编译:逍遥君,编辑:景行、江舜尧。
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MiRNA的核定位已被发现十多年,但其在细胞核中的确切机制和功能仍未完全阐明。本研究旨在使用RNA-seq探索核内miR-552-3p对NR1s的潜在作用和在改善肝脏糖脂代谢中的应用。研究发现miR-552-3p可以在体外抑制代谢基因表达,并在体内显示出对糖脂代谢的有益作用。核内miR-552-3p通过与AGGTCA互补序列结合调节LXRα和FXR的转录活性,恢复miR-552-3p对基因表达和糖脂代谢的影响。此外,与正常对照组相比,NAFLD患者肝脏样本中肝脏miR-552-3p水平显著降低。miR-552-3p调控LXRα和FXR的机制为miRNA介导的基因调控提供了新的模式。MiR-552-3p的体内有益作用和临床相关性表明,它可能是治疗糖脂代谢性疾病的潜在治疗靶点。
论文ID
原名:MiR-552-3p modulates transcriptional activities of FXR and LXR to ameliorate hepatic glycolipid metabolism disorder
译名:MiR-552-3p通过调节FXR和LXR的转录活性改善肝脏糖脂代谢紊乱
期刊:Journal of Hepatology
IF:20.582
发表时间:2020年8月
通讯作者:任进&陈静&赖陶荣
通讯作者单位:中国科学院上海药物研究所&上海交通大学
DOI号:10.1016/j.jhep.2020.07.048
实验设计
结果
使用RNA-seq检测转染miR-552-3p的HepG2中的基因表达谱。与NC组相比,miR-552-3p组775个基因表达下调,754个基因表达上调(图1B)。通过KEGG通路分析所有差异表达基因(图1C)。其中17.2%的下调差异基因均被富集到代谢途径,因而以下研究更多地关注下调的基因。
通过RT-PCR和western blot检测转染miR-552-3p或miR-552-3p抑制剂的HepG2中一些与糖脂代谢相关基因的mRNA来证实RNA-seq的结果。发现miR-552-3p可以降低SCD、MTTP、G6Pc、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG1的表达,而随着内源性miR-552-3p的降低,其表达上调(图1D-E),表明miR-552-3p具有抑制糖脂代谢相关基因表达的能力。通过构建miR-552-启动子荧光素酶报告质粒,研究在HEK293中加入各种不同链长或葡萄糖的FFA后miR-552-3p启动子的活性。发现长链脂肪酸,如肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸降低miR-552-3p启动子活性。综上所述,miR-552-3p抑制了糖脂代谢相关基因,而其表达被脂质应激抑制。
图1 MiR-552-3p可抑制HepG2代谢基因表达。(A)NR1和miR-552-3p顺式元件之间的序列比对。(B)RNA-seq的热图数据。(C)RNA-seq中差异表达基因的KEGG通路分析。(D-E)转染miR-552-3p(D)或anti-miR-552-3p(E)的HepG2中SCD、MTTP、G6Pc、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG1的mRNA水平。
2 MiR-552-3p改善小鼠因HFHFr饮食诱导的体重增加
为了进一步了解miR-552-3p在糖脂代谢中的生物学功能,通过尾静脉分别用AAV2/8-mcherry或AAV2/8-mcherry-miR-552-3p感染HFHFr(高脂和果糖饮食)和对照(正常饮食)小鼠(图2A)。注射后第14周,利用荧光显微镜检测AAV在小鼠肝脏中的感染效率。HFHFr小鼠和对照小鼠的AAV2/8-mcherry或AAV2/8-mcherry-miR-552-3p均具有较高的感染效率(>85%)。在HFHFr小鼠中,miR-552-3p组的体重增加较mcherry组慢(图2B),miR-552-3p组在HFHFr小鼠中的肝脏重量/体重比也低于mcherry组(图2C),而这些现象在对照组小鼠中没有。由于mcherry和miR-552-3p组的摄食量、附睾脂肪/体重比和肾周脂肪/体重比没有差异,因而无论是在HFHFr小鼠还是对照小鼠中,miR-552-3p对体重和肝脏的有益作用需要进一步的实验来明确调控机制。
图2 MiR-552-3p可缓解HFHFr小鼠肝脏脂肪变性和血脂异常。(A)动物实验示意图。(B)对照和HFHFr小鼠的体重。(C)对照和HFHFr小鼠的肝脏/体重比。(D)对照组和HFHFr小鼠的血清TC和LDL-C。(E)对照和HFHFr小鼠的OLTT试验。(F)对照组和HFHFr小鼠的肝脏TC和TG。(G)对照组和HFHFr小鼠的H&E和油红O染色肝脏切片。(H)油红O染色的定量分析。
3 MiR-552-3p缓解HFHFr小鼠肝脏脂肪变性和血脂异常
与HFHFr小鼠的mcherry组相比,HFHFr小鼠的miR-552-3p组血清TC和LDL-C显著降低,而两组之间的HDL-C和TG无显著差异。在对照组小鼠中,miR-552-3p对血脂四项均无影响(图2D)。同时,OLTT检测结果显示,miR-552-3p组可增强HFHFr和对照组小鼠的脂质代谢(图2E)。HFHFr小鼠miR-552-3p组肝脏TC和TG含量显著降低,而对照组小鼠无此现象(图2F)。根据H&E染色实验,miR-552-3p组在HFHFr小鼠中表现出较少的脂肪变性,在对照组小鼠中没有影响(图2G)。肝脏切片的油红O染色也显示在HFHFr小鼠中miR-552-3p过表达后TG的积累较低(图2G、2H)。此外,过表达miR-552-3p的小鼠原代肝细胞对FFA引起的脂质积累具有更强的抵抗力。上述结果表明miR-552-3p过表达改善了过量营养物质引起的脂质代谢失衡,但对正常生理条件没有影响。
4 MiR-552-3p改善HFHFr小鼠和db/db小鼠的糖代谢
体内检测miR-552-3p对糖代谢的影响,与mcherry组相比,过表达miR-552-3p有抑制HFHFr饮食诱导的血糖升高(禁食6h)的趋势(图3A)。此外,HOMA-IR评分、OGTT和ITT实验的结果证明miR-552-3p阻止了HFHFr小鼠胰岛素抵抗的发展(图3B-D)。为了证实miR-552-3p对胰岛素敏感性的影响,进行了体内胰岛素信号检测,结果发现HFHFr小鼠胰岛素信号受损,而miR-552-3p可以修复胰岛素信号通路(图3E)。
为了更好地探索miR-552-3p改善糖代谢的能力,在db/db小鼠中过表达miR-552-3p。db/db小鼠肝脏中AAV的感染效率>85%。随着时间的推移,mcherry组的空腹血糖逐渐增加,而miR-552-3p组增加较慢(图3F)。发现miR-552-3p可以缓解HOMA-IR、OGTT、体内胰岛素信号和ITT试验中的胰岛素抵抗(图3G-I)。然而,miR-552-3p并没有降低db/db小鼠的体重。此外,PTT实验结果显示miR-552-3p有效地抑制了肝脏糖异生(图3J)。所有这些结果证明miR-552-3p可以改善糖代谢。
图3 MiR-552-3p可改善HFHFr和db/db小鼠的糖代谢。(A)对照组和HFHFr小鼠的空腹血糖。(B-D)对照组和HFHFr小鼠的HOMA-IR、OGTT和ITT试验。(E)HFHFr小鼠体内胰岛素信号传导试验的蛋白免疫印迹。(F)db/db小鼠的空腹血糖。(G-H)db/db小鼠的HOMA-IR和OGTT试验。(I)db/db小鼠体内胰岛素信号传导试验的蛋白免疫印迹法。(J)db/db小鼠的PTT试验。
5 MiR-552-3p影响小鼠代谢率
为了确定miR-552-3p对小鼠全身代谢率和能量平衡的影响,在代谢室中监测小鼠24h。miR-552-3p组在HFHFr小鼠中具有较高的耗氧量和耗热量,而在对照组小鼠中没有影响。并且通过动态水平和垂直计数测量,miR-552-3p组HFHFr小鼠在光照和黑暗阶段都有更多的随意活动。这些结果表明,当动物处于营养过剩的条件下时,miR-552-3p具有增加能量消耗和代谢活性的潜在能力。
6 MiR-552-3p抑制糖脂代谢相关基因在细胞核中的表达
接下来探索miR-552-3p对代谢基因影响的潜在机制。IPA分析发现RNA-seq中差异表达下调基因主要涉及多个胆固醇生物合成途径,其中胆固醇生物合成和LXR途径被显著抑制。随后,通过质谱(MS)检测转染miR-552-3p的HepG2的蛋白水平,MS结果的IPA分析也表明miR-552-3p调节的LXR和FXR通路可能是其在代谢调节中功能的主要贡献者。
LXR和FXR作为NR1亚家族的成员,是肝脏脂质和葡萄糖在细胞核中发挥其作用的关键调节因子。为了研究miR-552-3p对LXR和FXR下游基因的抑制作用在那个部位。使用siRNA沉默importin8(负责将成熟miRNA转运到细胞核)的表达。通过沉默importin8降低细胞核中miR-552-3p的水平后,大多数下调的基因不再被miR-552-3p抑制(图4A),这表明miR-552-3p抑制基因表达多在细胞核中。为了验证这一现象,采用RT-PCR检测LXRα(FASN、SCD和SREBF1c)和FXR(SHP、ApoB和ABCG5)的下游基因。importin8敲除减弱了miR-552-3p在这些基因中的抑制活性(图4B),表明miR-552-3p抑制了LXRα和FXR下游基因在细胞核而不是细胞质中的表达。用importin8的siRNA不能明显逆转miR-552-3p对SHP的影响,表明miR-552-3p可能对SHP有其他调节机制。
图4 MiR-552-3p调节LXRα:RXRα和FXR:RXRα异源二聚体的转录活性。(A)整个细胞和细胞质中miR-552-3p下调的差异基因Venn图。(B)与miR-552-3p和importin8的siRNA共转染的HepG2中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP和ABCG5的mRNA水平。(C)荧光素酶法检测miR-552-3p对LXRE和FXRE的影响。(D)LXR激动剂GW3965和FXR拮抗剂Stigmasterol对调节LXRE和FXRE的miR-552-3p的影响。(E-F)miR-552-3p对FASN和APOB启动子荧光素酶活性的影响。(G-H)转染miR-552-3p后,GW3965或豆甾醇处理的HepG2中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP和ABCG5的mRNA水平。
7 MiR-552-3p调节LXRα:RXRα和FXR:RXRα异源二聚体的转录活性
为了进一步检测miR-552-3p如何调节LXRα和FXR通路,使用2×DR4 (LXRE)-荧光素酶或2×IR1 (FXRE)-荧光素酶报告基因检测miR-552-3p对LXRα或FXR转录活性的影响。对于LXRα/RXRα/LXRE-luc,miR-552-3p剂量依赖性地抑制荧光素酶活性,而对于FXRα/RXRα/FXRE-luc,通过与miR-552-3p共转染激活荧光素酶活性(图4C)。此外,GW3965(LXR激动剂)和豆甾醇(FXR拮抗剂)可以逆转miR-552-3p在LXRα和FXR转录活性中的调节功能(图4D)。
与LXRα或FXR共转染后FASN或ApoB启动子的活性增加,而miR-552-3p可以分别抑制FASN和增强ApoB启动子的荧光素酶激活。GW3965和豆甾醇可阻碍这些影响(图4F)。此外,加入GW3965或豆甾醇后,miR-552-3p抑制的LXRα和FXR下游基因的mRNA水平恢复(图4G-H)。为了明确miR-552-3p对SHP和ApoB的影响是否依赖于FXR,使用FXR siRNA与miR-552-3p共转染。FXR敲除后,miR-552-3p对FXR下游基因的降低作用全部消失,表明miR-552-3p通过FXR抑制FXR下游基因的表达。
8 MiR-552-3p结合DR4和IR1的AGGTCA互补序列
在FRET试验中,BHQ2标记的DR4反义链极大地抑制了FAM标记的miR-552-3p的荧光,加入未标记的DR4反义链可逆转这种抑制作用。但是当FAM标记的miR-552-3p和BHQ2标记的DR4正义链混合时,荧光淬灭并没有发生。同时,BHQ2标记的IR1的正义链和反义链都可以降低FAM标记的miR-552-3p的荧光,但未标记的IR1的竞争较弱,可能是因为IR1和miR-552-3p之间的匹配核苷酸比DR4少(图5A)。在pull down实验中,DR4的反义链和IR1的有义链和反义链都可以从HepG2的总RNA中富集miR-552-3p(图5B)。
基于此,猜测miR-552-3p可能通过其AGGTCA样序列与DR4或IR1结合,设计了miR-552-3p的突变体进行验证(图5C)。对于LXRα,miR-552-3p-5-MU和miR-552-3p-T-MU对荧光素酶活性或mRNA水平无抑制作用,而miR-552-3p-3-MU仍有较弱的抑制作用。但对于FXR,任何突变体对荧光素酶活性或基因表达都没有影响,表明miR-552-3p的两个AGGTCA样序列在激活FXR中的贡献相同(图5D-E)。
为了进一步探索miR-552-3p是否影响LXRα或FXR和DNA之间的结合,使用DR4和IR1探针进行了EMSA实验。发现miR-552-3p可以打破LXRα和DR4探针的组合,增加FXR和IR1探针的组合,但miR-552-3p突变体对这些组合没有影响(图5F)。此外,miR-552-3p对含有LXRα和FXR结合位点的内源性启动子探针(FASN和ApoB)也有相同的影响。此外,miR-552-3p的这些作用可以被LXR激动剂或FXR拮抗剂恢复(图5G)。最后,用RNA聚合酶II特异性抗体进行ChIP实验,研究miR-552-3p是否抑制LXRα或FXR下游基因的转录复合体形成。miR-552-3p显著抑制相关基因启动子的RNA聚合酶II占有率,但miR-552-3p突变体并不影响这种结合(图5H)。同时,anti-miR-552-3p大大增强了RNA聚合酶II与这些基因启动子的结合(图5I)。
综上所述,这些结果表明miR-552-3p结合AGGTCA的互补序列调节LXRα或FXR转录活性。
图5 MiR-552-3p结合AGGTCA的互补序列调节LXRα和FXR的转录活性。(A)miR-552-3p与DR4或IR1之间的FRET试验。(B)DR4或IR1在HepG2中的pull-down试验。(C)miR-552-3p突变的示意图。(D)miR-552-3p突变体对LXRE和FXRE的荧光素酶活性的影响。(E)转染miR-552-3p或其突变体的HepG2中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP、ABCG5的mRNA水平。(F)利用DR4和IR1探针的EMSA试验检测核蛋白与miR-552-3p或其突变体的相互作用。(E)使用DR4和IR1探针的EMSA试验中GW3965和豆甾醇对miR-552-3p与核蛋白结合的影响。(H-I)在转染miR-552-3p、其突变体或anti-miR-552-3p的HepG2中使用Pol II抗体进行ChIP试验。
9 FXR和LXR配体恢复miR-552-3p在原代小鼠肝细胞中的作用
为验证miR-552-3p在体内的作用机制,采用western blot检测HFHFr小鼠和对照组小鼠相关基因的水平。过表达miR-552-3p可以抑制相关基因的蛋白水平,而对照组小鼠中miR-552-3p对这些基因的影响较弱(图6A)。此外,RT-PCR和离体ChIP实验被用来验证miR-552-3p是否通过转录水平在体内抑制这些基因。结果显示,miR-552-3p过表达可以影响这些基因的mRNA水平(图6B),与mcherry组小鼠相比,miR-552-3p组肝细胞中pol II向一些代谢基因启动子区域的募集发生了很大的变化(图6C),表明miR-552-3p在转录水平调控基因表达与体外揭示的机制相似。然后使用LXRα激动剂和FXR拮抗剂来检测miR-552-3p是否通过影响LXRα和FXR配体恢复糖脂紊乱。LXRα激动剂、FXR拮抗剂或FXR的siRNA可减弱或逆转miR-552-3p引起的基因下调(图6D-E),证明miR-552-3p通过LXRα和FXR操纵基因表达。再者,Stigmasterol和GW3965可以抑制miR-552-3p在原代小鼠肝细胞中的降糖降脂作用(图6F-J)。这些发现表明miR-552-3p通过调节体内LXRα和FXR活性,在改善糖脂代谢紊乱中发挥作用。
图6 FXR和LXR配体恢复了miR-552-3p在原代小鼠肝细胞中的作用。(A)HFHFr小鼠ApoB、FASN、SREBP1c、HMGCR、CD36、G6Pc和SCD的蛋白水平。(B)HFHFr小鼠中FASN、SREBP1c、ApoB、HNGCR、CYP7A1、SCD、ACACB、BAT、DGAT1、DGAT2、FABP4、G6Pc和MTTP的mRNA水平。(C)在肝细胞中使用Pol II抗体的ChIP实验形成了mcherry和miR-552-3p组小鼠。(D-E)GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中的基因表达。(F)用GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中的葡萄糖生成试验。(G-H)油红O染色和定量。(I-J)定量用或不用GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中TC和TG的含量。
10 MiR-552-3p通过调节原代人肝细胞中LXRα和FXR抑制代谢基因表达
通过同样的方式验证miR-552-3p抑制人肝脏中糖脂代谢相关基因,在原代人肝细胞中重复了之前的一些实验。转染miR-552-3p的原代人肝细胞中SCD、MTTP、G6P、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG5的mRNA水平降低,用anti-miR-552-3p后均增加(图7A-B)。miR-552-3p可以被原代人肝细胞中DR4的反义链和IR1的有义链和反义链富集(图7C)。然后miR-552-3p突变体未能抑制LXRα和FXR下游基因的mRNA的结果证明miR-552-3p抑制原代人肝细胞中这些基因的表达也依赖于其AGGTCA样序列(图7D)。最后,在原代人肝细胞中,LXRα激动剂或FXR拮抗剂可逆转miR-552-3p引起的基因下调(图7E-F),这再次表明miR-552-3p通过与hepG2或小鼠中机制相同的机制操纵基因表达。
图7 MiR-552-3p可抑制原代人肝细胞中的代谢基因。(A-B)转染miR-552-3p或anti-miR-552-3p的肝细胞中SCD、MTTP、G6Pc、FASN、ApoB、SREBF1、HMGCR、SHP、CYP7A1、CD36和ABCG5的mRNA水平。(C)DR4或IR1的pull-down试验。(D)转染miR-552-3p或其突变体的肝细胞中FASN、SCD、SREBF1、ABCG5、SHP和ApoB的mRNA水平。(E-F)转染miR-552-3p后,GW3965或豆甾醇处理的肝细胞中FASN、SCD、SREBF1、ApoB、SHP和ABCG5的mRNA水平。
11 肝脏miR-552-3p表达与NAFLD呈负相关
通过RT-PCR检测了伴或不伴NAFLD患者的肝脏miR-552-3p水平。与正常对照组相比,NAFLD患者的miR-552-3p水平明显降低(图8A)。为了进一步评估miR-552-3p与肝脏脂质积聚程度之间的关系,将人类受试者分为3组:正常对照、低度脂肪变性(5%<脂肪变性等级<66%)和高度脂肪变性(脂肪变性等级>66%)(图8B)。miR-552-3p减少的程度与脂肪变性的百分比呈正相关(图8C)。NAFLD的生理/生化指标与miR-552-3p表达的相关性分析发现,miR-552-3p的水平与NAFLD患者的BMI(图8D)、血清ALT(图8E)和AST(图8F)呈负相关。
图8 NAFLD中miR-552-3p表达的临床相关性。(A)与正常对照组相比,NAFLD患者的肝脏miR-552-3p水平。(B)NAFLD患者或正常对照的H&E染色肝脏切片。(C)miR-552-3p与脂肪变性分级的相关性分析。(D-F)miR-552-3p与NAFLD患者BMI(D)、血清ALT(E)和AST(F)的相关性分析。
结论
本研究报道了miR-552-3p可以通过在体内和体外转录水平调节代谢基因表达来改善GLMD,并揭示了miR-552-3p通过与其顺式作用元件结合来调节LXRα和FXR转录活性的潜在机制。此外,发现miR-552-3p虽然识别相似的核心序列,但对NR1家族转录因子具有不同的调控活性。除了miR-552-3p在体内和体外对糖脂代谢的有益作用外,其在NAFLD患者肝脏中的表达显著降低且这种降低可能与临床上NAFLD的进展呈正相关,仍需要更多的临床样本来支持和验证。
总之,本研究表明miR-552-3p通过调整LXRα和FXR的转录活性对糖脂代谢起调节作用。因此,基于miR-552-3p的治疗恢复糖脂代谢的不平衡可能对GLDM治疗有益。
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