编译:思越,编辑:景行、江舜尧。
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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是发展成肝硬化/肝癌的重要致病因素,但是目前对其发病机制认知较少,且缺乏准确的非侵入性生物标志物。本文通过对125位NAFLD患者样本进行转录组学分析,发现炎症和脂质代谢途径的上调,并找到了新型NAFLD标志物---IL32,可以通过血液生化学检查诊断NAFLD,并通过建立IL32与ALT-AST的联合模型提高了对NAFLD的预测能力,具有重要的临床价值。
论文ID
原名:Liver transcriptomics highlights interleukin-32 as novel NAFLD-related cytokine and candidate biomarker
译名:肝脏转录组学强调IL32是NAFLD相关的新型细胞因子和生物标记物
期刊:Gut
IF:19.819
发表时间:2020年10月
通讯作者:Stefano Romeo & Luca Valenti
通讯作者单位:米兰大学&卡坦扎罗大学
DOI号:10.1136/gutjnl-2019-319226
结果
已有研究显示,PNPLA3 I148M是肝脏脂质堆积和进行性NAFLD的主要遗传因素,但是由PNPLA3 I148M介导的转录本变异的详细特征仍未被阐明。研究者利用125位重度肥胖患者的肝脏样本进行RNA测序,使用主成分分析去鉴别影响肥胖患者转录本变异的主要因素(图1A)。主成分1(PC1)主要与气球样变、小叶炎症和性别独立相关,并与携带PNPLA3 I148M突变相关;主成分2(PC2)同样与携带PNPLA3 I148M突变及性别相关,提示PNPLA3 I148M可能是肥胖患者转录本变异的主要决定因素。
2 PNPLA3 I148M介导基因的差异表达
为了探究PNPLA3 I148M对患者肝脏转录本的影响,研究者对存在PNPLA3 I148M变异的患者的转录本进行差异表达分析,得到161个下调基因和481个上调基因(表2),通过基因集富集分析(GSEA)显示,这些基因主要与脂质代谢、炎症、癌症相关通路有关。但在非PNPLA3 I148M变异患者中,未发现这些通路的富集,这与先前的研究发现PNPLA3 I148M变异的患者脂质代谢减少,肝脏炎症和细胞增殖的增加是一致的。
3 与重度NAFLD相关的通路与差异基因
研究者进一步分析了重度NAFLD、非重度NAFLD与正常肝脏之间的差异表达基因。在重度NAFLD中,共有320个基因差异表达,并发现与肝纤维化相关的基因Krt8,COL1A1高表达(表2),其中,IL32、SOCS1和AKR1B10的上调最为明显。GSEA显示这些基因主要与炎症、纤维形成、细胞死亡、代谢、缺氧和上皮向间充质转化有关(图1C)。
接着,通过PNPLA3 I148M是否变异对重度NAFLD进行分层。在PNPLA3 I148M变异和非变异的重度NAFLD患者中,共检测到193和148个差异表达基因,其中在两类患者中均发现IL32的上调,非变异患者的主要富集于炎症,上皮向间充质转化,纤维化和缺氧通路上(图1D),变异患者的差异基因主要富集在与炎症相关的IL6-JAK-STAT3信号通路、 KRAS 信号通路、缺氧和凋亡相关的通路上(图1E)。总之,这些结果提示在严重NAFLD中,PNPLA3 I148M的变异可能影响NAFLD向肝硬化乃至肝癌的发展,且IL32的上调是普遍且显著的。
图1.主成分相关性分析与差异通路表达。(A)肝脏转录组主成分(PC)与临床特征的相关性矩阵;(B-E)PNPLA3 I148M变异与非变异、重度NAFLD与轻度NAFLD以及健康个体、重度与轻度PNPLA3 I148M非变异及健康个体、重度与轻度PNPLA3 I148M变异及健康个体的基因富集分析。
4 IL32与重度NAFLD的炎症和代谢反应有关
研究者对于IL32亚型的表达谱进行进一步分析。发现IL32β是IL32家族中表达最多的亚型(图2A),并且相比于非重度NAFLD,在重度NAFLD中IL32β的表达更高(图2B)。为了研究与IL32表达相关的转录模式,研究进行了共表达分析,发现IL32与肝脏损伤修复、炎症、细胞增殖、纤维化、代谢等通路相关,CCL14与IL32呈较强负相关,GSEA分析显示IL32与炎症、肝损伤和新陈代谢相关的途径相关(图3A)。相比与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)组,肝组织中IL32表达升高,且IL32的表达与脂肪变性程度(图3B)、小叶炎症(图3C)、气球样变(图3D)和纤维化(图3E)有关,强调IL32在NAFLD进程中发挥了重要作用。
接着研究者研究了IL32在不同细胞类型中的表达情况(图4A)。相比于肝星状细胞和单核/巨噬细胞,原代肝细胞和HepG2肝癌细胞中的IL32水平更高,且在淋巴细胞和内皮细胞中高表达。此外,通过CHIP实验发现,PPARGC1A和RXRA等几种脂肪酸敏感的转录因子在人体IL32的启动子中有结合位点,说明IL32的表达可能受到肝细胞中脂肪酸和维甲酸的调节,并发现HepG2肝癌细胞中暴露于游离脂肪酸后,IL32表达量呈剂量依赖性增加。
图2.IL32亚型表达谱。(A)IL32基因亚型的百分比;(B)IL32基因亚型绝对表达值。
图3.IL32表达相关性。(A)IL32相关基因通路富集;(B-E) IL32表达按脂肪变性程度、小叶炎症、气球样变和纤维化分层。
5 血浆中可检测到IL32与NAFLD严重程度相关
为进一步明确IL32的临床诊断价值,血浆中的 IL32水平是否反映了其在肝脏的表达。通过对患者血浆中的IL32水平进行分析,发现血浆中的IL32水平与肝脏中IL32的表达具有很强的相关性(图4B)。NAFLD患者中相比于正常人的IL32水平升高(图4C),重度NAFLD患者的IL32水平也高于轻度NAFLD患者(图4D)。在肝病服务机构的另一队列以及合并队列中进行了同样的测试,发现具有相同的现象(图4E,F,G,H)。
接着,研究者将IL32与ALT-AST模型联合进行诊断,以探究IL32是否提高了ALT-AST对于轻度和重度NAFLD的诊断性能。对于诊断NAFLD,在减重手术组中,联合IL32与ALT-AST模型提高了对NAFLD诊断的准确性(AUC=0.85,图5A);在肝病服务队列中,联合模型也显示出更好的NAFLD的诊断效能(AUC=0.95,图5B),在合并队列中也具有更好的诊断效果(AUC=0.92,图5C)。对于诊断重度NAFLD患者,在减重手术组中,联合IL32与ALT-AST模型部分提高了对NAFLD诊断的准确性,但无统计学意义(图5D);在肝病服务队列和合并队列中,联合模型并未改善重度NAFLD诊断的准确性(图5E,F)。
图4.不同细胞类型及血浆中IL32的表达。(A)IL32在不同细胞类型中的表达;(B)IL32的肝脏表达与血浆水平之间的Spearman相关性;(C-H)肥胖手术组(C、D),肝病服务队列(E和F)和合并队列中的IL32血浆水平。
图5.IL32诊断准确性。(A-C)减肥手术组(A),肝病服务组(B)和合并队列(C)的NAFLD诊断准确性;(D-F)减肥手术组(A),肝病服务组(B)和合并队列(C)的重度NAFLD诊断准确性。
结论
本研究在前人研究的基础上,明确了PNPLA3I148M在肝脏脂肪变性以及NAFLD进展中的重要作用,为今后NAFLD的基因诊断提供了参考价值;其次,筛选出非重度和重度NAFLD患者差异表达的基因,最终明确IL32在NAFLD发生发展中的重要作用。值得一提的是,IL32在血浆中的表达水平与其在肝脏中的表达水平呈正相关,根据患者血浆IL32水平可以对NAFLD及其严重程度做出诊断,对于改良目前以侵入性检查为主的NAFLD临床诊断有重要参考价值。
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