编译：逍遥君，编辑：景行、江舜尧。
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垂体前叶在调节各种生理过程（包括机体生长、生殖、代谢和应激反应）中起核心作用。本研究对来自人胎儿垂体的4113个单个细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并描述了5个激素生成细胞谱系中具有不同过渡中间状态的不同发育轨迹。促肾上腺皮质激素在完全分化之前表现出早期中间状态。PIT-1谱系的三种细胞类型（生长激素、乳激素和甲状腺激素）从共同的祖细胞中分离出来，共同表达不同亚系的特异性转录因子。促性腺激素经历了两个多步骤的发育轨迹。此外，鉴定了一种胎儿促性腺激素亚型，还对垂体干细胞的细胞异质性进行了表征，并确定了上皮/间充质混合状态和从早到晚的状态转变。本研究结果提供了对人类垂体发育的转录图谱的洞察力，定义了不同的细胞亚型和亚型，并阐明了细胞命运承诺过程中转录因子的动态变化。
论文ID
原名：Single-cell transcriptomics identifies divergent developmental lineage trajectories during human pituitary development
译名：单细胞转录组学确定人类垂体发育过程中不同的发育谱系轨迹
期刊：Nature Communications
IF：12.121
发表时间：2020年10月
通讯作者：文路&乔杰
通讯作者单位：北京重点实验室生殖内分泌与辅助生殖中心&北京大学&教育部
DOI号：10.1038/s41467-020-19012-4
实验设计
结果
对21例受精后7-25周的人胎儿脑垂体进行scRNA-seq，得到4113个高质量细胞（图1A）。使用已知的标记基因共鉴定出14个细胞簇（图1B），鉴定了垂体前叶内分泌细胞群中9个亚群，包括干细胞（Stem）、周期细胞（CC）、促皮质激素细胞、PIT-1祖细胞（Pro.PIT1）、生长激素细胞、泌乳素细胞、促甲状腺激素细胞、促性腺激素的前体细胞（Pre.Gonado）和促性腺激素细胞。PITX1和PITX2在所有9个簇中都有表达，SOX2和PROP1在干细胞中特异表达（图1C）。
此外，分析了内分泌细胞分化的时间，结果表明，促皮质激素细胞最早出现在第7周；紧随其后的是生长激素细胞和促性腺激素细胞，分别在第10周和第16周左右出现促甲状腺激素细胞和泌乳素细胞（图1D）。还发现大量已知的转录因子（TF）（包括SOX2、TBX19、POU1F1和NR5A1）被激活（图1E）。综上所述，这些结果提供了关于人类垂体发育的全面和准确的信息。
2 垂体干细胞的特征
人垂体干细胞尚未得到全面表征。本研究鉴定了干细胞特异性基因，包括SOX2、PROP1、LHX3、HES1、ZFP36L1、ANXA1、NFIB、ZNF521和NR2F2（图2a）。基因集富集分析（GSEA）显示TGF-β、Notch、Wnt和Hedgehog信号通路在干细胞中富集，“紧密连接”、“细胞周期”和“ECM受体相互作用”通路也高度富集（图2b）。暗示间充质细胞可能参与干细胞的调节。对干细胞重新聚类发现了三个亚群（Stem1、Stem2和Stem3），发现Stem1细胞主要来源于早期垂体（7-10周），而Stem3细胞主要来源于晚期垂体（19-25周），表明这些亚群的细胞状态伴随时间发生变化（图2c）。Stem1细胞富集了“干细胞增殖”的基因（例如HMGA2），而Stem3细胞强烈富集了“细胞增殖负调控”的基因（例如CDKN1A，图2d）。CC簇的重新聚集显示，大多数循环细胞为sox2阳性干细胞，一小部分为POU1F1或tbx19阳性细胞，通过免疫荧光染色也得到了验证（图2f）。通过对8、17周和23周样本进行染色（图2 g），从早期到晚期，循环干细胞占总干细胞群的比例逐渐下降（图2f），这些结果共同暗示Stem3细胞进入静止或低增殖状态。滤泡星状细胞（FSCs）S100B的标记物在早期和晚期干细胞中的一小部分中表达（图1c）。结果表明，在受精后25周，人胎儿垂体中不存在FSCs。免疫荧光染色，显示大部分SOX2阳性干细胞在10周时也为ASCL1阳性，而在23周时几乎没有双阳性细胞（图2e）。
综上所述，分析发现垂体干细胞的胚胎状态转变伴随着细胞增殖的负调控和转录因子和信号通路的改变。
图2. 垂体干细胞的分子特征和异质性。（a）z评分热图显示干细胞和分化的内分泌细胞之间的差异表达基因。（b）条形图显示干细胞和GSEA检测到的DEC之间差异富集的KEGG通路。（c）条形图显示干细胞三种亚型的阶段。（d）Stem1和Stem3细胞之间代表性DEG的小提琴图。（e）8周和23周人胎儿垂体中SOX2和ASCL1的免疫荧光染色。（f）CC簇由不同的细胞亚型组成。（g）8、17和23周人胎儿垂体中SOX2和Ki67的免疫荧光染色（左）和每个样本中双阳性和SOX2阳性细胞的比值（右）。
3 垂体干细胞处于混合上皮细胞/间充质细胞状态
主成分分析（PCA）发现，所有内分泌细胞在PC1轴上从干细胞到分化细胞的梯度转变中有序排列，因此使用PC1轴作为分析干细胞分化的轨迹（图3a）。检测显示，上皮标记物（如CDH1）和间充质标记物（如VIM和CDH2）在干细胞中高表达，但在分化细胞中低表达；EPCAM在两组中均高表达（图3b）。这表明，干细胞以同时表达上皮和间充质标记物的状态存在。通过定义上皮评分（E.score）、间充质评分（M.score）和干性评分（S.score）发现所有三个评分均沿分化轴降低（图3c）。SCENIC分析表明，CDH1、CDH2、CDH3和VIM是SOX2和SOX4的潜在靶标；VIM和CDH3是PROP1的潜在靶标。
总之，数据表明垂体干细胞以混合E/M状态存在，这与其干性特征相关。
图3. 垂体干细胞混合上皮/间充质状态。（a）PCA图显示内分泌细胞沿PC1轴分化。（b）散点图显示PCA图上投射的代表性上皮和间充质标记物的表达。（c）上皮评分（E.score）、间充质评分（M.score）和干性评分（S.score）的值，以及代表性基因的表达水平，在分化过程中下降。
4 发育轨迹的重建
接下来，重建了5个内分泌细胞谱系的发育进程，应用RNA速度和slingshot来鉴定瞬时前体（图4a）。Slingshot结果显示，在发育过程中，特定的TF下调或上调（图4b）。29个转录因子被鉴定为下调基因（包括PROP1，SOX2，LHX3，HES1，TCF7L1和TGIF1在内），在所有五个谱系中共享（图4c，d）。
图4.激素生成细胞的假时发育轨迹。（a）内分泌细胞的拟时序分析如UMAP图所示。（b）热图显示TF的相对表达量沿各谱系的拟时序轴表现出显著变化。（c）散点图显示代表性TF沿拟时序轴的表达水平。（d）下调和上调TF沿各谱系拟时序轴的Venn图。
5 促皮质激素细胞的两种亚型
拟时序和重新聚类分析确定了两个亚簇：促皮质激素细胞1主要由早期阶段（7-9周）的细胞组成；促皮质激素细胞2主要由中期或晚期阶段（10-25周）的细胞组成（图5a）。TBX19和POMC在两个簇中均高表达，所有TBX19阳性细胞也表达POMC（图5b、c）。雄激素受体（AR）在两个促肾上腺皮质激素簇中均显著表达，SCENIC预测其为调节POMC的潜在TF（图1e、5b和c）。促皮质激素细胞1富集了如“有丝分裂细胞周期调控基因”，表明其可增殖。促皮质激素细胞2富集了如“对皮质酮的反应”，表明这些细胞更成熟（图5d，e）。
综上所述，该部分定义了促皮质激素细胞从早期中间状态分化为成熟状态，基因表达上调，以建立皮质醇反馈。
图5.两种促皮质激素细胞的特征。（a）不同亚型（上）和胎儿期（下）促肾上腺皮质激素的t-SNE图。（b）代表性基因（POMC、TBX19、AR和NR3 C1）表达散点图。（c）POMC和AR免疫荧光染色。（d）火山（左）和小提琴（右）图显示每个亚型中的显著差异表达基因。（e）条形图显示GO在促皮质激素细胞1和促皮质激素细胞2中富集。
6 PIT-1谱系起源于一个共同的祖细胞
PIT-1谱系由三种内分泌细胞类型组成：生长激素细胞、泌乳素细胞，促甲状腺激素细胞，所有这些细胞均由POU1F控制。拟时序分析确定了三种介导的祖细胞或前体细胞群：Pro.PIT1_all细胞作为所有三种激素生成细胞类型的共同祖细胞，Pre.Thy作为促甲状腺激素细胞的前体，Pre.Som作为生长激素细胞的潜在前体（图6a、b）。
为了探索三个不同的谱系如何与共同的祖细胞状态分离，研究了已知谱系富集基因的表达动力学（图6c），发现NEUROD4在Pro.PIT1_all中被激活，NEUROD4在生长激素前体细胞（Pre.Som）中表达水平上调；ZBTB20在Pro.PIT1_all表达水平明显上升，ZBTB20在泌乳素前体细胞中高水平表达；ASCL1和SOX4在Pro.PIT1_all中显著表达。SOX11是S0X4家族基因的成员之一，与ASCL1在促甲状腺前体细胞中（Pre.Thy）高水平表达。此外确定了三个谱系中任何两个谱系之间包括107个TF中13个TF在Pro.PIT1_all中显著上调（图6d）。通过免疫荧光验证了NKX2-2与GH的共表达（图6 g）。在泌乳素细胞和促甲状腺激素细胞的分化过程中，共有8个泌乳素细胞富集的转录因子（如SIX6）和38个促甲状腺激素细胞富集的转录因子（如GATA2、ISL1和FOXL2）分别上调（图6d，e）。甲状腺谱系分化的拟时序分析显示，SOX4和SOX11的表达在Pre.Thy中GATA2激活前达到峰值（图6f）。
综上所述，该部分结果描述了PIT-1谱系质量标准过程中的转录组动力学，其中一个共同的祖细胞在激活不同的TF网络之前共表达谱系富集的TF。
图6. PIT-1谱系的分化轨迹和TF动力学。（a）每个PIT-1亚系中分布的祖细胞的维恩图。（b）UMAP图上的PIT-1。（c）小提琴和箱内图显示了每个PIT-1谱系已知TF的基因表达动力学。（d）Venn图显示了3个PIT-1谱系中任何2个谱系之间差异表达TF的交集，以及Pro中显著上调的13个TF。（e）小提琴与内部箱图显示了每个PIT-1谱系的代表性TF。（f）促甲状腺激素细胞TF的相对表达水平。（g）NKX2-2作为生长激素特异性TF的散点图（左）表达和免疫荧光染色。
7 促性腺激素细胞表现出两种发育轨迹
拟时序分析揭示了两个发展轨迹：一个轨迹来自Pre.Gonado到促性腺激素细胞1并在促性腺激素细胞2处终止（I型轨迹），而另一个轨迹来自Pre.Gonado至促性腺激素细胞3和促性腺激素细胞4（II型轨迹，图7a、b）。对于I型轨迹，中间型促性腺激素细胞1仅处于早期阶段（8-14周），而促性腺激素细胞2由早期和晚期阶段组成；所有II型轨迹细胞均处于晚期阶段（15-25周）。这些结果表明，I型和II型轨迹分别代表早期和晚期促性腺激素细胞谱系。在所有5个集群中，促性腺激素细胞2的DEG最多，比较促性腺激素细胞2和促性腺激素细胞4分别确定了265个和30个DEG（图7c）。GO分析表明，促性腺激素细胞2 DEGs富集了“调节胞吐作用”和“C21-类固醇激素生物合成过程”，表明促性腺激素细胞2可主动分泌激素（图7c）。
总之，这些数据确定了两个促性腺激素发育轨迹，包括一个以前未被重视的LHBhighCGBhighFSHBlow亚群。
图7. 促性腺激素细胞的两种发育轨迹。（a）UMAP图（左）显示促性腺激素由两个亚谱系组成，散点图（右）显示代表性标记基因的表达模式。（b）投射到UMAP图显示了两个亚系。（c）促性腺激素细胞2和促性腺激素细胞4之间DEGs的火山图（左），条形图（右）显示每个亚型中富集的GO。（e）人胎儿垂体前叶发育示意图。
8 人和啮齿类动物垂体的种类比较
对小鼠、大鼠和人类的scRNA-seq数据进行比较显示，大多数垂体细胞类型在人类和啮齿类动物中是保守的（图8a）。垂体前叶已知标志物和新标志物（包括SOX2、POMC、GH1、PRL、TSHB、GNRHR、ALDH1A2、NR3 C1、DLK1、OLFM1、DIO2和KCNK3）显示了相似的细胞类型特异性表达模式（图8b）。在确定的基因中，CGB和GH2具有灵长类动物特异性，因此在啮齿类动物数据中不存在（图8c）。Trhr和Esr1分别在啮齿类动物促甲状腺激素细胞和泌乳素细胞中高表达，但在人胎儿垂体中低表达。此外，AR在人胎儿促皮质激素细胞中高表达，而在啮齿类动物及成人促皮质激素细胞中低表达，而在生殖细胞中高表达（图8c）。IL17RB和GAD2在人胎儿垂体中也呈特异性表达。总之，这些结果揭示了少量潜在的物种特异性基因。
图8.人和啮齿类动物垂体的比较。（a）通过整合人类和啮齿类动物垂体scRNA-seq数据集绘制垂体细胞类型的UMAP图。（b）人、小鼠和大鼠共有的代表性已鉴别标记物的小提琴图。（c）人胎儿垂体和啮齿类动物成人垂体之间代表性不同细胞类型特异性基因的小提琴图。
结论
本研究应用scRNA-seq技术阐明人胎儿垂体中的转录组异质性和动力学。描述了5个垂体激素生成细胞谱系中具有不同过渡中间状态的不同发育轨迹。将本研究scRNA-seq数据与之前的小鼠遗传学研究整合，为如何从一个共同的祖细胞中指定三种不同的细胞类型提供了见解。其次，确定了胎儿促性腺激素亚型（I型轨迹的LHBhighCGBhighFSHBlowcells）。数据表明，该亚型在受精后10周成熟，因此这些细胞的发育时间与胎儿HPG轴的激活相匹配。II型轨迹的发育发生在受精后15周后，落后于I型轨迹，还描述了人胎儿垂体干细胞的混合E/M状态。结果显示，除了SNAI1、SNAI2和ZEB1的弱表达外，大多数典型的EMT TF在干细胞中不表达，表明细胞没有发生完全的EMT。该数据还可能有助于鉴定先天性垂体功能减退症的疾病基因，并为人类多能干细胞生成的垂体前叶组织用于治疗应用和疾病建模提供参考。
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