编译：逍遥君，编辑：景行、江舜尧。
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MiRNA的核定位已被发现十多年，但其在细胞核中的确切机制和功能仍未完全阐明。本研究旨在使用RNA-seq探索核内miR-552-3p对NR1s的潜在作用和在改善肝脏糖脂代谢中的应用。研究发现miR-552-3p可以在体外抑制代谢基因表达，并在体内显示出对糖脂代谢的有益作用。核内miR-552-3p通过与AGGTCA互补序列结合调节LXRα和FXR的转录活性，恢复miR-552-3p对基因表达和糖脂代谢的影响。此外，与正常对照组相比，NAFLD患者肝脏样本中肝脏miR-552-3p水平显著降低。miR-552-3p调控LXRα和FXR的机制为miRNA介导的基因调控提供了新的模式。MiR-552-3p的体内有益作用和临床相关性表明，它可能是治疗糖脂代谢性疾病的潜在治疗靶点。
论文ID
原名：MiR-552-3p modulates transcriptional activities of FXR and LXR to ameliorate hepatic glycolipid metabolism disorder
译名：MiR-552-3p通过调节FXR和LXR的转录活性改善肝脏糖脂代谢紊乱
期刊：Journal of Hepatology
IF：20.582
发表时间：2020年8月
通讯作者：任进&陈静&赖陶荣
通讯作者单位：中国科学院上海药物研究所&上海交通大学
DOI号：10.1016/j.jhep.2020.07.048
实验设计
结果
使用RNA-seq检测转染miR-552-3p的HepG2中的基因表达谱。与NC组相比，miR-552-3p组775个基因表达下调，754个基因表达上调（图1B）。通过KEGG通路分析所有差异表达基因（图1C）。其中17.2%的下调差异基因均被富集到代谢途径，因而以下研究更多地关注下调的基因。
通过RT-PCR和western blot检测转染miR-552-3p或miR-552-3p抑制剂的HepG2中一些与糖脂代谢相关基因的mRNA来证实RNA-seq的结果。发现miR-552-3p可以降低SCD、MTTP、G6Pc、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG1的表达，而随着内源性miR-552-3p的降低，其表达上调（图1D-E），表明miR-552-3p具有抑制糖脂代谢相关基因表达的能力。通过构建miR-552-启动子荧光素酶报告质粒，研究在HEK293中加入各种不同链长或葡萄糖的FFA后miR-552-3p启动子的活性。发现长链脂肪酸，如肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸降低miR-552-3p启动子活性。综上所述，miR-552-3p抑制了糖脂代谢相关基因，而其表达被脂质应激抑制。
图1 MiR-552-3p可抑制HepG2代谢基因表达。（A）NR1和miR-552-3p顺式元件之间的序列比对。（B）RNA-seq的热图数据。（C）RNA-seq中差异表达基因的KEGG通路分析。（D-E）转染miR-552-3p（D）或anti-miR-552-3p（E）的HepG2中SCD、MTTP、G6Pc、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG1的mRNA水平。
2 MiR-552-3p改善小鼠因HFHFr饮食诱导的体重增加
为了进一步了解miR-552-3p在糖脂代谢中的生物学功能，通过尾静脉分别用AAV2/8-mcherry或AAV2/8-mcherry-miR-552-3p感染HFHFr（高脂和果糖饮食）和对照（正常饮食）小鼠（图2A）。注射后第14周，利用荧光显微镜检测AAV在小鼠肝脏中的感染效率。HFHFr小鼠和对照小鼠的AAV2/8-mcherry或AAV2/8-mcherry-miR-552-3p均具有较高的感染效率（>85%）。在HFHFr小鼠中，miR-552-3p组的体重增加较mcherry组慢（图2B），miR-552-3p组在HFHFr小鼠中的肝脏重量/体重比也低于mcherry组（图2C），而这些现象在对照组小鼠中没有。由于mcherry和miR-552-3p组的摄食量、附睾脂肪/体重比和肾周脂肪/体重比没有差异，因而无论是在HFHFr小鼠还是对照小鼠中，miR-552-3p对体重和肝脏的有益作用需要进一步的实验来明确调控机制。
图2 MiR-552-3p可缓解HFHFr小鼠肝脏脂肪变性和血脂异常。（A）动物实验示意图。（B）对照和HFHFr小鼠的体重。（C）对照和HFHFr小鼠的肝脏/体重比。（D）对照组和HFHFr小鼠的血清TC和LDL-C。（E）对照和HFHFr小鼠的OLTT试验。（F）对照组和HFHFr小鼠的肝脏TC和TG。（G）对照组和HFHFr小鼠的H&E和油红O染色肝脏切片。（H）油红O染色的定量分析。
3 MiR-552-3p缓解HFHFr小鼠肝脏脂肪变性和血脂异常
与HFHFr小鼠的mcherry组相比，HFHFr小鼠的miR-552-3p组血清TC和LDL-C显著降低，而两组之间的HDL-C和TG无显著差异。在对照组小鼠中，miR-552-3p对血脂四项均无影响（图2D）。同时，OLTT检测结果显示，miR-552-3p组可增强HFHFr和对照组小鼠的脂质代谢（图2E）。HFHFr小鼠miR-552-3p组肝脏TC和TG含量显著降低，而对照组小鼠无此现象（图2F）。根据H&E染色实验，miR-552-3p组在HFHFr小鼠中表现出较少的脂肪变性，在对照组小鼠中没有影响（图2G）。肝脏切片的油红O染色也显示在HFHFr小鼠中miR-552-3p过表达后TG的积累较低（图2G、2H）。此外，过表达miR-552-3p的小鼠原代肝细胞对FFA引起的脂质积累具有更强的抵抗力。上述结果表明miR-552-3p过表达改善了过量营养物质引起的脂质代谢失衡，但对正常生理条件没有影响。
4 MiR-552-3p改善HFHFr小鼠和db/db小鼠的糖代谢
体内检测miR-552-3p对糖代谢的影响，与mcherry组相比，过表达miR-552-3p有抑制HFHFr饮食诱导的血糖升高（禁食6h）的趋势（图3A）。此外，HOMA-IR评分、OGTT和ITT实验的结果证明miR-552-3p阻止了HFHFr小鼠胰岛素抵抗的发展（图3B-D）。为了证实miR-552-3p对胰岛素敏感性的影响，进行了体内胰岛素信号检测，结果发现HFHFr小鼠胰岛素信号受损，而miR-552-3p可以修复胰岛素信号通路（图3E）。
为了更好地探索miR-552-3p改善糖代谢的能力，在db/db小鼠中过表达miR-552-3p。db/db小鼠肝脏中AAV的感染效率>85%。随着时间的推移，mcherry组的空腹血糖逐渐增加，而miR-552-3p组增加较慢（图3F）。发现miR-552-3p可以缓解HOMA-IR、OGTT、体内胰岛素信号和ITT试验中的胰岛素抵抗（图3G-I）。然而，miR-552-3p并没有降低db/db小鼠的体重。此外，PTT实验结果显示miR-552-3p有效地抑制了肝脏糖异生（图3J）。所有这些结果证明miR-552-3p可以改善糖代谢。
图3 MiR-552-3p可改善HFHFr和db/db小鼠的糖代谢。（A）对照组和HFHFr小鼠的空腹血糖。（B-D）对照组和HFHFr小鼠的HOMA-IR、OGTT和ITT试验。（E）HFHFr小鼠体内胰岛素信号传导试验的蛋白免疫印迹。（F）db/db小鼠的空腹血糖。（G-H）db/db小鼠的HOMA-IR和OGTT试验。（I）db/db小鼠体内胰岛素信号传导试验的蛋白免疫印迹法。（J）db/db小鼠的PTT试验。
5 MiR-552-3p影响小鼠代谢率
为了确定miR-552-3p对小鼠全身代谢率和能量平衡的影响，在代谢室中监测小鼠24h。miR-552-3p组在HFHFr小鼠中具有较高的耗氧量和耗热量，而在对照组小鼠中没有影响。并且通过动态水平和垂直计数测量，miR-552-3p组HFHFr小鼠在光照和黑暗阶段都有更多的随意活动。这些结果表明，当动物处于营养过剩的条件下时，miR-552-3p具有增加能量消耗和代谢活性的潜在能力。
6 MiR-552-3p抑制糖脂代谢相关基因在细胞核中的表达
接下来探索miR-552-3p对代谢基因影响的潜在机制。IPA分析发现RNA-seq中差异表达下调基因主要涉及多个胆固醇生物合成途径，其中胆固醇生物合成和LXR途径被显著抑制。随后，通过质谱（MS）检测转染miR-552-3p的HepG2的蛋白水平，MS结果的IPA分析也表明miR-552-3p调节的LXR和FXR通路可能是其在代谢调节中功能的主要贡献者。
LXR和FXR作为NR1亚家族的成员，是肝脏脂质和葡萄糖在细胞核中发挥其作用的关键调节因子。为了研究miR-552-3p对LXR和FXR下游基因的抑制作用在那个部位。使用siRNA沉默importin8（负责将成熟miRNA转运到细胞核）的表达。通过沉默importin8降低细胞核中miR-552-3p的水平后，大多数下调的基因不再被miR-552-3p抑制（图4A），这表明miR-552-3p抑制基因表达多在细胞核中。为了验证这一现象，采用RT-PCR检测LXRα（FASN、SCD和SREBF1c）和FXR（SHP、ApoB和ABCG5）的下游基因。importin8敲除减弱了miR-552-3p在这些基因中的抑制活性（图4B），表明miR-552-3p抑制了LXRα和FXR下游基因在细胞核而不是细胞质中的表达。用importin8的siRNA不能明显逆转miR-552-3p对SHP的影响，表明miR-552-3p可能对SHP有其他调节机制。
图4 MiR-552-3p调节LXRα:RXRα和FXR:RXRα异源二聚体的转录活性。（A）整个细胞和细胞质中miR-552-3p下调的差异基因Venn图。（B）与miR-552-3p和importin8的siRNA共转染的HepG2中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP和ABCG5的mRNA水平。（C）荧光素酶法检测miR-552-3p对LXRE和FXRE的影响。（D）LXR激动剂GW3965和FXR拮抗剂Stigmasterol对调节LXRE和FXRE的miR-552-3p的影响。（E-F）miR-552-3p对FASN和APOB启动子荧光素酶活性的影响。（G-H）转染miR-552-3p后，GW3965或豆甾醇处理的HepG2中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP和ABCG5的mRNA水平。
7 MiR-552-3p调节LXRα:RXRα和FXR:RXRα异源二聚体的转录活性
为了进一步检测miR-552-3p如何调节LXRα和FXR通路，使用2×DR4 (LXRE)-荧光素酶或2×IR1 (FXRE)-荧光素酶报告基因检测miR-552-3p对LXRα或FXR转录活性的影响。对于LXRα/RXRα/LXRE-luc，miR-552-3p剂量依赖性地抑制荧光素酶活性，而对于FXRα/RXRα/FXRE-luc，通过与miR-552-3p共转染激活荧光素酶活性（图4C）。此外，GW3965（LXR激动剂）和豆甾醇（FXR拮抗剂）可以逆转miR-552-3p在LXRα和FXR转录活性中的调节功能（图4D）。
与LXRα或FXR共转染后FASN或ApoB启动子的活性增加，而miR-552-3p可以分别抑制FASN和增强ApoB启动子的荧光素酶激活。GW3965和豆甾醇可阻碍这些影响（图4F）。此外，加入GW3965或豆甾醇后，miR-552-3p抑制的LXRα和FXR下游基因的mRNA水平恢复（图4G-H）。为了明确miR-552-3p对SHP和ApoB的影响是否依赖于FXR，使用FXR siRNA与miR-552-3p共转染。FXR敲除后，miR-552-3p对FXR下游基因的降低作用全部消失，表明miR-552-3p通过FXR抑制FXR下游基因的表达。
8 MiR-552-3p结合DR4和IR1的AGGTCA互补序列
在FRET试验中，BHQ2标记的DR4反义链极大地抑制了FAM标记的miR-552-3p的荧光，加入未标记的DR4反义链可逆转这种抑制作用。但是当FAM标记的miR-552-3p和BHQ2标记的DR4正义链混合时，荧光淬灭并没有发生。同时，BHQ2标记的IR1的正义链和反义链都可以降低FAM标记的miR-552-3p的荧光，但未标记的IR1的竞争较弱，可能是因为IR1和miR-552-3p之间的匹配核苷酸比DR4少（图5A）。在pull down实验中，DR4的反义链和IR1的有义链和反义链都可以从HepG2的总RNA中富集miR-552-3p（图5B）。
基于此，猜测miR-552-3p可能通过其AGGTCA样序列与DR4或IR1结合，设计了miR-552-3p的突变体进行验证（图5C）。对于LXRα，miR-552-3p-5-MU和miR-552-3p-T-MU对荧光素酶活性或mRNA水平无抑制作用，而miR-552-3p-3-MU仍有较弱的抑制作用。但对于FXR，任何突变体对荧光素酶活性或基因表达都没有影响，表明miR-552-3p的两个AGGTCA样序列在激活FXR中的贡献相同（图5D-E）。
为了进一步探索miR-552-3p是否影响LXRα或FXR和DNA之间的结合，使用DR4和IR1探针进行了EMSA实验。发现miR-552-3p可以打破LXRα和DR4探针的组合，增加FXR和IR1探针的组合，但miR-552-3p突变体对这些组合没有影响（图5F）。此外，miR-552-3p对含有LXRα和FXR结合位点的内源性启动子探针（FASN和ApoB）也有相同的影响。此外，miR-552-3p的这些作用可以被LXR激动剂或FXR拮抗剂恢复（图5G）。最后，用RNA聚合酶II特异性抗体进行ChIP实验，研究miR-552-3p是否抑制LXRα或FXR下游基因的转录复合体形成。miR-552-3p显著抑制相关基因启动子的RNA聚合酶II占有率，但miR-552-3p突变体并不影响这种结合（图5H）。同时，anti-miR-552-3p大大增强了RNA聚合酶II与这些基因启动子的结合（图5I）。
综上所述，这些结果表明miR-552-3p结合AGGTCA的互补序列调节LXRα或FXR转录活性。
图5 MiR-552-3p结合AGGTCA的互补序列调节LXRα和FXR的转录活性。（A）miR-552-3p与DR4或IR1之间的FRET试验。（B）DR4或IR1在HepG2中的pull-down试验。（C）miR-552-3p突变的示意图。（D）miR-552-3p突变体对LXRE和FXRE的荧光素酶活性的影响。（E）转染miR-552-3p或其突变体的HepG2中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP、ABCG5的mRNA水平。（F）利用DR4和IR1探针的EMSA试验检测核蛋白与miR-552-3p或其突变体的相互作用。（E）使用DR4和IR1探针的EMSA试验中GW3965和豆甾醇对miR-552-3p与核蛋白结合的影响。（H-I）在转染miR-552-3p、其突变体或anti-miR-552-3p的HepG2中使用Pol II抗体进行ChIP试验。
9 FXR和LXR配体恢复miR-552-3p在原代小鼠肝细胞中的作用
为验证miR-552-3p在体内的作用机制，采用western blot检测HFHFr小鼠和对照组小鼠相关基因的水平。过表达miR-552-3p可以抑制相关基因的蛋白水平，而对照组小鼠中miR-552-3p对这些基因的影响较弱（图6A）。此外，RT-PCR和离体ChIP实验被用来验证miR-552-3p是否通过转录水平在体内抑制这些基因。结果显示，miR-552-3p过表达可以影响这些基因的mRNA水平（图6B），与mcherry组小鼠相比，miR-552-3p组肝细胞中pol II向一些代谢基因启动子区域的募集发生了很大的变化（图6C），表明miR-552-3p在转录水平调控基因表达与体外揭示的机制相似。然后使用LXRα激动剂和FXR拮抗剂来检测miR-552-3p是否通过影响LXRα和FXR配体恢复糖脂紊乱。LXRα激动剂、FXR拮抗剂或FXR的siRNA可减弱或逆转miR-552-3p引起的基因下调（图6D-E），证明miR-552-3p通过LXRα和FXR操纵基因表达。再者，Stigmasterol和GW3965可以抑制miR-552-3p在原代小鼠肝细胞中的降糖降脂作用（图6F-J）。这些发现表明miR-552-3p通过调节体内LXRα和FXR活性，在改善糖脂代谢紊乱中发挥作用。
图6 FXR和LXR配体恢复了miR-552-3p在原代小鼠肝细胞中的作用。（A）HFHFr小鼠ApoB、FASN、SREBP1c、HMGCR、CD36、G6Pc和SCD的蛋白水平。（B）HFHFr小鼠中FASN、SREBP1c、ApoB、HNGCR、CYP7A1、SCD、ACACB、BAT、DGAT1、DGAT2、FABP4、G6Pc和MTTP的mRNA水平。（C）在肝细胞中使用Pol II抗体的ChIP实验形成了mcherry和miR-552-3p组小鼠。（D-E）GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中的基因表达。（F）用GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中的葡萄糖生成试验。（G-H）油红O染色和定量。（I-J）定量用或不用GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中TC和TG的含量。
10 MiR-552-3p通过调节原代人肝细胞中LXRα和FXR抑制代谢基因表达
通过同样的方式验证miR-552-3p抑制人肝脏中糖脂代谢相关基因，在原代人肝细胞中重复了之前的一些实验。转染miR-552-3p的原代人肝细胞中SCD、MTTP、G6P、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG5的mRNA水平降低，用anti-miR-552-3p后均增加（图7A-B）。miR-552-3p可以被原代人肝细胞中DR4的反义链和IR1的有义链和反义链富集（图7C）。然后miR-552-3p突变体未能抑制LXRα和FXR下游基因的mRNA的结果证明miR-552-3p抑制原代人肝细胞中这些基因的表达也依赖于其AGGTCA样序列（图7D）。最后，在原代人肝细胞中，LXRα激动剂或FXR拮抗剂可逆转miR-552-3p引起的基因下调（图7E-F），这再次表明miR-552-3p通过与hepG2或小鼠中机制相同的机制操纵基因表达。
图7 MiR-552-3p可抑制原代人肝细胞中的代谢基因。（A-B）转染miR-552-3p或anti-miR-552-3p的肝细胞中SCD、MTTP、G6Pc、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG5的mRNA水平。（C）DR4或IR1的pull-down试验。（D）转染miR-552-3p或其突变体的肝细胞中FASN、SCD、SREBF1、ABCG5、SHP和ApoB的mRNA水平。（E-F）转染miR-552-3p后，GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP和ABCG5的mRNA水平。
11 肝脏miR-552-3p表达与NAFLD呈负相关
通过RT-PCR检测了伴或不伴NAFLD患者的肝脏miR-552-3p水平。与正常对照组相比，NAFLD患者的miR-552-3p水平明显降低（图8A）。为了进一步评估miR-552-3p与肝脏脂质积聚程度之间的关系，将人类受试者分为3组：正常对照、低度脂肪变性（5%<脂肪变性等级<66%）和高度脂肪变性（脂肪变性等级>66%）（图8B）。miR-552-3p减少的程度与脂肪变性的百分比呈正相关（图8C）。NAFLD的生理/生化指标与miR-552-3p表达的相关性分析发现，miR-552-3p的水平与NAFLD患者的BMI（图8D）、血清ALT（图8E）和AST（图8F）呈负相关。
图8 NAFLD中miR-552-3p表达的临床相关性。（A）与正常对照组相比，NAFLD患者的肝脏miR-552-3p水平。（B）NAFLD患者或正常对照的H&E染色肝脏切片。（C）miR-552-3p与脂肪变性分级的相关性分析。（D-F）miR-552-3p与NAFLD患者BMI（D）、血清ALT（E）和AST（F）的相关性分析。
结论
本研究报道了miR-552-3p可以通过在体内和体外转录水平调节代谢基因表达来改善GLMD，并揭示了miR-552-3p通过与其顺式作用元件结合来调节LXRα和FXR转录活性的潜在机制。此外，发现miR-552-3p虽然识别相似的核心序列，但对NR1家族转录因子具有不同的调控活性。除了miR-552-3p在体内和体外对糖脂代谢的有益作用外，其在NAFLD患者肝脏中的表达显著降低且这种降低可能与临床上NAFLD的进展呈正相关，仍需要更多的临床样本来支持和验证。
总之，本研究表明miR-552-3p通过调整LXRα和FXR的转录活性对糖脂代谢起调节作用。因此，基于miR-552-3p的治疗恢复糖脂代谢的不平衡可能对GLDM治疗有益。
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