编译：怀瑾，编辑：景行、江舜尧。
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内源性大麻素系统对人类多发性硬化症（MS）具有一定的保护作用。星形胶质细胞和小胶质细胞受内源性大麻素的调节，并参与其生物合成和代谢，但神经胶质细胞作为MS内源性大麻素信号转导靶点和中介的作用机制尚不明确。本研究建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）雌鼠模型，创新性利用微流控RT-qPCR研究内源性大麻素系统基因在星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达变化及其在EAE中的表型转化，发现在疾病急性期星形胶质细胞和小胶质细胞中神经毒性A1和促炎因子的编码基因显著上调，其中许多转录本在疾病缓解期仍保持较高水平；在EAE进展过程中，2-花生四烯酰甘油（2-AG）水解酶基因的表达最早被下调且持续整个过程。此外，大麻素受体及信号转导相关基因的转录变化具有细胞特异性。总之，本研究表明星形胶质细胞和小胶质细胞在自身免疫脱髓鞘中的作用涉及多个内源性大麻素信号传导相关基因的表达变化，同时该信号转导可调控星形胶质或小胶质细胞。
论文ID
原名：Gene Expression Analysis of Astrocyte and Microglia Endocannabinoid Signaling during Autoimmune Demyelination
译名：自身免疫性脱髓鞘过程中星形胶质细胞和小胶质细胞内源性大麻素信号的基因表达分析
期刊：Biomolecules
IF：4.694
发表时间：2020年8月
通讯作者：Susana Mato
通讯作者单位：西班牙巴斯克大学，神经科学系
DOI号：10.3390/biom10091228
实验设计
构建实验性EAE小鼠模型，利用流式细胞分选仪分选、纯化EAE整个病程不同阶段的小鼠脑部胶质细胞和小胶质细胞。基于微流控RT-qPCR技术，检测细胞中内源性大麻素信号转导相关分子的转录变化和细胞表型的改变。
结果
为研究内源性大麻素在调节MS中星形胶质细胞功能障碍中的作用，研究者利用微流控RT-qPCR检测EAE进展期细胞中主要内源性大麻素信号分子的基因表达水平，结果发现，无症状期的星形胶质细胞中几种内源性大麻素系统相关基因表达具有明显的改变，Faah和Napepld水平升高而Fabp7显著降低（图1B）。此外，EAE发病前期的星形胶质细胞显示出主要的2-AG水解酶Mgll和Abhd6的基因表达下调，而αDAGL（Dagla，主要负责神经组织中2-AG合成）并没有变化（图1B）。除Faah（其在慢性疾病中持续存在）外，EAE急性期星形胶质细胞中所有与大麻素代谢相关的基因均减少（图1C，D）。在急性期和恢复期，内源性大麻素水解基因表达的降低与Cnr1转录水平降低有关。在疾病进展的任何阶段，均未检测到星形胶质细胞中大麻素CB2受体mRNA水平（图1C，D），这也与以前在星形胶质细胞中仅支持CB2受体微弱表达的细胞药理研究基本一致。此外，研究者检测到Dagla和Daglb基因表达下调而Napepld没有变化，表明在急性和慢性疾病阶段与水解相关基因的缺陷与2-AG生物合成相关分子的选择性转录抑制相对应（图1C，D）。
图1. EAE期间星形胶质细胞内源性大麻素系统基因的早期失调。A.从EAE小鼠中枢神经系统中纯化星形胶质细胞的FACS门控策略，分选的星形胶质细胞为ACSA-2 +细胞。在此过程中，逐步排除小胶质细胞/巨噬细胞和造血细胞（CD11b + / CD45 +），少突胶质细胞（O1 +），少突胶质细胞祖细胞（A2B5 +）和内皮细胞（CD31 +）；B–D. 各直方图分别表示EAE发病前期（B），急性期（C）和恢复期（D）分选的细胞中内源性大麻素活性基因的相对表达变化（与纯化的未免疫小鼠的星形胶质细胞相比）
2 EAE促进星形胶质细胞转化为具有神经毒性的A1表型
最新的组织和细胞类型特异性转录组研究表明，神经毒性A1星形胶质细胞在MS发病机制中具有重要作用，其在啮齿动物疾病模型中的作用机制仍未明确。为此，研究者在EAE病程的不同阶段检测与A1表型相关基因的表达。同时分析了与保护性A2反应表型、星形胶质细胞角蛋白基因以及自身免疫脱髓鞘过程中涉及星形胶质细胞功能的几种基因。RT-qPCR结果显示，在EAE发病过程中活化的星形胶质细胞中角蛋白基因（Cxcl10，Gfap，Serpina3n）表达升高，星形细胞标志基因（Aldh1 / l1，Aqp4，Slc1a3）的mRNA表达降低（图2A）。研究者还证实了在EAE疾病高峰期相关编码分子（包括Ccl2，Ccl5和Nos2）以及I型干扰素信号转导途径基因（Stat1，Stat2，Irf9，Mx1）的转录本上调。此外，星形胶质细胞在EAE急性期A1反应性基因的mRNA表达明显升高，其中许多分子在恢复期仍保持升高状态（图2A）。此外，无症状期的星形胶质细胞中，许多A1基因也显著上调（图2A），表明这些细胞向神经毒性表型的转化是EAE的早期事件，并伴随外周免疫细胞在CNS 的浸润。有趣的是，EAE急性期的星形胶质细胞中，神经功能障碍与C3转录水平的上调密切相关。然而，在疾病急性期或慢性阶段，编码其他A1表型基因的失调并没有显著性，甚至与疾病相关的运动评分呈负相关。在EAE进程中，星形胶质细胞A2表型基因的表达并未改变或仅微量增加（图2A）。对A1和A2基因的归一化分析表明，在EAE病程中神经毒性基因的诱导作用更大（图2B）。为了证实EAE中A1星形胶质细胞的存在，研究者评估了脊髓星形胶质细胞中C3在蛋白水平的表达。使用针对补体成分C3的抗体进行双重免疫标记和星形细胞GFAP标记，结果显示与正常组相比，慢性EAE小鼠的脑部白质区星形胶质细胞中C3的表达增加（图2C）。共定位分析还表明，星形胶质细胞中C3的表达占主导地位，因为约75％的C3阳性细胞均为GFAP+（图2C）。由于星形细胞C3与突触的异常剥离和髓磷脂吞噬的神经毒性表型有关，研究者检测纯化的细胞中上述功能相关基因的表达情况。急性期星形细胞A1反应性转录本的诱导表达伴随神经保护（Bdnf），突触形成（Gpc4，Gpc6，Sparcl1）和吞噬作用（Megf10，Gas6，Axl）相关基因的下调（图1C，D ）。急性期星形细胞中突触形成分子Thbs1的水平增加，这已报道的体外/内诱导A1星形胶质细胞后的变化一致。总之，这些数据表明星形胶质细胞在EAE病程中获得了神经毒性A1表型，且该表型与维持和促进突触损伤以及髓鞘清除能力减弱有关。
图2. EAE期间星形胶质细胞的表型变化。A.热图表示在发病前期（EAE-P），急性期（EAE-A）和恢复期（EAE-R）从小鼠分离的星形胶质细胞中神经毒性A1、保护性A2和角蛋白基因转录本的平均表达情况；B. 直方图表示EAE进展过程中归一化的A1和A2基因表达水平；C.慢性EAE小鼠的脊髓白质中补体成分C3与星形细胞标记GFAP的共聚焦图像（左），对两者共定位进行量化（右）；D，E.在EAE急性和慢性期分选的星形胶质细胞中与神经保护和突触形成有关的基因（C）和吞噬作用（D）的基因mRNA表达的变化
3 EAE病程中小胶质细胞内源性大麻素信号传导相关基因的调控
进一步，研究者检测在EAE病程中纯化的小胶质细胞中内源性大麻素信号传导相关基因的表达水平。与在星形胶质细胞中的观察相反，RT-qPCR未检测到小胶质细胞中Cnr1的表达；Cnr2转录本在正常小鼠的细胞中表达，但在EAE中并未受到明显调节（图3B–D）。有趣的是，从EAE小鼠中枢神经系统中分离出的小胶质细胞显示出2-AG代谢相关基因表达的变化，这与疾病进展期间星形胶质细胞中所观察到的基因变化有关。特别指出的是，在无症状以及病情高峰期的小胶质细胞中，Mgll，Abhd6和Abhd12的转录水平降低（图3B–D）。同时，小胶质细胞中2-AG合成相关基因Dagla和Daglb的表达降低的最早，这些转录变化在EAE恢复期的小胶质细胞中仍存在（图3D）。另一方面，疾病发生前的小胶质细胞中，与AEA生物合成和代谢有关的基因并未明显改变（图3B）。然而，急性和慢性期的细胞显示出Faah表达的下调，同时Naaa水平升高，而Napepld或Fabp7的表达却没有变化（图3B–D）。总之，这些结果表明在EAE进程中，星形胶质细胞和小胶质细胞在AEA信号相关基因的转录调控方面存在差异。
图3. EAE期间小神经胶质内源性大麻素系统基因表达的变化。A．流式细胞术门控策略，纯化分析EAE小鼠的小胶质细胞，分选的小胶质细胞为CD45low CD11b+细胞; B–D.小胶质细胞中内源性大麻素信号转导基因的RT-qPCR分析，分别对应EAE发病前期（B），急性期（C）和恢复期（D）
4 EAE病程中小胶质细胞促炎和保护性基因的表达模式
MS中小胶质细胞的激活分为促炎状态（也称M1）和再生状态（称M2）。EAE小鼠小胶质细胞的RNA-seq表明，在疾病过程中其表型发生了变化，其中趋化因子和凋亡细胞摄取相关分子的变化最早发生。与此一致的是，RT-qPCR显示在EAE小鼠的小胶质细胞中诱导和表达促炎反应的相关基因（如Ccl2，Ccl5，Cxcl2，Nos2或Stat1）显著上调（图4A）。尽管急性期对M1表型基因的诱导最为显著，但其中的某些分子在疾病发生前的小胶质细胞中已被上调（图4A），因此与星形胶质细胞中A1基因的早期诱导相对应。这些结果印证如下假设，即在中枢神经系统疾病期间激活的小胶质细胞可促进体内星形胶质细胞神经毒性表型的诱导。但在EAE过程中的小胶质细胞中，某些促炎基因并不被调控（如Il6），甚至被下调（如Il12a，Tnfa）。大多数与小胶质细胞M2表型相关基因的表达均显著降低（图4A）。尽管单个基因转录水平的变化表明EAE小胶质细胞主要表现出促炎特性，但归一化分析显示，在疾病发生过程中M1和M2相关基因的整体改变并不显著（图4B）。此外，M1基因均未与急性或慢性EAE的疾病评分有显著相关性。这些结果与星形胶质细胞中A1基因的显著变化形成对比（图1A），表明小胶质细胞的主要亚群在自身免疫脱髓鞘过程中表现出中间激活状态。
5 EAE诱导小胶质细胞中星形细胞角蛋白基因和A1样基因的表达
中枢神经系统疾病（如脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化症）可诱导小胶质细胞中经典星形胶质细胞特异性基因的自体表达，但其生物学作用尚不清楚。为探究上述是否在MS中发生，研究者检测EAE过程中小胶质细胞的角蛋白基因和A1表型标记的mRNA水平。与先前的观察结果一致，EAE急性期小鼠的小胶质细胞过表达反应性胶质化标记（如Gfap，Serpina3n，S1pr3和Cd44）。此外，EAE过程中小胶质细胞的转录分析显示星形胶质细胞A1基因的表达上调，其中补体成分C1ra和C3的水平升高（图4C）。这些发现表明在EAE病程中，与神经毒性星形胶质细胞表型相关基因的诱导表达并不局限于该细胞群。但小胶质细胞中A1样基因的失调与急性或慢性EAE的疾病程度没有显著相关性。因此，这些结果否定了EAE过程中小胶质细胞中A1基因表达的病理相关性。
图4. EAE期间小胶质细胞促炎和抗炎基因的表达。A.热图显示经RT-qPCR测得的小胶质细胞中M1和M2表型相关基因的平均表达情况，分别为EAE发病前期（EAE-P），急性期（EAE-A）和恢复期（EAE-R）；B.对归一化的基因表达情况进行单因素方差分析，表明在疾病进展过程中M1或M2基因转录本没有整体失调；C.在EAE病程中小胶质细胞A1神经毒性基因的表达情况
结论
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END
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