绿色）的图像。b-c,e-g 6E10 和Iba1染色统计学结果。h-k前额叶皮层（左）和海马（右）中硫黄素S标记的淀粉样蛋白斑（红色）和GFAP阳性的星形胶质细胞（绿色）染色结果及统计分析图。
表1 8月龄APP/PSEN1和APP/PSEN1；miR155−/−小鼠脑组织中Aβ水平
2 miR155敲除对8月龄APP/PSEN1小鼠脑小胶质细胞和星形胶质细胞的激活无影响
研究人员观察到APP/PSEN1；miR155−/−小鼠脑内Aβ沉积增加，且有研究报道胶质细胞和神经炎症在Aβ沉积中发挥关键作用。研究人员进一步研究了miR155敲除对8月龄APP/PSEN1小鼠脑小胶质细胞和星形胶质细胞的影响(图1d-g，j-k)。免疫荧光染色表明，在APP/PSEN1和APP/PSEN1；miR155−/−小鼠中 Iba1+的小胶质细胞的数量及荧光强度无明显差异（图1d-g）. 在两种小鼠的皮层和海马区域， GFAP+星形胶质细胞数量及荧光强度也无明显差异（图1j-k）
3 miR155敲除可使10月龄APP/PSEN1小鼠突触可塑性有所恢复，使WT小鼠出现突触功能障碍
为了进一步研究miR155敲除对10月龄APP/PSEN1和WT小鼠突触可塑性的影响，研究人员选择了急性海马脑片作为研究对象(图2a)。与WT小鼠相比，APP/PSEN1小鼠海马CA3-CA1基础突触传递损伤 (图2b)。与WT小鼠相比，miR155敲除的WT小鼠海马CA3-CA1基础突触传递损伤，且损伤程度与APP/PSEN1小鼠类似。但有趣的是，与APP/PSEN1小鼠相比，APP/PSEN1；miR155−/−小鼠海马CA3--CA1基础突触传递损伤程度减轻，且恢复至与WT小鼠类似水平，APP/PSEN1小鼠miR155的缺失恢复了WT小鼠正常的基础突触传递，即纠正了APP/PSEN1缺陷。
配对脉冲促进(PPF)，指的是当一个突触被一短暂间隔的双脉冲刺激后,第二个反应会明显强于第一个反应的现象，描述的是一种短时程突触可塑性。短时程的突触可塑性是突触可塑性的一种重要表现形式，研究人员也检测了这一突触可塑性指标，结果表明，10月龄的APP/PSEN1短时程突触可塑性受抑制，而miR155的缺失可以部分改善。WT小鼠与miR155敲除的WT小鼠对短时程的突触可塑性无明显影响(图2c)。
研究人员还研究了突触可塑性的两种长时形式，即长时程增强(LTP)和DHPG诱导的长时程抑制(LTD)。同上文中的基础突触传递损伤结果类似，与WT小鼠相比，APP/PSEN1小鼠LTP减弱，而miR155的缺失可使APP/PSEN1小鼠LTP减弱有所恢复，但miR155的缺失使WT小鼠LTP减弱至与APP/PSEN1小鼠类似水平。但与WT小鼠相比，APP/PSEN1小鼠LTD受损，而miR155的缺失不能使APP/PSEN1小鼠LTD受损有所恢复，miR155的缺失也会使WT小鼠LTD受损。
图2 miR155敲除使10月龄APP/PSEN1小鼠突触可塑性有所恢复，使WT小鼠出现突触功能障。a急性海马脑片记录突触电位的电极放置。b fEPSP 幅值mv/ms，反映突触功能。c配对脉冲促进(PPF)情况。d,e突触诱导长时程增强（LTP ）和长时程抑制(LTD)
4 miR155敲除可提高4月龄和8月龄APP/PSEN1小鼠Barnes迷宫空间学习记忆能力
Barnes巴恩斯迷宫用于评估大小鼠的空间学习和记忆能力。迷宫表面使用强光照明让动物产生厌恶，给动物找到正确的洞穿过迷宫表面的机会，下方是一个“安全盒”，研究者测量动物到“安全盒”需要的总的时间。潜伏期越短，说明动物的空间学习记忆能力越强。(图3a)
与WT小鼠相比4月龄和8月龄的APP/PSEN1小鼠均表现出学习和行为障碍。4月龄APP/PSEN1小鼠进入“安全盒”的潜伏期延长(图3b)，8月龄APP/PSEN1小鼠寻找“安全盒”的潜伏期延长(图3c)。与APP/PSEN1小鼠相比，两个年龄段的APP/PSEN1；miR155‑小鼠均表现出更好的学习和记忆能力。
图3 miR155敲除可提高4月龄和8月龄APP/PSEN1小鼠Barnes迷宫空间学习记忆能力。a Barnes巴恩斯迷宫模式图 b,c各组小鼠的潜伏期时间(s)。
5 miR155敲除对前额叶皮质转录组的影响
为了研究miR155敲除对小鼠大脑皮质基因表达的影响，研究人员选择了48只4月龄和8月龄6种不同基因型小鼠(WT，APP/PSEN1，miR155+/-，miR155-/-，APP/PSEN1；miR155+/-，APP/PSEN1；miR155-/-)的前额叶皮质(PFC)样本(n=4/组)进行RNA测序。
结果表明，各组之间的DEG的数量有很大的差异(图4a)，与WT小鼠相比， miR155敲除的WT小鼠大脑皮质DEGs中几个与真核启动因子、核糖体和线粒体途径相关的基因明显下调，以及几种神经退行性疾病的KEGG通路下调，包括AD、PD和亨廷顿病（图4b，c）。
图4 miR155敲除APP/PSEN1小鼠与APP/PSEN1小鼠转录组差异表达基因(DEG)相似性比较。a 48只小鼠的皮质DEG情况b miR155-/- vs. WT中鉴定到的前20个差异最大的基因，以及c具有代表性的基因集富集。d,e 4月龄的miR155−/−与WT，APP/PSEN1与WT之间DEG重叠情况。
6 miR155敲除APP/PSEN1小鼠与APP/PSEN1小鼠转录组差异表达基因(DEG)相似性比较
为了阐明可能的基因调控，研究人员比较了各组小鼠的DEG相似性 (图4a)。4月龄的miR155−/−与WT， APP/PSEN1与WT之间有296个DEG重叠，且在这296个基因中，miR155−/−与WT之间DEG的倍数变化，和APP/PSEN1与WT之间DEG的倍数变化存在明显的正相关(图4d)。在这些基因中，与核糖体、蛋白质翻译和翻译因子相关的基因强烈下调(图4e)。且在上调和下调基因中，CD34+造血干细胞前体基因集的尤其丰富，这暗示着APP/PSEN1和miR155−/−基因型都会导致某种形式的蛋白病变，如APP/PSEN1基因突变会导致Aβ淀粉样变性。
7 miR155缺失与APP代谢之间的相互作用
前文中提到，APP/PSEN1小鼠突触功能受损，而miR155的缺失可改善10月龄APP/PSEN1小鼠的突触功能，但miR155的缺失却使WT小鼠突触功能受损。在不同的小鼠中（一种小鼠有APP的表达，一种小鼠无）， miR155的缺失对突触功能的作用却不尽相同。这一有趣的生物学现象，吸引着研究人员继续探索miR155缺失与APP代谢之间的相互作用。
4月龄的APP/PSEN1小鼠和APP/PSEN1；miR155−/−小鼠中存在51个差异表达基因(图5a)，8月龄的APP/PSEN1小鼠和APP/PSEN1；miR155−/−小鼠中存在11个差异表达基因，在这些差异基因中，BTG3在4月龄和8月龄APP/PSEN1；miR155−/−小鼠中均下调。对4月龄小鼠的转录组51个差异基因进行基因富集分析，发现差异基因更多的参与在“神经系统生理学异常”、“神经突起生长的NCAm信号”以及“阿尔茨海默病”经典代谢通路等生物学过程(图5b)。
图5 miR155缺失与APP代谢之间的相互作用。a APP/PSEN1小鼠和APP/PSEN1；miR155−/−小鼠的DEG，和b相关联的基因集富集。c miR155在12月龄APP / PSEN1小鼠的DG和EC中的表达。d APP/PSEN1小鼠海马DG和EC区的miR155原位杂交。e 根据CERAD神经病理学评分得到的平均切片强度的箱线图
8 miR155在APP/PSEN1小鼠的海马齿状回和AD病人的海马CA1区上调
前文提到，miR155缺失可以改善APP/PSEN1小鼠海马突触功能，所以研究人员猜想，会不会miR155在APP/PSEN1小鼠海马齿状回中上调呢？紧接着，研究人员进行了一系列的探索实验。通过qPCR分析12月龄APP/PSEN1和WT小鼠的齿状回(DG)和内嗅皮层(EC)中miR155的表达，miR155在DG中上调，在EC无明显变化(图5c)。与EC相比，DG内小胶质细胞增生可能是miR155区域性差异表达的原因。miR155在APP/PSEN1小鼠海马中表达上调，提示miR155是影响APP/PSEN1小鼠海马齿状回突触功能的调控分子。
miR155在AD小鼠海马区域上调，那么在AD病人中又是如何呢？研究人员对AD病人和同龄正常人死后CA1海马组织进行原位杂交，发现AD病人的平均切片强度明显高于对照组(AD病人：n=7，对照：n=4，图5d，e),说明miR155在AD病人的海马CA1区中也上调。
9 miR155缺失使一类神经细胞亚群中的基因表达下调，但这类亚群在大多数神经系统疾病患者中不存在
为了进一步了解miR155的缺失对哪类细胞类型影响最大，研究人员将本研究中检测到的DEG与最近一篇文章报道的48名AD病人和正常人死后脑组织的单细胞转录组学测序结合起来，比较发现几个差异表达基因与一系列细胞亚群标记物紧密相关（图6a）。在4月龄的miR155−/−与WT的DEG中，表征兴奋性神经元亚群的标记基因(ex6和ex11)显著下调，而表征星形胶质细胞的标记基因(Ast3)上调。这暗示着miR155的缺失与一类神经元亚群的丢失有关，该亚群在健康受试者中存在，但在阿尔茨海默病人中不存在。
10 miR155缺失致AD样脑转录改变，上调了与阿尔茨海默病相关的数量性状位点
miR155缺失在小鼠中引起的转录变化如何与人类AD患者脑组织中的变化相对应？研究人员将将本研究中检测到的DEG数据同四个地区人类晚发性AD的六个大脑区域RNA序列整合在一起进行分析研究。这些数据共包括从六个大脑区域收集的928个样本，进行归一化处理后，使用基因富集分析方法检查了与对照组相比，AD组的DEG是否集体上调或下调(图6b)。
与WT 小鼠相比，4月龄miR155−/−小鼠DEG中出现了与AD相关的转录改变。与AD病人的进行对比，发现在上述DEG中下调的基因，在7个AD病人中有6个显著负富集，相反，在上述DEG中上调的基因，在7个AD病人中有5个显著正富集。总体而言，这表明在几个独立的数据集和脑组织环境中，miR155缺陷型的AD模型小鼠中与miR155缺失相关基因的表达变化，同AD病人的转录组学数据一致。
全基因组关联研究已经确定了与AD病理相关的大量风险位点，通过 GWAS从常见的突变中发现AD的风险位点是普遍的研究手段，GWAS发现的显著位点和转录调控的关系常采用数量性状位点表达（eQTL）来分析 (图6c-e)。在4个月龄的miR155−/−与WT和APP/PSEN1与WT的比较中，上调的基因与AD风险相关的eQTL的富集程度最高(图6f)。这表明miR155影响的基因表达总体上与AD风险相关，进一步支持了miR155的缺失与人类AD疾病的相关性。
结论
本文研究了miR155缺失对4、8和10个月龄的对照组(WT)和APP/PSEN1小鼠的学习记忆行为、神经病理学和皮质转录表型的影响，发现miR155敲除的8月龄APP/PSEN1小鼠脑中Aβ沉积增多、突触功能恢复，但miR155敲除可提高4月龄和8月龄APP/PSEN1小鼠Barnes迷宫空间学习记忆能力，进一步探索了miR155缺失对前额叶皮质转录组影响，与APP代谢之间的相互作用。转录组分析表明，miR155在APP/PSEN1小鼠的海马齿状回和AD病人的海马CA1区上调，作者还整合了来自四个地区的AD病人的六个大脑区域RNA序列，发现miR155缺失致AD样脑转录改变，上调了与阿尔茨海默病相关的数量性状位点，说明了miR155的失调与人类晚发性AD疾病至少在以下4个领域具有相关性：(1)天然免疫反应途径；(2) 基因调控网络；(3)突触病理；(4) β-淀粉样蛋白沉积。
评论
本文揭示了miR155对阿尔兹海默病小鼠及病人的多方面影响，从实验开始的对AD病理学特征的研究到后续的转录组分析，实验设计完整、合理、可靠。本文还利用了全基因组关联分析（GWAS）这一医学疾病研究的绝佳利器，巧妙地整合了上百个阿兹海默症人脑死亡标本的转录测序组进行了生物信息学分析，该单细胞转录组学技术为探寻miR155与阿尔兹海默病相关性的分子基础和细胞基础提供了一个蓝图。
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