编译：YQ，编辑：景行、江舜尧。
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植物根系对于生长发育至关重要，根系吸收养分和水，同时防御土壤微生物。在不断变化的环境压力下，根系进化出复杂的结构，包括不同功能的细胞类型。拟南芥的根呈同心圆状，由最外层表皮、皮层、内皮层、中柱鞘、维管组织（木质部和韧皮部）组成。这些细胞分化源于根尖干细胞巢，而侧根形成源于木质部中柱鞘细胞。目前，基于荧光激活细胞分选（FACS）的细胞特异性转录组学技术，极大促进了对细胞在变化环境下的独特功能的理解。研究揭示根系细胞特异性调控网络对非生物胁迫下的根系发育起重要作用，然而细胞在调节根系免疫方面的功能尚不清楚。
叶面（每cm2）和根（每g）约有106-109微生物组成，其中的病原体的生活方式包括活体营养和坏死营养。根系病害是作物的主要威胁，通过改进病原相关分子模式免疫（PTI）可增强植株抗性，叶片上的质膜识别受体（PRR）是主要的诱导分子。除了PTI，植物还产生损伤相关分子模式（DAMP）防御病原，Pep1是最常见的DAMP，由质膜受体PEPR1/2识别，触发免疫反应。研究表明PEPR1介导一种鸟苷酰环化酶活性促进Ca2+内流，且在PTI受损的植株中Pep可维持植物免疫反应。因此，PTI与pep诱导的免疫反应间存在明显相互依赖性。然而根中DAMP和MAMP介导的免疫调控网络尚不清楚。
由于不同根细胞类型的PTI响应不同，本研究想探究如果flg22和Pep1触发不同的转录网络（在表皮、皮层、中柱鞘），是否可以识别出特定细胞类型的转录调控网络。本研究表明表皮、皮层、中柱鞘细胞激活特定免疫网络，通过转录因子及其结合基序推断细胞类型特异性基因调控网络。本研究表明细胞类型对免疫网络的重要性。
论文ID
原名：Regulation of Cell Type-Specific Immunity Networks in Arabidopsis Roots
译名：拟南芥不同根系细胞类型的特异免疫调控网络
期刊：Plant Cell
IF：9.618
发表时间：2020年8月
通讯作者：Patrick Schäfer
通讯作者单位：英国华威大学生命科学学院
DOI号：10.1105/tpc.20.00154
实验设计
结果
flg22或pep1处理拟南芥的根可诱导PTI免疫反应，如ROS积累、MAPK磷酸化、抗性基因表达等。先前研究表明Serendipita indica可通过抑制PTI促进其定殖，而flg22处理可抑制Serendipita indica定殖。该真菌能抑制flg22导致的生长抑制，然而不能抑制pep1的处理效果。这表明flg22和pep1在某种程度上有不同的激活信号通路。为探究PTI是否在不同根区激活，在flg22和pep1处理下将PTI标记基因启动子融合在核定位mVENUS载体上，结果显示flg22和pep1处理诱导根系分生组织（RAM）、过渡区（TZ）、伸长区（EZ）、分化区（DZ）的标记基因表达（图1A）。
由于根细胞类型在根系发育和非生物胁迫时具有不同功能，故探究flg22或pep1诱导对不同细胞类型的基因调控影响。每株拟南芥根系利用流式细胞仪提取20000个原生质体（通过带GTP的标记基因载体分选细胞类型）（图1B）。标记基因在不同细胞类型下的特异表达在免疫激活的根中没有改变（图1C）。对分选的细胞进行RNA-seq，平均1160万reads。主成分分析显示表达差异与细胞类型和flg22/pep1处理相关（图1D）。
图1. 三种根细胞类型的免疫转录组。A：flg22和pep1在所有根细胞类型中激活PTI报告基因；B：根系不同细胞类型；C：共聚焦图像显示不同细胞类型的特异基因标记荧光；D：RNA-seq样品的主成分分析。
2 flg22和pep1激活不同根细胞类型的免疫信号通路
识别flg22或pep1处理下各细胞类型的差异表达基因（DEG）共3276个，pep1处理下的差异表达基因明显多于flg22（图2A-B）。在表皮和皮层中，flg22和pep1诱导表达的基因富集于免疫功能（图2C-F），flg22处理下21%表皮特异性表达基因和22.5%皮层特异性表达基因与免疫相关，pep1处理下18%表皮特异性表达基因和19%皮层特异性表达基因与免疫相关。此外，激素信号在表皮细胞中显著富集，运输相关基因（寡肽运输、定位、有机离子转运）也显著富集。pep1抑制的基因富集于表皮发育进程（图2G），皮层中则富集于类黄酮代谢和生长激素合成（图2H）。
图2. 不同根细胞类型的不同免疫基因调控网络。A-B：flg22或pep1处理后不同细胞类型的差异表达基因数量；C-D：flg22诱导的表皮或皮层特异表达基因GO富集；E-F：pep1诱导的表皮或皮层特异表达基因GO富集；G-H：pep1诱导的表皮或皮层特异抑制基因GO富集；I：flg22与pep1响应基因数目以及细胞类型表达基因数目。
3 flg22调控基因网络比pep1多样化
在不同细胞类型间，78% flg22响应基因与pep1共有，而194个flg22特异响应基因中，89%基因仅在一种细胞类型中表达（图2I）。比较flg22和pep1诱导的特异响应基因，显示flg22响应基因在表皮和皮层富集于物质运输（如有机酸运输、氨基酸运输、硝酸运输），而pep1响应基因富集于激素代谢。因此，flg22和pep1激活了不同的基因调控网络，而flg22响应基因多数包含于pep1响应基因中。
4 细胞类型调控网络与胁迫网络重叠
每种细胞类型对根系完整性和生长发育至关重要，尤其在胁迫下。本研究确定了950个基因在表皮、512个基因在皮层、1055个基因在中柱鞘中特异表达。这些基因的GO富集体现显著不同的功能（图3A-C），比较细胞类型共同和特异表达基因集，发现PTI分别影响18%（表皮）、28%（皮质）和5%（中柱鞘）的基因（图3D-F），这些基因与盐胁迫或铁缺失基因调控网络大量重叠。
图3. 不同细胞类型特异表达基因富集。A-C：细胞类型特异表达基因GO富集；D-F：细胞类型特异表达基因与flg22/pep1响应免疫基因间的重叠。
5 特定细胞类型免疫网络的转录因子
调控基因网络中，转录因子在特定细胞类型发挥活性，但也可以跨越细胞类型。根的生长发育过程和细胞命运都依赖于转录因子的调控。本研究分析差异表达基因的启动子，确定转录因子结合基序及其丰度。本研究发现472个表皮（92%）、442个皮层（86%）和461个中柱鞘（90%）细胞特意表达基因的启动子中大量相似基序富集（图4）。表皮基因的启动子中，四个不同的WRKY转录因子的结合基序富集。皮质基因启动子中MYB转录因子结合基序富集。本研究观察到不同细胞类型中均有应激和发育相关的转录因子结合基序。在表皮中，flg22诱导基因富集于WRKY12/18/36/45和AHL12/20/25的结合基序（图5A），而pep1处理的表皮细胞中，ANAC46/55/55_2/58结合基序富集（图5B）。在皮层，flg22诱导基因的启动子中WRKY12/38/45、ATHB15/51、AHL12/20结合基序富集（图5C）。pep1诱导的皮层基因为MYC2/3/4和PIF3/4结合基序（图5D）。这些分析表明flg22、pep1诱导的转录因子与应激和发育相关。在pep1抑制基因的启动子中检测到丰富的发育相关转录因子结合基序。pep1和flg22特异调控的差异表达启动子在不同细胞类型的结合基序富集表现明显的差异。
图4.不同细胞类型特异表达基因的启动子结合基序富集模式。
6 转录因子结合基序决定细胞类型特异调控网络
在表皮中，WRKY45和PIRL2表现特异结合表达，而AtM10和bHLH92是皮层特异表达基因。pPROMOTER:LhG4 > pOp6:YFP反式激活验证系统表明pWRKY45:LhG4和pPIRL2:LhG4在表皮特异表达，pAtM10:LhG4在皮层特异表达（图6A、D、G）。用非功能序列替换原基因启动子可消除YFP荧光表达，这表明预测基序的准确性（图6B、C、E、F、H、I）。综上所述，本研究启动子基序预测工具确定了转录因子结合位点，表明转录因子结合基序在调控细胞类型特异基因表达中的重要性（图7）。
图6. 基于细胞类型特异表达基因预测启动子及转录因子结合基序。A-I：pOp6: YFP反式激活系统；J-L：RT-qPCR表达量。
图7.合成“结合基序”启动子验证基序的调控作用。
讨论
本研究为获取根系免疫的调控网络，通过flg22和pep1进行诱导，触发根系防御反应，分析了表皮、皮层、中柱细胞的免疫基因网络，发现特定细胞类型转录组揭示了非生物胁迫与细胞类型调控网络的密切关系。研究表明盐胁迫下细胞类型特异性免疫信号通路涉及脱落酸等激素，重新调整根系生长和根系结构。除了激素，RALF肽与受体FERONIA的相互作用可调节侧根的形成。不同细胞类型的免疫基因调控需要高程度的协调，例如大量调控和信号蛋白，明显增加了根系适应变化环境的灵活性。本研究发现差异表达基因的转录因子结合基序因细胞类型而不同，功能启动子分析证实结合基序对免疫基因特异表达的重要性。本研究构造一个调控模式（图8），其中特定的转录因子组合以flg22/pep1诱导的方式在特定细胞类型中高度表达，称为核心转录因子。在表皮中，WRKY12/18/38/45作为核心转录因子与网络中的ATHB、MYC、PIF转录因子和免疫网络的KAN、YAB转录因子配对。而在皮层中，MYC2/3/4和ATHB15/51作为核心转录因子，与WRKYs配对调控皮层特异性免疫。因此，不同转录因子家族的协同，巩固了对高度细胞类型特异性免疫网络的理解。未来的研究中，细胞类型的核心转录因子在多大程度上促进对病原体的抵抗以及免疫激活后的根系生长将是一个有趣的探索。
图8. 转录因子介导的细胞类型特异性免疫网络模型
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